一种用于再生虎克姜花植株的系列培养试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种用于再生虎克姜花植株的系列培养试剂盒及其应用，属于植物组织培养领域。

背景技术：

与同属其他植物相比，虎克姜花植株矮小、叶片宽大、花色鹅黄、假种皮黑色，具有重要的研究和开发利用价值。植物的愈伤组织再生体系是对该植物进行进一步遗传操作和育种改良的基础技术平台。目前，在姜花属中，建立了愈伤组织再生体系的种类包括白姜花和红姜花。这两个种属于根茎粗大、侧根细、分布于中低海拔的类型，而虎克姜花为根茎小、侧根肥厚、分布于高海拔，种类差异较大。在外植体的选择上，目前主要选用叶片、花丝以及花药为外植体，污染率高、无菌处理效率低，愈伤组织诱导速度慢(需60～90天)，需添加复杂的培养物(维生素b5、谷氨酰胺、脯氨酸、麦芽提取物等)，步骤繁琐(需采用液体震荡培养等)，再生效率低，愈伤组织再生为植株的培养体系有待优化。

植物种子萌发出的幼苗，其下胚轴是活跃的生长点，已有较多植物以下胚轴为外植体诱导出愈伤组织并再生出植株。但在这些技术方案中，在不同植物之间所选用的植物生长调节剂种类及其浓度配比具有很大差异。本发明基于虎克姜花的遗传特点，以种子萌发无菌苗的下胚轴为外植体，经过对愈伤组织诱导和再分化条件进行的系统试验研究，构建了简单而高效的愈伤组织再生为植株的培养体系。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种污染率低、诱导率高、诱导速度快、操作简便的经由愈伤组织途径制备的再生虎克姜花植株的系列培养试剂盒及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种用于再生虎克姜花植株的系列培养试剂盒，包括种子萌发培养基、愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖培养基和愈伤组织再分化培养基；其中所述种子萌发培养基包括ms培养基、蔗糖和琼脂；所述愈伤组织诱导培养基包括ms培养基、激动素、2,4-二氯苯氧乙酸、蔗糖和琼脂；所述愈伤组织增殖培养基包括ms培养基、激动素、2,4-二氯苯氧乙酸、蔗糖和琼脂；所述愈伤组织再分化培养基包括ms培养基、6-苄氨基嘌呤、吲哚-3-乙酸、蔗糖和琼脂。

所述愈伤组织诱导培养基和所述愈伤组织增殖培养基的成分相同，但成分中激动素和2,4-二氯苯氧乙酸的使用浓度不同。本发明所述培养试剂盒，制备方法简单，不需添加复杂的培养物便能诱导愈伤组织分化完成，无需在固体和液体培养之间来回转换。

优选地，所述种子萌发培养基中，蔗糖的浓度为28～30g/l，琼脂的浓度为7.0～8.0g/l。

优选地，所述愈伤组织诱导培养基中，激动素的浓度为0.1～0.5mg/l，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.5～1.0mg/l，蔗糖的浓度为28～30g/l，琼脂的浓度为7.0～8.0g/l。

下胚轴在不含任何激素的诱导培养基里不能诱导出愈伤组织，在愈伤组织诱导培养基的诱导下，可长出生长快，松散性好的愈伤组织。

优选地，所述愈伤组织增殖培养基中，激动素的浓度为0.1～0.2mg/l，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.3～0.5mg/l，蔗糖的浓度为28～30g/l，琼脂的浓度为7.0～8.0g/l。

愈伤组织增殖培养基可以使愈伤组织快速增殖，得到初始接种量60倍以上的愈伤组织。

优选地，所述愈伤组织再分化培养基中，6-苄氨基嘌呤的浓度为1.0～2.0mg/l，吲哚-3-乙酸的浓度为0.1～2.0mg/l，蔗糖的浓度为28～30g/l，琼脂的浓度为7.0～8.0g/l。

经愈伤组织再分化培养基培养后，愈伤组织块转化为无菌苗丛，可直接炼苗移栽。

第二方面，本发明提供了上述培养基在建立再生虎克姜花植株的中的应用。

本发明提供了上述再生虎克姜花植株的制备方法，包括以下步骤：

(1)选取饱满、无损伤、未开裂的果实作为外植体；

(2)在无菌条件下，对选取的果实进行消毒，无菌水冲洗后用无菌操作接种种子到种子萌发培养基，得到无菌苗；

(3)当步骤(2)获得的无菌苗龄为7天以上时，将无菌苗的下胚轴切为0.3～0.5cm长的1～2段，接种到愈伤组织诱导培养基，培养30天以上，得到愈伤组织；

(4)将步骤(3)得到的愈伤组织分成块接种到愈伤组织增殖培养基上，以月为培养周期，继代3次，得到初始接种量60倍以上的愈伤组织；

(5)将步骤(4)得到的愈伤组织切块接种到愈伤组织再分化培养基上，培养得到无菌苗；

以下胚轴为外植体得到的愈伤组织再生效率高，不需壮苗和生根步骤，一步成苗。

(6)将步骤(5)得到的无菌苗放置在有散射光的地方炼苗3～4天，清洗后移栽到珍珠岩和泥炭土等比混合基质中，观察成活率。

以下胚轴为外植体污染率低，无菌效率高。由于种子来源于胚珠，从发育之初从未与外界接触，天然无菌，因而果实消毒后可直接接种，污染率为零，消毒操作步骤也更简便，同时愈伤组织诱导率高、诱导速度更快。

优选地，所述步骤(2)的培养条件为黑暗培养，温度为24～26℃。

优选地，所述步骤(3)～(6)的培养条件为温度24～26℃、光照12h/d、光照强度2500lx。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.外植体污染率低、无菌效率高。由于消毒时种子有果壳保护，使用了比普通消毒处理更长的时间，消毒彻底。而种子来源于胚珠，从发育之初从未与外界接触，天然无菌，因而果实消毒后可直接接种，污染率为零，消毒操作步骤也简化了。

2.愈伤组织诱导率高、诱导速度更快。下胚轴接种后30天时诱导率为100％，而叶片、花丝和花药愈伤组织的诱导需要60～90天、诱导率为70％。本发明诱导出的愈伤组织为淡黄色、疏松、分裂旺盛的高质量愈伤组织；而由叶片、花丝和花药诱导出的愈伤组织常常需要经历2～3代的继代培养，才能筛选到均匀的、分裂旺盛的愈伤组织。

3.愈伤组织的诱导及植株再分化不需要额外添加繁复的培养物，操作步骤简单，无需在固体和液体培养之间来回转换。

4.再生效率高，不需壮苗和生根步骤，一步成苗。将愈伤组织切为8mm大小的愈伤组织块转接至分化培养基，培养120天后，愈伤组织块转化为无菌苗丛，可分化出10～15株带3～4片叶且已生根的植株，可直接炼苗移栽。

附图说明

图1为本发明诱导出的愈伤组织经愈伤组织增殖培养基培养30天后的实物图。

图2为本发明诱导出的愈伤组织经6-苄氨基嘌呤为2.0mg/l，吲哚-3-乙酸为1.0mg/l的愈伤组织再分化培养基培养120天后植株的再生情况实物图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

目前，姜花属植物的愈伤组织再生体系主要以叶片、花丝、花丝为外植体、无菌处理效率低，在愈伤组织诱导阶段培养基的添加物繁复、操作步骤冗长，愈伤组织再生为植株的效率低。为了克服此缺陷，本发明公开了一种以下胚轴为外植体、简单而高效的诱导虎克姜花愈伤组织发生及再生为植株的方法。

实施例1

本发明用于再生虎克姜花植株的系列培养试剂盒及其应用的一种实施例，本实施例用于再生虎克姜花植株的系列培养试剂盒，包括种子萌发培养基、愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖培养基和愈伤组织再分化培养基。

所述种子萌发培养基中，蔗糖的浓度为28g/l，琼脂的浓度为7g/l；所述愈伤组织诱导培养基中，激动素的浓度为0.1mg/l，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.5mg/l，蔗糖的浓度为28g/l，琼脂的浓度为7g/l；所述愈伤组织增殖培养基中，激动素的浓度为0.1mg/l，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.3mg/l，蔗糖的浓度为28g/l，琼脂的浓度为7g/l；所述愈伤组织再分化培养基中，6-苄氨基嘌呤的浓度为1.0mg/l，吲哚-3-乙酸的浓度为0.1mg/l，蔗糖的浓度为28g/l，琼脂的浓度为7.0g/l。

本实施例所述再生虎克姜花植株的制备方法，包括以下步骤：

(1)挑选饱满、无损伤、未开裂的果实做为外植体；

(2)在无菌条件下，于超净工作台上用75％酒精溶液对未开裂的果实浸泡消毒1～2分钟，再用0.1％升汞溶液浸泡15～20分钟，无菌水冲洗6次。用消毒好的镊子和刀片剖去果实外壳，把种子接种到种子萌发培养基；

(3)当步骤(2)获得的无菌苗龄为7天时，将无菌苗的下胚轴切为0.3～0.5cm长的1～2段，接种到愈伤组织诱导培养基，培养30天；

(4)将步骤(3)得到的愈伤组织分成5mm大小的愈伤组织块接种到愈伤组织增殖培养基上，以30天为培养周期，继代3次，愈伤组织快速增殖，获得初始接种量60倍的愈伤组织；

(5)将步骤(4)得到的愈伤组织切为8mm大小的愈伤组织块接种到愈伤组织再分化培养基上，培养120天，获得带3～4片叶、带根的完整无菌苗；

(6)将步骤(5)得到的无菌苗放置在有散射光的地方炼苗3～4天，然后将瓶苗瓶盖打开，小心取出瓶苗，洗净附着在根上的培养基，移栽到用l％高锰酸钾溶液消毒过的珍珠岩和泥炭土(1：1)的混合基质中，淋足定根水，每天喷清水薄雾保湿，每周喷一次稀释5倍的ms大量元素的营养液，一个月后观察成活率。

实施例2

本发明用于再生虎克姜花植株的系列培养试剂盒及其应用的一种实施例，本实施例用于再生虎克姜花植株的系列培养试剂盒，包括种子萌发培养基、愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖培养基和愈伤组织再分化培养基。

所述种子萌发培养基中，蔗糖的浓度为29g/l，琼脂的浓度为7.5g/l；所述愈伤组织诱导培养基中，激动素的浓度为0.3mg/l，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.8mg/l，蔗糖的浓度为29g/l，琼脂的浓度为7.5g/l；所述愈伤组织增殖培养基中，激动素的浓度为0.15mg/l，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.4mg/l，蔗糖的浓度为29g/l，琼脂的浓度为7.5g/l；所述愈伤组织再分化培养基中，6-苄氨基嘌呤的浓度为1.5mg/l，吲哚-3-乙酸的浓度为1.0mg/l，蔗糖的浓度为29g/l，琼脂的浓度为7.5g/l。

本实施例所述再生虎克姜花植株的制备方法同实施例1。

实施例3

本发明用于再生虎克姜花植株的系列培养试剂盒及其应用的一种实施例，本实施例用于再生虎克姜花植株的系列培养试剂盒，包括种子萌发培养基、愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖培养基和愈伤组织再分化培养基。

所述种子萌发培养基中，蔗糖的浓度为30g/l，琼脂的浓度为8g/l；所述愈伤组织诱导培养基中，激动素的浓度为0.5mg/l，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为1.0mg/l，蔗糖的浓度为30g/l，琼脂的浓度为8g/l；所述愈伤组织增殖培养基中，激动素的浓度为0.2mg/l，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.5mg/l，蔗糖的浓度为30g/l，琼脂的浓度为8g/l；所述愈伤组织再分化培养基中，6-苄氨基嘌呤的浓度为2.0mg/l，吲哚-3-乙酸的浓度为2.0mg/l，蔗糖的浓度为30g/l，琼脂的浓度为8.0g/l。

本实施例所述再生虎克姜花植株的制备方法同实施例1。

对比例1

本发明用于再生虎克姜花植株的系列培养试剂盒及其应用的一种对比例，本对比例所述不同外植体无菌处理效率的比较：

(1)本发明外植体无菌处理：挑选饱满、无损伤、未开裂的果实，在无菌条件下，依次用酒精、0.1％升汞溶液浸泡消毒，无菌水冲洗后用无菌操作接种种子到种子萌发培养基，接种90粒。

(2)对照试验：以叶片、种子、嫩茎为外植体。依次用酒精、0.1％升汞溶液浸泡消毒，无菌水冲洗。每个处理接种90个外植体(表1)。

表1：不同外植体无菌处理效率比较

结果分析：0.1％升汞溶液消毒处理15～20分钟，未开裂的果实无菌率达到100％，随着升汞溶液处理时间增加，叶片、嫩茎和种子的无菌率虽有上升，但仍不能达到满意的无菌率。与此同时，叶片、嫩茎和种子的死亡率在不断增加，即使再延长0.1％升汞溶液处理时间也无法获得较高的无菌率。

以种子为外植体，在培养至3～4周时会从萌发孔长出霉菌，导致污染，原因是藏于种子内部的微生物难以被杀灭。以叶片为外植体不仅污染重，褐化也严重。以嫩茎为外植体，因其质地含水量高且暴露于土壤和空气中，污染较难去除，故污染率也高。以开裂的果实为外植体进行消毒，由于消毒时未开裂果实时有果壳保护，长时间消毒果实不会把里面种子消毒致死，且因种子发育于胚珠，从发育之初从未与外界接触，天然无菌，污染率为零，无菌处理效率非常高。

对比例2

本发明用于再生虎克姜花植株的系列培养试剂盒及其应用的一种对比例，本对比例所述不同浓度的激动素、2,4-二氯苯氧乙酸对虎克姜花下胚轴愈伤组织诱导的影响方法为：

以未开裂的果实进行消毒处理，再无菌条件下取果实内的无菌种子接种于种子萌发培养基，待种子萌发后取下胚轴为外植体诱导愈伤组织并进行增殖，步骤如下：

(1)果实的消毒：挑选饱满、无损伤、未开裂的果实，在无菌条件下，依次用酒精、0.1％升汞溶液浸泡消毒，无菌水冲洗后用无菌操作接种种子到种子萌发培养基，接种90粒。

(2)诱导愈伤组织处理：当无菌苗龄为7天时，将无菌苗的下胚轴切为0.3～0.5cm长的1～2段，接种到愈伤组织诱导培养基，接种30瓶，黑暗培养30天，结果如表2所示。

表2不同浓度的激动素、2,4-二氯苯氧乙酸对虎克姜花下胚轴愈伤组织诱导的影响

注：+，愈伤组织含水量大、致密，生长缓慢；++，愈伤组织生长速度中等、松散性较好；+++，愈伤组织生长快、松散性好；-，没有愈伤组织产生。

结果分析：当下胚轴在不含任何激素的诱导培养基里不能诱导出愈伤组织，从结果可知激动素、2,4-二氯苯氧乙酸的范围分别在0.1～0.5mg/l和0.5～1.0mg/l时下胚轴都能诱导出愈伤组织，当激动素为0.5mg/l，2,4-二氯苯氧乙酸为1.0mg/l时愈伤组织诱导率可达100％，愈伤组织生长情况是最好的，愈伤组织生长快，松散性好。

(3)愈伤组织的增殖：把得到的愈伤组织切成5mm大的愈伤组织块接种到愈伤组织增殖培养基上，以30天为培养周期，请参阅图1，继代3次，愈伤组织增殖60倍。

对比例3

本发明用于再生虎克姜花植株的系列培养试剂盒及其应用的一种对比例，本对比例所述6-苄氨基嘌呤和吲哚-3-乙酸对虎克姜花愈伤组织再分化的影响方法为：

(1)愈伤组织的再分化：把愈伤组织切成8mm×8mm大的愈伤组织块接种到愈伤组织再分化培养基上，1瓶接种5个组织块，接种30瓶。结果如表3所示

表3：6-苄氨基嘌呤(ba)和吲哚-3-乙酸(iaa)对虎克姜花愈伤组织再分化的影响

注：培养时间120天

结果分析：培养于6-苄氨基嘌呤2.0mg/l，吲哚-3-乙酸1.0mg/l时愈伤组织的再分化效果最好，120天后一块愈伤组织分化出15株带根苗，请参阅图2。结随着吲哚-3-乙酸浓度的增加，出苗数上升，但吲哚-3-乙酸超过1.0mg/l时出苗数下降。原因是较高的吲哚-3-乙酸趋向于诱导植株基部膨大，植株高度降低，根的数量减少。

(2)苗的移栽培养：将在愈伤组织再分化培养基培养了120天的瓶苗放置在有散射光的地方炼苗3～4天，然后洗净附着在根上的培养基，把苗丛分株移栽到用1％高锰酸钾溶液消毒过的珍珠岩和泥炭土等比例的混合基质中，淋足定根水，每天喷清水薄雾保湿，每周喷一次稀释5倍的ms大量元素的营养液，一个月后观察成活率，成活率达90％。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。