一种花生芽期耐寒性鉴定方法与流程

本发明实施例涉及花生选育技术领域，具体涉及一种花生芽期耐寒性鉴定方法。

背景技术：

花生是全球重要的油料和经济作物。低温寒害是限制花生产业发展的重要因子之一。花生播种后常常遭遇低温寒害,特别是在花生种子吸胀后较长时间处于低温条件下，容易发生大面积烂种,出苗率明显降低，造成缺苗断垄,导致严重减产。培育和种植高产稳产耐寒性强的品种是降低遭受低温寒害的理想途径，高耐寒性种质的缺乏和耐寒性鉴定的困难及分子标记的缺乏，是限制耐寒性育种取得突破的主要原因之一，因此，解决花生种质芽期耐寒性鉴定的问题，成为花生耐寒性育种及分子标记取得突破的关键因素。

花生耐寒资源筛选最贴近生产的方法是在春季以早播试验进行，这样筛选出来的资源与生产实际相符合，但是受季节影响，每年只能在东北的春季方能开展，如果外界温度变化不稳定，试验结果也不同。因此，许多科研工作者采用室内水培方法进行耐寒资源筛选，该方法是采用人工气候箱等仪器进行，实验组一般采用2℃冷浸温度96h后，放置于25℃培养箱中暗培养，而在花生生产中，5天地温平均稳定在12-15℃时才开始播种，此方法鉴定花生耐低温种质本身不符合花生生产实际，同时传统的低温胁迫培养之前未对种子进行预筛选，有些种子表皮本身带菌或者本身活性不高，会引起种子霉变进而烂种，而并非是低温引起的霉变烂种，会误判断为不耐寒而引起的霉变腐烂。

技术实现要素：

为此，本发明实施例提供一种花生芽期耐寒性鉴定方法，以解决现有技术中花生耐寒性鉴定不符合花生生产实际以及花生种子未进行与筛选可能导致不耐寒的误判从而影响鉴别准确性的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种花生芽期耐寒性鉴定方法，包括如下步骤，

s100、器具消毒，将用报纸或耐高温塑料袋包好的培养皿和滤纸以及装载有纯净水的广口瓶放入高压灭菌锅中灭菌，待用；

s200、种子精选，选取成熟饱满、种皮完整、大小一致的花生种子若干粒，对花生种子的表皮进行杀菌，并对杀菌后的花生种子进行预处理以排除烂掉的种子；

s300、耐寒鉴定，将预处理后的花生种子均匀分成两份，并分别放入灭菌后底层覆盖两层滤纸的的2个培养皿中，倒入灭菌纯净水，其中一份标记为实验组，另一份标记为对照组，实验组先放入15℃人工气候箱暗培养72h，然后2℃低温胁迫72h，最后25℃暗培养120h，对照组放入25℃人工气候箱恒温暗培养120h；

s400、数据统计与分析，统计实验组和对照组中芽长超过种子长度的发芽种子数，分别计算低温发芽率和常温发芽率，以低温发芽率和常温发芽率的比值，即相对发芽率的大小作为耐寒性指标来鉴定花生种质耐寒性强弱。

本发明实施例的特征还在于，在步骤200中，对花生种子的表皮进行杀菌的具体步骤为：取80％多菌灵可湿性粉剂稀释100倍，然后将花生种子浸泡在稀释液中2分钟，再取灭菌后的纯净水将花生种子清洗两次。

本发明实施例的特征还在于，在步骤200中，对花生种子进行预处理的具体步骤为：将杀菌后的花生种子放入灭菌后底层覆盖两层滤纸的培养皿中，倒入灭菌纯净水后放置在常温下，待花生种子完全吸胀后，去掉烂掉的花生种子。

本发明实施例的特征还在于，在步骤400中，所述耐寒性指标为：相对发芽率大于等于90％作为高耐寒性花生种质，相对发芽率70％～90％作为耐寒性种质，相对发芽率50％～70％作为中间种质，相对发芽率30％～50％之间作为敏感种质，相对发芽率小于30％作为高感种质。

本发明实施例的特征还在于，所述培养皿包括皿底和皿壁，所述皿壁可拆卸的环绕在所述皿底的外沿且所述皿底和所述皿壁之间围绕成一个培养室，所述培养室内隔设有多个独立的培养腔，所述皿底和所述皿壁的连接处设置有用于将所述滤纸切割成型的切割刀片。

本发明实施例的特征还在于，所述皿底的外沿设置有一圈挡条，所述皿底的上表面位于所述挡条的内部纵横分布有若干条分隔条，所述皿壁的内部设置有与所述分隔条一一对应的隔板，所述切割刀片分布在所述隔板的底部以及所述皿壁的下边缘，所述挡条以及所述分隔条的上表面开设有与所述切割刀片相匹配的刀片插槽。

本发明实施例的特征还在于，所述皿壁的上方还活动盖设有皿盖，所述皿盖对应于每个培养腔的位置均设有漏水孔，所述皿盖内设置有用于将灭菌水沿所述漏水孔均匀注入的分液机构。

本发明实施例的特征还在于，所述分液机构包括无菌海绵和下压板，所述皿盖上表面设置有凹腔，所述漏水孔分布于所述凹腔的底部，所述无菌海绵置于所述凹腔内，所述下压板设置于所述无菌海绵的上方用于挤压所述无菌海绵，且所述下压板上开设有用于向所述无菌海绵注水的注水孔。

本发明实施例的特征还在于，所述滤纸置于所述皿底以及所述皿壁之间，且所述滤纸的直径大于所述皿底的底面直径。

本发明实施例具有如下优点：

(1)本发明实施例对于实验组采用先放入15℃人工气候箱暗培养72h，然后2℃低温胁迫72h，最后25℃暗培养120h的实验条件，符合花生的实际生产中，5天地温平均稳定在12-15℃时才开始播种，本发明实施例模拟大田生产实际条件，进行芽期耐寒性筛选鉴定，筛选的耐低温种质更可靠有用；

(2)本发明实施例在耐寒性鉴别试验之前对花生种子的表皮进行杀菌，并对杀菌后的花生种子进行预处理以排除烂掉的种子，从而避免由于花生本身的质量问题从而造成的花生不耐寒的误判，提高花生种子耐寒性鉴别的结果准确性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1为本发明实施例提供的花生芽期耐寒性鉴定的方法流程图；

图2为本发明实施例提供的培养皿的整体结构示意图；

图3为图2所示培养皿中皿壁的结构示意图；

图4为图2所示培养皿中皿底的结构示意图。

图中：

10-皿底；20-皿壁；30-培养室；40-切割刀片；50-刀片插槽；60-皿盖；

11-挡条；12-隔条；

21-隔板；

31-培养腔；

61-漏水孔；62-无菌海绵；63-下压板；64-凹腔；65-注水孔。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，本发明提供了一种花生芽期耐寒性鉴定方法，包括如下步骤，

s100、器具消毒；

将用报纸或耐高温塑料袋包好的培养皿和滤纸以及装载有纯净水的广口瓶放入高压灭菌锅中灭菌，待用；

s200、种子精选；

选取成熟饱满、种皮完整、大小一致的花生种子若干粒，对花生种子的表皮进行杀菌，并对杀菌后的花生种子进行预处理以排除烂掉的种子；

在该步骤中，对花生种子的表皮杀菌是因为部分花生种子表皮本身带菌，会引起种子霉变进而烂种，而并非是低温引起的霉变烂种，会误判断为不耐寒而引起的霉变腐烂。

对花生种子的表皮进行杀菌的具体步骤为：取80％多菌灵可湿性粉剂稀释100倍，然后将花生种子浸泡在稀释液中2分钟，再取灭菌后的纯净水将花生种子清洗两次，可避免由其它因素引起的霉变烂种。

而对花生种子进行预处理的具体步骤为：将杀菌后的花生种子放入灭菌后底层覆盖两层滤纸的培养皿中，倒入灭菌纯净水后放置在常温下，待花生种子完全吸胀后，去掉烂掉的花生种子，从而排除活性不高的种子所引起的不耐寒性误判。

s300、耐寒鉴定，将预处理后的花生种子均匀分成两份，并分别放入灭菌后底层覆盖两层滤纸的的2个培养皿中，倒入灭菌纯净水，其中一份标记为实验组，另一份标记为对照组，实验组先放入15℃人工气候箱暗培养72h，然后2℃低温胁迫72h，最后25℃暗培养120h，对照组放入25℃人工气候箱恒温暗培养120h；

本发明实施例对于实验组的处理在低温胁迫培养之前先放入15℃人工气候箱暗培养72h，符合花生的实际生产中，5天地温平均稳定在12-15℃时才开始播种，模拟大田生产实际条件，进行芽期耐寒性筛选鉴定，筛选的耐低温种质更可靠有用

s400、数据统计与分析，统计实验组和对照组中芽长超过种子长度的发芽种子数，分别计算低温发芽率和常温发芽率，以低温发芽率和常温发芽率的比值，即相对发芽率的大小作为耐寒性指标来鉴定花生种质耐寒性强弱。

本发明实施例结合对照组，用相对发芽率作为种质耐寒性的判断标准，简便快速，且具有实际意义，具体的耐寒性指标为：相对发芽率大于等于90％作为高耐寒性花生种质，相对发芽率70％～90％作为耐寒性种质，相对发芽率50％～70％作为中间种质，相对发芽率30％～50％之间作为敏感种质，相对发芽率小于30％作为高感种质。

在本发明实施例中，培养皿的主要作用是作为花生种子培养的容器，步骤200的作用是排除花生种子本身的质量对于鉴定结果的影响，但是一旦种子中的霉菌未在杀菌环节彻底消灭，由于一个培养皿中放置有多个培养种子，种子的霉菌易交叉感染从而对整个实验结果产生较大的影响，为减少该影响力，本发明实施例对培养皿进行了隔离培养设计，使单个种子局限在单独的空间内，液体不发生互相交换，具体地：

如图2至图4所示，培养皿包括皿底10和皿壁20，皿壁20可拆卸的环绕在皿底10的外沿且皿底10和皿壁20之间围绕成一个培养室30，培养室30内隔设有多个独立的培养腔31，由于滤纸的渗透作用，若用一张滤纸覆盖于各个培养腔31的底部会造成培养液体的交换，因此，滤纸也需要切割成独立的小片，手动单独切割较为繁琐，优选在皿底10和皿壁20的连接处设置有用于将滤纸切割成型的切割刀片40。

进一步地，皿底10的外沿设置有一圈挡条11，皿底10的上表面位于挡条11的内部纵横分布有若干条分隔条12，皿壁20的的内部设置有与分隔条12一一对应的隔板21，切割刀片40分布在隔板21的底部以及皿壁20的下边缘，挡条11以及分隔条12的上表面开设有与切割刀片40相匹配的刀片插槽50。

上述培养皿在灭菌后的装配过程为：首先将滤纸置于皿底10以及皿壁20之间，此处滤纸的直径大于皿底10的底面直径，将皿壁20底部的切割刀片40对准皿底10的刀片插槽50，通过切割刀片40的切割作用，一次性可将滤纸切割成与培养腔31相比配的若干块，同时，切割刀片40和刀片插槽50的匹配嵌合也完成了皿壁20和皿底10的装配，分隔条12和隔板21的共同作用使培养室30被分割为多个独立的培养腔31。

当滤纸一一对应的置于培养腔31内后需要向每个培养腔31内添加一定量的灭菌水使滤纸浸透，但由于培养腔31的数量较多，依次添加耗费时间较长且无法保证每个培养腔31内的水位一致，本发明实施例在皿壁20的上方还活动盖设有皿盖60，皿盖60对应于每个培养腔31的位置均设有漏水孔61，皿盖60内设置有用于将灭菌水沿漏水孔61均匀注入的分液机构。

进一步地，分液机构包括无菌海绵62和下压板63，皿盖60上表面设置有凹腔64，漏水孔61分布于凹腔64的底部，无菌海绵62置于凹腔64内，下压板63设置于无菌海绵62的上方用于挤压无菌海绵62，且下压板63上开设有用于向无菌海绵62注水的注水孔65。

分液机构用于向培养腔31浇水时，首先将灭菌水沿注水孔65注入无菌海绵62中使无菌海绵62湿透，按压下压板63带动无菌海绵62发生形变释放出无菌海绵62内储存的水分，释放的水分沿各个漏水孔61进入每一个对应的培养腔31内，一次按压即可完成所有培养腔31的浇注，且浇水量均匀一致，保证了各个花生种子的实验条件一致性。

另外，为保证结果的准确性，本发明实施例中对照组和实验组均可以设计多个平行样，例如将每个处理均设置三次重复，以保证实验结果的重复性与可再现性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。