一种辣椒或茄子单倍体植株的染色体加倍方法与流程

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种辣椒或茄子单倍体植株的染色体加倍方法。

背景技术：

单倍体育种是植物育种手段之一，可利用花药培养诱导产生单倍体植株，再通过人工手段如秋水仙碱处理，使染色体组加倍，从而使植物恢复正常染色体数目，成为可育的纯合二倍体(dh)，直接应用于育种，缩短周期，极大地加速育种进程。

dh群体的建立是单倍体育种关键技术，包括单倍体的诱导和染色体加倍。目前主要利用植物组织培养技术，通过雄核发育途径如进行花药或小孢子培养以及通过雌核发育途径如培养未授粉子房和胚珠获得单倍体植株。虽然单倍体植株本身会出现自然加倍现象，成为纯合二倍体植株，但由于基因型不同，自然加倍率0～40％不等，对于大规模dh植株的应用需求，染色体人工加倍十分必要。

自从1971年kaul和zutshi用秋水仙碱处理养麦、大麦和黑麦单倍体，并成功获得纯合二倍体以来，单倍体加倍技术在其他科属中也得到了广泛的研究。目前，在农业育种中，最常用的染色体加倍方法就是秋水仙碱加倍法。秋水仙碱是从百合科秋水仙的球茎和种子中提取的一种卓酚酮类生物碱，对种子、幼芽、花蕾、花粉、嫩枝都可产生诱变作用。秋水仙碱可以抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使染色体不走向两极，而被阻止在分裂中期，致使细胞不能继续分裂，从而产生染色体加倍的核。秋水仙碱单倍体加倍技术应用较成熟的植物种类主要有小麦、大麦、玉米、烟草、甜菜、水稻、梨、油菜等。

茄果类蔬菜辣椒、茄子作为我国重要的果菜类蔬菜，在遗传育种、细胞学等方面是很重要的研究对象。利用辣椒、茄子花药培养技术，可以在短时间内产生大量单倍体，再通过人工加倍获得纯系，大大提高了育种的选择效率，缩短了育种年限。目前辣椒、茄子单倍体染色体加倍主要采用脱脂棉包埋单倍体植株的生长点并滴加处理液的方法(一棵植株上会有多个生长点，都需要包裹)，用0.2％～0.4％秋水仙碱溶液滴在脱脂棉上，由于溶液易挥发，每过4h～8h需滴加一次溶液，以保持脱脂棉湿润。该方法费时费力，而且一次加倍成功率低，辣椒和茄子的一次加倍成功率一般为0～30％。

技术实现要素：

本发明的目的在于公开了一种辣椒或茄子单倍体植株的染色体加倍方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种辣椒或茄子单倍体植株的染色体加倍方法，包括：

(1)250ml或500ml无菌培养瓶中加入10ml～20ml无菌加倍处理液，所述加倍处理液由0.1％～0.4％秋水仙碱溶液和体积百分数为1％～4％的dmso组成；

(2)选取株高为3cm～5cm的辣椒或茄子花药培养再生植株，保留根系或切去根系，置于无菌培养瓶中，准备诱导；

(3)将无菌培养瓶横放，固定在滚动摇床上，以20rpm～30rpm的速度使加倍处理液充分、不间断地浸润植株，进行震荡浸苗处理24h～48h，诱导培养条件为温度22℃～28℃，湿度40％～60％，光照时间12h～16h，光照强度1000lx～2000lx；

(4)步骤(3)加倍处理24h～48h后，取出花药培养再生植株，用无菌水冲洗3～5次，转接至ms基本培养基中进行光照培养，培养一个月后即得二倍体植株；光照培养条件为温度22℃～28℃，湿度40％～60％，光照时间12h～16h，光照强度2000lx～4000lx。

上述技术方案所述辣椒或茄子单倍体植株的染色体加倍方法，其中，步骤(2)中辣椒或茄子花药培养再生植株是通过以下步骤获得：

(a)取辣椒或茄子花粉发育时期为单核靠边期的辣椒、茄子花蕾，在无菌条件下经10％的次氯酸钠表面消毒10min～20min，无菌水冲洗3次；

(b)将花药剥离出来，接种于诱导培养基中得到胚状体，将胚状体转接至不附加任何生长调节剂的ms基本培养基中长成小植株；再将小植株转接至生根壮苗培养基，最终得到花培再生植株；

辣椒花粉胚状体的诱导培养基为ms培养基中加入0.1mg/l～1mg/lba、0.1mg/l～1mg/liaa和0.01mg/l～0.1mg/lnaa；

茄子花粉胚状体的诱导培养基为ms培养基中加入0.05mg/l～2mg/lkt、0.1mg/l～1mg/liaa、0.01mg/l～0.1mg/lnaa和0.1％～0.3％活性炭；

所述生根壮苗培养基为ms基本培养基加入iba1mg/l。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明与传统的用脱脂棉包裹植株生长点的方法相比，加倍效率较高，可达60％～100％。本发明的方法直接将再生植株放入培养瓶中，瓶内加入10ml～20ml秋水仙素溶液，一瓶内可放10～50棵不等，在滚动摇床上加倍处理，这样能保证所有的芽点均可处理到；而传统的使用脱脂棉包裹法，当植株生长点较多时，不可能全部进行包裹处理，过于费时费力，当叶芽太小时，不易包裹。

2、本发明的方法可确保在处理期间，植株的生长点始终保有处理液，但处理液用量较少，成本减少(秋水仙素有毒且价高)。

附图说明：

1、图1为辣椒再生植株dna含量分布图。

2、图2为茄子再生植株dna含量分布图。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明一种辣椒或茄子单倍体植株的染色体加倍方法作进一步的说明。

实施例1：辣椒单倍体植株染色体加倍方法：

从种植大棚取回花粉发育时期为单核靠边期的辣椒花蕾，在无菌条件下经10％次氯酸钠表面消毒20min，无菌水冲洗3次。将花药剥离出来，接种于诱导培养基(ms基本培养基加入0.1mg/lba、0.1mg/liaa、0.01mg/lnaa)中得到胚状体，将胚状体转接至不附加任何生长调节剂的ms基本培养基中长成小植株；再将小植株转接至生根壮苗培养基(ms基本培养基附加iba1mg/l)，最终得到辣椒花粉再生植株；

选取株高3cm～5cm，含3～4叶的辣椒花粉再生植株30株(经流式细胞仪测定为单倍体植株)，去掉大叶片，保留根系，置于500ml无菌培养瓶中，瓶中加入由0.2％的秋水仙碱和2％dmso组成的无菌溶液15ml；

将无菌培养瓶横放，固定在滚动摇床上，以25rpm的速度让处理液充分、不间断地对植株进行震荡浸润处理，即避免了长时间静止浸泡带来的药物伤害，也节省了成本；

培养条件为温度22℃～25℃，湿度40～60％，光照时间12h，光照强度1000lx～2000lx；

加倍处理48h后，取出花培再生植株，用无菌水冲洗3～5次，转接至ms基本培养基进行光照培养；培养条件为温度22℃～28℃，湿度40％～60％，光照时间12h，光照强度2000lx～4000lx；

培养一个月后，采用流式细胞仪partecspace和partec分析软件对实施例1中得到的新长出的植株叶片dna含量进行测定。以辣椒杂交种二倍体dna含量作为对照，根据不同强度的分离峰，确定再生植株为单倍体或二倍体。相对荧光强度值400时为二倍体植株，相对荧光强度值200时，花培再生植株细胞中dna含量较二倍体对照植株减少一半，为单倍体植株(如图1所示，图1为辣椒植株dna含量分布图，其中左图为单倍体植株，右图为二倍体植株)。经检测，在30株经加倍处理的辣椒单倍体植株中有27株已加倍成为二倍体植株，加倍成功率为90.0％。

实施例2：茄子单倍体植株染色体加倍方法：

从种植大棚取回花粉发育时期为单核靠边期的茄子花蕾，在无菌条件下经10％次氯酸钠表面消毒10min，无菌水冲洗3次。将花药剥离出来，接种于诱导培养基(ms基本培养基加入0.1mg/l～1mg/lkt、0.1mg/l～1mg/liaa、0.01mg/l～0.05mg/lnaa、0.1％～0.3％活性炭)中得到胚状体，将胚状体转接至不附加任何生长调节剂的ms0培养基，长成小植株；再将小植株转接至生根壮苗培养基(ms基本培养基附加iba1mg/l)，最终得到茄子花粉再生植株；

选取株高3cm～5cm，含3～4叶的茄子花培再生植株40株(经流式细胞仪测定为单倍体植株)，去掉大叶片和根，置于500ml无菌培养瓶中，瓶中加入由0.4％的秋水仙碱和2％dmso组成的无菌溶液15ml；

将无菌培养瓶横放，固定在摇床上，以25rpm的速度让处理液充分、不间断地对植株进行震荡浸润处理，即避免了长时间静止浸泡带来的药物伤害，也节省了成本；

培养条件为温度22℃～25℃，湿度40％～60％，光照时间12h，光照强度1000lx～2000lx；

加倍处理48h后，取出花培再生植株，用无菌水冲洗3～5次，转接至ms基本培养基进行光照培养；培养条件为温度22℃～28℃，湿度40％～60％，光照时间12h，光照强度2000lx～4000lx；

培养一个月后，采用流式细胞仪partecspace和partec分析软件对实施例2中得到的新长出的植株叶片进行dna含量测定。以茄子杂交种二倍体dna含量作为对照，根据不同强度的分离峰，确定再生植株为单倍体或二倍体。相对荧光强度值200时为二倍体植株，相对荧光强度值100时，花培再生植株细胞中dna含量较二倍体对照植株减少一半，为单倍体植株(如图2所示，图2为茄子植株dna含量分布图，其中左图为单倍体植株；右图为二倍体植株)。经检测，40株经加倍处理的茄子单倍体植株中有25株已加倍成为二倍体植株，加倍成功率为62.5％。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。