芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间远缘杂种创制方法与流程

本发明涉及植物育种领域，具体地说，涉及芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间远缘杂种创制方法。

背景技术：

芙蓉菊(crossostephiumchinense)，菊科芙蓉菊属单属单种，为我国特有，产于东南沿海地区。常绿亚灌木。叶常狭倒披针形，常全缘，两面密被灰色柔毛，质地厚；花径约0.5cm，淡黄色，无舌状花，花期11月下旬到翌年1月。芙蓉菊是少有的天然异色叶和芳香植物，又有耐盐碱、抗风及病虫害少等特性，所以广泛应用于园林。杨海燕(2016年)以8份广义菊属野生种为实验材料，对盐胁迫下生理指标的综合分析，证明芙蓉菊是一种优异的耐盐种质；林双冀(2017年)对盐胁迫下芙蓉菊和其它4种菊属植物的解剖结构及生理指标变化研究后，表明芙蓉菊具有独特的耐盐机理。国内关于芙蓉菊的研究主要集中在药用功能及耐盐机理方面，有关育种的研究甚少。

阔叶毛华菊(chrysanthemumvestitumvar.latifolium)，菊科菊属植物。散铺生长，具较少分枝。叶圆形、卵圆形，附厚绒毛，花序直径较大，约4.5-5.0cm。花白色，10月下旬开花，具有较好观赏性。钟剑等(2018年)对盐胁迫下阔叶毛华菊的形态及生理指标综合评价后发现其表现出中等耐盐性。

菊花生产在我国呈区域化发展，沿海和北方地区的盐碱地限制了菊花的栽培推广。利用耐盐野生种质(如芙蓉菊)进行远缘杂交从而培育具有较强耐盐性的菊花品种是菊花育种的一个重要方向。胚拯救作为克服远缘杂交障碍的重要手段在菊属植物间已有所应用，但由于芙蓉菊无舌状花、未成熟胚小且难以剥离，相关技术在芙蓉菊属中的应用并不多。利用胚拯救技术获得的芙蓉菊和阔叶毛华菊的杂种后代，一方面继承了芙蓉菊的耐盐性状，可作为遗传材料用于细胞学和分子学研究，另一方面作为桥梁可以显著提高芙蓉菊属和菊属的杂交亲和性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间远缘杂种创制方法。

为了实现本发明目的，本发明提供了一种芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间远缘杂种创制方法，其是以芙蓉菊属芙蓉菊与菊属阔叶毛华菊为亲本进行杂交，利用幼胚拯救技术获得远缘杂种。

先前研究发现，芙蓉菊作为父本与阔叶毛华菊杂交时，其结实率为零。因此，本发明是以二倍体芙蓉菊为母本，六倍体阔叶毛华菊为父本进行杂交并通过胚拯救来创制远缘杂种。

所述方法具体包括：

1)亲本准备：对两亲本植株进行花期调控，使花期相遇；

2)远缘杂交：当父母本均开花时，母本去雄，取父本新鲜花粉进行授粉并套袋；

3)胚珠剥取：取杂交授粉后8-24天(优选授粉后18天)的头状花序(隔一天取一次)，消毒灭菌后取出胚珠；

4)幼胚离体培养：将胚珠接种到不同激素配比的诱导培养基中进行培养，然后转入生根培养基中培养至出苗；

5)杂种f1代的获得：待幼苗根长至1cm以上时，移植到基质中进行炼苗，之后上盆常规管理；

6)真杂种的筛选：根据对亲本及杂种f1代的表型观察及细胞学鉴定，从f1代植株中筛选出真杂种。

前述的方法，步骤1)包括：从8月份开始对母本芙蓉菊进行8-10小时的短日照养护，使其10月中旬达到盛花期。具体地，短日照养护条件为：湿度70-75％，白天温度24-28℃，晚上20-22℃，每天光照8-10小时，光照强度1600-2000lx。

前述的方法，步骤3)包括：取杂交授粉后的头状花序，对其进行消毒灭菌，去掉子房壁，取出胚珠。

优选地，消毒灭菌的方法包括：用70％-75％的酒精对头状花序表面消毒30-45秒，无菌水冲洗后，再用8％-13％的h2o2水溶液灭菌10-15分钟，然后无菌水冲洗。

前述的方法，步骤4)中所述诱导培养基含有6-ba和naa；所述生根培养基含有naa。

不同杂交组合胚培养，对培养基的要求不尽相同。在其它菊花近缘属植物杂交中，有文献报道使用ms+2.0mg/lkt+1.0mg/liaa培养基可获得栽培菊花‘钟山金桂’和黄金艾蒿的杂交后代(陈发棣，2011)；也有文献报道使用ms+0.2mg/liaa培养基可得到木茼蒿和蒿子秆的杂交后代，但发芽率仅为12.9％(hisaoohtsuka，2008)。通过使用含6-ba和naa的ms培养基进行芙蓉菊属间杂交后代胚培养进而获得愈伤组织及杂种幼苗的相关研究鲜见报道。

所述诱导培养基为含有1.0-2.0mg/l6-ba和0.2-1.0mg/lnaa，ph5.6-5.8的ms培养基。

优选地，所述诱导培养基为含有1.5mg/l6-ba和0.5mg/lnaa、ph5.6的ms培养基；含有2.0mg/l6-ba和0.2mg/lnaa、ph5.8的ms培养基；含有2.0mg/l6-ba和0.5mg/lnaa、ph5.8的ms培养基；含有2.0mg/l6-ba和1.0mg/lnaa、ph5.6的ms培养基；或含有1.0mg/l6-ba和0.5mg/lnaa、ph5.8的ms培养基。

更优选地，所述诱导培养基为含有2.0mg/l6-ba和0.2mg/lnaa，ph5.8的ms培养基。

所述生根培养基为：1/2ms+0.1mg/lnaa，ph5.6。

前述的方法，步骤4)中进行诱导培养和生根培养的条件为：温度20-25℃(优选20℃)，每日光照14-16h，光照强度1600-2000lx(优选2000lx)；诱导培养4-6周后转为生根培养。

前述的方法，步骤5)中所述基质由蛭石和珍珠岩按体积比1:1混合而成。

炼苗的条件为：温度27-30℃，相对湿度60-70％，培养30-45天。

前述的方法，步骤6)所述表型选自株高、冠幅、叶长、叶宽、叶柄长等中的至少一种。其中株高、冠幅、叶长、叶宽、叶柄长介于父母本之间的确定为真杂种。

本发明中，对后代材料进行染色体减数分裂观察，染色体数目表现为四倍体的确定为真杂种。

本发明中，母本选用芙蓉菊属二倍体芙蓉菊(cr.chinense)，父本选用菊属六倍体阔叶毛华菊(c.vestitum)。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明选用耐盐种质芙蓉菊为母本，中等耐盐种质阔叶毛华菊为父本，可有效将耐盐基因引入菊花育种过程中。

(二)本发明在组织培养技术上比较了不同胚胎发育时期、不同激素配比培养基下的胚发育效果。结果表明授粉后18天的幼胚培养效果最好，ms+2.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa，ph5.8的培养基最有利于胚发育，可达到6.25％的发芽率。

(三)本发明利用形态学观察和细胞学鉴定对芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间杂种真实性进行早期鉴定。

(四)本发明可实现芙蓉菊和阔叶毛华菊杂交胚的继续发育，实现芙蓉菊和阔叶毛华菊的属间远缘杂交，从而获得杂种后代。

(五)本发明使利用广义菊属菊花新种质进行菊花育种成为可能，同时有利于菊花起源演化及芙蓉菊属与菊属亲缘关系方面的深入研究。

附图说明

图1为本发明母本芙蓉菊(左)、父本阔叶毛华菊(中)、杂种后代(右)对比图。

图2为本发明较佳实施例中芙蓉菊、阔叶毛华菊亲本及杂种后代的形态对比图。其中，a：亲本的花叶对比；b：杂种后代的无性扩繁；c：杂种后代与亲本的形态对比。

图3为本发明较佳实施例中芙蓉菊、阔叶毛华菊及其杂种后代的初生叶对比图。其中，a：阔叶毛华菊；b：芙蓉菊；c-g：杂种后代。

图4为本发明较佳实施例中芙蓉菊、阔叶毛华菊及其杂种后代的细胞学鉴定图。其中，a：芙蓉菊；b：阔叶毛华菊；c-f：杂种后代。

具体实施方式

本发明针对目前我国特有菊花资源育种利用率低、遗传基础狭窄、培育菊花品种耐盐性弱等问题，利用耐盐野生种芙蓉菊为母本与阔叶毛华菊杂交，通过幼胚拯救技术解决两者在远缘杂交时存在的杂种胚败育、杂交不结实等问题，最终得到芙蓉菊和阔叶毛华菊的远缘杂交后代。

本发明提供芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间远缘杂种创制方法，包括以下步骤：

1)亲本准备：母本选用2n＝18的芙蓉菊，父本选用2n＝54的阔叶毛华菊。对亲本进行花期调整使花期相遇。母本芙蓉菊、父本阔叶毛华菊的植株对比图见图1。

2)远缘杂交：当父母本均开花时，母本去雄，取父本新鲜花粉授粉并套袋。

3)胚珠剥取：取步骤2)杂交授粉后8-24天的头状花序，在超净工作台剥取雌性小花，进行表面消毒灭菌，然后剥掉子房壁，取出胚珠。

4)幼胚离体培养：在无菌条件下，将步骤3)得到的胚珠接种到不同激素配比的诱导培养基中，培养温度20℃，每日光照16h，光照强度约2000lx；共设置5种培养基类型，6-ba与naa浓度为变量，每板接种约9个胚珠。

5)生根培养：4周后转入生根培养基(1/2ms+0.1mg/lnaa，ph5.6)，培养温度20℃，每日光照16h，光照强度约2000lx。

6)杂种f1代植株的获得：待小苗根长至1cm以上，移植到基质(粗粒蛭石:珍珠岩＝1:1，体积比)中进行炼苗。一个月后，上盆常规管理。

7)形态学观察：对父母本及后代材料进行形态学观察和统计，其中株高、冠幅、叶长、叶宽、叶柄长介于父母本之间的确定为真杂种。

8)细胞学鉴定：采用染色体计数对芙蓉菊和阔叶毛华菊的杂交后代真实性进行判断，其中染色体数目表现为四倍体的确定为真杂种。

优选地，步骤1)所用母本材料芙蓉菊需进行花期调整，从8月份开始进行8小时的短日照养护，使其10月中旬达到盛花期。

优选地，步骤2)所述授粉时间为上午9-10时或下午3-4时，同一花序重复授粉2次，每天授粉一次。

优选地，步骤2)所述套袋为授粉后套硫酸纸袋

优选地，步骤3)所述取的是杂交授粉后生长发育8-24天的头状花序。

优选地，步骤3)所述雌性小花消毒灭菌的方法为：用70％的酒精表面消毒30秒，无菌水冲洗4次，再用12％的h2o2水溶液灭菌10分钟，无菌水冲洗5次。

优选地，步骤4)所述幼胚离体培养的培养基为含有1.0-2.0mg/l6-ba和0.2-1.0mg/lnaa，ph5.6-5.8的ms培养基。具体分别为培养基a：1.5mg/l6-ba+0.5mg/lnaa，ph5.6；培养基b：2.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa，ph5.8；培养基c：2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa，ph5.8；培养基d：2.0mg/l6-ba+1.0mg/lnaa，ph5.6；培养基e：1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa，ph5.8。

优选地，步骤5)所述生根培养基为1/2ms+0.1mg/lnaa，ph5.6，即在1/2ms基本培养基中添加0.1mg/lnaa。

优选地，步骤6)所述f1代植株移栽种植的方法为先开瓶炼苗2-3天，然后移栽到粗粒蛭石:珍珠岩＝1:1的穴盘中，培养30天后上盆常规管理。

优选地，步骤7)包括测定株高、冠幅。叶长、叶宽、叶柄长；每株随机选择三片完全展开的叶片进行叶长、叶宽的测定，并分别测定叶柄长。

优选地，步骤7)细胞学鉴定结果中后代染色体数目为36条的确定为真杂种后代。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1利用不同胚龄幼胚进行胚拯救获得芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间杂种后代

利用不同胚龄幼胚进行胚拯救获得芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间杂种后代。包括以下步骤：

1、亲本准备：母本选用我国特产的芙蓉菊属二倍体耐盐野生种芙蓉菊，父本选用菊属六倍体中等耐盐野生种阔叶毛华菊，父母本均在国家花卉工程中心小汤山基地种植。对芙蓉菊进行花期调整，8月份放进人工气候室开始8小时的短日照养护，10月中旬可达到盛花期；短日照人工气候室设定为湿度70％，白天温度25℃，晚上22℃，光照时间为6点-14点。

2、远缘杂交：芙蓉菊与阔叶毛华菊在温室内进行人工杂交。在开花前1-2天对母本进行人工去雄并套袋，待柱头伸出并开叉呈现一定角度和分泌黏液时，收集父本新鲜花粉，用毛笔进行授粉，之后继续套袋。一般于上午10时或下午4时进行授粉，同一花序重复授粉2次，每天授粉一次。

3、胚珠剥取：取步骤2杂交授粉后8-24天的头状花序，隔一天取一次。在超净工作台剥取雌性小花，以70％的酒精表面消毒30秒，无菌水冲洗4次，然后用12％的h2o2水溶液灭菌10分钟，无菌水冲洗5次。在灭菌纸上用刀切开雌性小花子房，剥掉子房壁，取出胚珠。

4、幼胚离体培养：在无菌条件下，将步骤3得到的胚珠接种到含有1.0-2.0mg/l6-ba和0.2-1.0mg/lnaa，ph5.6-5.8的ms诱导培养基中，培养温度20℃，每日光照16h，光照强度约2000lx。表1结果表明，授粉后8-10天的幼胚，由于极其不成熟，接种成功率为0；授粉后24天的胚，由于胚已败育，接种成功率也为0。出愈效果最差的为授粉后14天的胚珠，出愈率为27.03％；最好的为授粉后16天的胚珠，出愈率达到70.79％。但最高成苗率(10.53％)出现在授粉后18天的胚珠，远高于其它时间段。因此综合出愈率和成苗率，芙蓉菊和阔叶毛华菊属间远缘杂交的最佳胚拯救时期为授粉后18天。本实施例共接种269个胚珠，最终得到17棵杂种幼苗。

表1不同胚龄的幼胚及对幼胚离体培养的影响

5、生根培养和杂种f1代植株的获得：4周后将得到的萌发幼胚转入生根培养基，1/2ms+0.1mg/lnaa，ph5.6，培养温度20℃，每日光照16h，光照强度约2000lx；观察幼胚在生根培养基中出现丛生芽的情况，直至幼胚发育成幼苗；待小苗根长至1cm以上，将得到的杂种f1代植株进行2-3天的开瓶炼苗，通过逐渐降低相对湿度和增强光照使小苗适应大田的自养生长和有菌环境。取出植株并洗净附着在其表面的培养基，移植到基质为粗粒蛭石:珍珠岩＝1:1的穴盘中。一个月后，上盆常规管理。最终获得11株芙蓉菊和阔叶毛华菊的杂种大苗。

实施例2利用不同激素配比培养基进行胚培养获得芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间杂种后代

利用不同激素配比培养基进行胚培养获得芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间杂种后代。包括以下步骤：

1、亲本准备：母本选用我国特产的二倍体耐盐野生种芙蓉菊，父本选用六倍体野生种阔叶毛华菊，父母本均在国家花卉工程中心小汤山基地种植。对芙蓉菊进行花期调整，8月份放进人工气候室开始8小时的短日照养护，使其10月中旬达到盛花期；短日照人工气候室设定为湿度70％，白天温度25℃，晚上温度22℃，光照时间为6点-14点。

2、远缘杂交：芙蓉菊与阔叶毛华菊在温室内进行杂交。在开花前1-2天对母本进行人工去雄并套袋隔离，待柱头伸出并开叉呈现一定角度和分泌黏液时，收集已父本新鲜花粉进行授粉，授粉后继续套袋隔离。于上午10时或下午4时授粉，同一花序重复授粉2次，每天授粉一次。

3、胚珠剥取：取步骤2杂交授粉后的头状花序，放入冰箱短期保存。在超净工作台剥取雌性小花，以70％酒精表面消毒30秒，无菌水冲洗4次，再以12％h2o2水溶液灭菌10分钟，无菌水冲洗5次。在灭菌纸上用刀切开雌性小花子房，剥掉子房壁，取出胚珠。

4)幼胚离体培养：在无菌条件下，将步骤3得到的胚珠接种到ms诱导培养基中，培养温度20℃，每日光照16h，光照强度约2000lx。接种在不同激素(6-ba、naa购自北京拜尔迪生物技术有限公司)配比的ms培养基上，分别为培养基a：1.5mg/l6-ba+0.5mg/lnaa，ph5.6；培养基b：2.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa，ph5.6；培养基c：2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa，ph5.8；培养基d：2.0mg/l6-ba+1.0mg/lnaa，ph5.6；培养基e：1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa，ph5.8。每板约接种9个胚珠，如图2所示。表2结果表明，5种培养基发芽率最低的为e型培养基，最高的为b型培养基，发芽率为6.25％，出愈率为46.88％。综合而言，芙蓉菊和阔叶毛华菊胚拯救时选用b型培养基(即ms+2.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa，ph5.8)更为适宜。本实施例共接种269个胚珠，最终得到17棵胚拯救幼苗。

表2不同激素类型的培养基对幼胚离体培养的影响

注：培养基a：1.5mg/l6-ba+0.5mg/lnaa，ph5.6；培养基b：2.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa，ph5.6；培养基c：2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa，ph5.8；培养基d：2.0mg/l6-ba+1.0mg/lnaa，ph5.6；培养基e：1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa，ph5.8。

5、生根培养和杂种f1代植株的获得：4周后将得到的萌发幼胚转入生根培养基，1/2ms+0.1mg/lnaa，培养温度20℃，每日光照16h，光照强度约2000lx；观察幼胚在生根培养基中出现丛生芽的情况，直至发育成杂种幼苗；待小苗根长至1em以上时，将得到的杂种f1植株进行2-3天的开瓶炼苗，通过逐渐降低相对湿度和增强光照使小苗适应大田的自养生长和有菌环境。取出杂种植株并洗净附着在其表面的培养基，移植到基质为粗粒蛭石∶珍珠岩＝1∶1的穴盘中。一个月后，上盆常规管理。最终获得11株芙蓉菊和阔叶毛华菊的杂种后代。

实施例3利用形态学观察和细胞学鉴定芙蓉菊和阔叶毛华菊的属间杂种真实性

利用形态学观察和细胞学鉴定芙蓉菊和阔叶毛华菊的属间杂种真实性。包括以下步骤：

1.用形态学鉴定杂种真实性

1)将杂交父母本及后代于5月份露地定植，进行常规养护管理。对杂种和双亲进行形态学观察和统计，包括：测定株高、冠幅、叶部性状。

2)每株随机选择三片完全展开的叶片，进行叶长、叶宽的测定，并分别测定叶柄的长度；其中株高、冠幅、叶长、叶宽、叶柄长介于父母本之间的确定为真杂种。

结果见表3、图2和图3，结果表明，在芙蓉菊和阔叶毛华菊杂交组合所得的胚拯救后代中，初步鉴定有8株为真杂种，形态接近芙蓉菊的为假杂种。真杂种后代叶形更接近阔叶毛华菊的阔卵形，这可能跟父本阔叶毛华菊为六倍体，提供染色体数目更多相关。杂种叶质厚、稍硬质，边缘为钝尖，毛稀疏，不同于两亲本；后代植株的冠幅、株高介于父母本之间。

表3芙蓉菊、阔叶毛华菊及杂种后代的株型、叶部形态特征

注：f：芙蓉菊；ky：阔叶毛华菊。

2.杂种后代染色体鉴定

1)取芙蓉菊和阔叶毛华菊后代进行扦插培养生根，生根基质为珍珠岩∶粗粒蛭石＝1∶1。剪取新鲜幼根(室外条件下8点至9点为宜)1cm长，清洗干净，放入盛蒸馏水的离心管，置于冰水共存条件下，处理24h。

2)转入卡诺固定液中(冰醋酸∶乙醇＝1∶3，体积比)，于4℃下固定24h。95％乙醇冲洗2次后，转入70％乙醇中4℃保存备用。解离染色前，先用无菌水冲洗3次，转入1mol/lhcl溶液中，在60℃水浴条件下解离10min。用蒸馏水冲洗3次，再漂洗5min。载玻片上截取根尖白色部分，滴上改良苯酚品红染色液(李新，2013)，染色10min。盖上盖玻片，用一张滤纸盖在盖玻片上，左手固定盖玻片，右手持解剖针大头，对准根尖所在位置轻轻均匀用力，将根尖细胞敲散开。

3)光学显微镜观察并找到一个分散比较好的细胞时，滴油换100倍油镜。每个材料，观察3个根尖，每个根尖至少10个细胞。

4)杂种后代细胞学鉴定结果为四倍体，染色体数目基本为36条左右，大于母本18条的为真杂种。

结果见图4，其中8个杂种后代鉴定结果为四倍体，染色体数目基本为36条，大于母本的18条，符合遗传学定律，且与形态学鉴定结果相一致，是真杂种后代。

表型性状观察与细胞学鉴定结果判定8个芙蓉菊和阔叶毛华菊的杂交后代为真杂种。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献：

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