石斛原球茎组培用培养基的制备方法与流程

[0001]
本发明涉及石斛组培用培养基制备技术领域，具体涉及一种石斛原球茎组培用培养基的制备方法。


背景技术：

[0002]
石斛自从药用价值被发现以来，始终被视为宝贵的药材，全球有该植物1500多种。该种植物的生长由于受气候的影响非常大，其大部分散布在亚热带地域和太平洋岛屿周围，我国目前发现的石斛类植物约有63种，在这其中，大概约39种能够当作药材使用。石斛类的植物多数生存方式为附生，生境相比较其他植物来说比较特殊，对其生长的环境也有着非常严格的要求。多生长在湿度较高且温度较低的阴坡上，因为空气的湿度也影响着其正常的生长。常与生长环境及习性与其相近的植物在一起混生。因此，石斛受空气中的水分影响既空气湿度尤其重要，生存地域十分狭窄。
[0003]
石斛中含有石斛多糖等很多种对人体疾病有治疗作用的成分，含有多种氨基酸以及不同种类的微量元素，石斛可以增强免疫力，而且在抗衰老肿瘤方面还有不可估量的价值，特别是对心血管疾病方面的治疗更有着极佳的作用。石斛可以滋阴补阳、促进人体平衡、而且在养胃方面也是有极好的作用。不仅如此，石斛也是养眼的佳品。所以它的药用价值显而易见是很高的。由于石斛的生长环境受到极大的限制，所以应找寻培养石斛的最佳途径，通过实验室的组织培养技术，使其经过脱分化和再分化最终培养出新的石斛个体，从而完成石斛的扩大培养。


技术实现要素：

[0004]
解决的技术问题
[0005]
针对现有技术的不足，本发明提供了一种石斛原球茎组培用培养基的制备方法，旨在设计一种利于石斛组织培养的最适培养基，通过实验室的组织培养技术，使其经过脱分化和再分化最终培养出新的石斛个体，从而完成石斛的扩大培养。
[0006]
技术方案
[0007]
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
[0008]
一种石斛原球茎组培用培养基的制备方法，包括以下制备步骤：
[0009]
s1、配置铁盐母液，具体配制步骤如下：
[0010]
称取3.37gna2-edta和2.78gfeso4
·
7h2o分别放入小烧杯内，加入适量的超纯水后加热溶解，溶解后倒入同一个放有磁力搅拌器的烧杯内进行搅拌，当溶液变为金黄色后将其ph值调至5.4，接着加入超纯水定容至1000ml，冷却后进行低温储存，所得记为铁盐母液；
[0011]
s2、配制激素溶液，具体配制步骤如下：
[0012]
a、称取0.125g6-ba用2ml无水乙醇和10-15滴1mol/l的hcl溶解，溶解后加入超纯水用体积为250ml的容量瓶对其进行定容，所得记为6-ba溶液；
[0013]
b、称取0.05giba，用8-10滴0.1mol/l的naoh溶液溶解，溶解后加入超纯水用体积为250ml的容量瓶对其进行定容，所得记为naa溶液；
[0014]
s3、取80g去皮的香蕉搅碎后放入搅拌器内，将纱布以2层的方式对折以对搅拌后的香蕉进行过滤，过滤后倒入烧杯内定容至80ml，记为香蕉泥，接着以同样的过滤方式对30ml 椰子汁进行过滤；
[0015]
s4、在容器内倒入500-600份纯水进行加热，沸腾后加入8-9份琼脂，用玻璃棒搅拌至琼脂溶解后加入19-20份蔗糖，继续用玻璃棒搅拌直至完全溶解；
[0016]
s5、向s4中的容器内加入70-80份s3中制得的香蕉泥和20-30份s3中制得的椰子汁，混合均匀后加入95-100份ms大量元素母液、9-10份ms微量元素母液、10-11份ms有机物母液和9-10份s1中制得的铁盐母液，在加入的过程中使用玻璃棒不断搅拌；
[0017]
s6、向s5中的容器内加入1.0-1.5份在s2中配置的6-ba溶液和0.3-0.5份在s2中配置的naa溶液，接着使用玻璃棒对其进行搅拌，所得记为培养基混合物；
[0018]
s7、将s6中制得的培养基混合物的ph调至6.0，最后加入适量的纯水对其定容至1000 份；
[0019]
s8、将s7中制得的培养基混合物分装至三角瓶内，并用封口膜和牛皮纸进行包扎，然后对装有培养基混合物的三角瓶进行高温高压灭菌，灭菌结束后放置在烘箱内烘干，冷却凝固后即为石斛原球茎组培用培养基。
[0020]
更进一步地，所述s1中的磁力搅拌器的搅拌速率为100-120r/min。
[0021]
更进一步地，所述s3中的香蕉选用九成熟的香蕉，椰子汁选用从新鲜椰子内取出的椰子汁。
[0022]
更进一步地，所述s4中的琼脂选用琼脂条。
[0023]
更进一步地，所述s5中ms大量元素母液的配制方法为：称取19gkno3、16.5gnh4no3、 3.7gmgso4.7h2o、1.7gkh2po4和4.4gcacl2.2h2o分别放入小烧杯内加入适量的超纯水进行溶解，溶解后倒入同一个放有磁力搅拌器的烧杯内进行搅拌，接着加入超纯水定容至1000ml，所得即为ms大量元素母液。
[0024]
更进一步地，所述s5中ms微量元素母液的配制方法为：称取2.23gmnso4.4h2o、 0.86gznso4.7h2o、0.62gh3bo3、0.083gki、0.025gna2moo4.2h2o、0.0025gcuso4.5h2o和 0.0025gcocl2.6h2o分别放入小烧杯内加入适量的超纯水进行溶解，溶解后倒入同一个放有磁力搅拌器的烧杯内进行搅拌，接着加入超纯水定容至1000ml，所得即为ms微量元素母液。
[0025]
更进一步地，所述s5中ms有机物母液的配制方法为：称取0.1g甘氨酸、0.02g盐酸硫胺素、0.025g盐酸吡哆素、0.025g烟酸和5g肌醇分别放入小烧杯内加入适量的超纯水进行溶解，溶解后倒入同一个放有磁力搅拌器的烧杯内进行搅拌，接着加入超纯水定容至500ml，所得即为ms有机物母液。
[0026]
更进一步地，所述s8的分装过程中按照100份/瓶的量进行分装。
[0027]
有益效果
[0028]
本发明提供了一种石斛原球茎组培用培养基的制备方法，与现有公知技术相比，本发明的具有如下有益效果：
[0029]
本发明在配制石斛原球茎组培用的培养基过程中，加入的添加物为香蕉泥和椰子
汁，因为香蕉中含有对原球茎生长有利的糖类和无机盐，既能够为培养物供给其所必须的营养成分，又能在酸碱平衡的维护上起到一定的作用；虽然椰子汁中含有更加丰富的糖类和无机盐，但是椰子受季节性影响而且相比较于香蕉价格更贵，在考虑成本后按照一定的比例来添加椰子汁和香蕉泥，既能够降低培养基的成本，又能够保证培养基中的糖类和无机盐含量，有利于石斛原球茎的组织培养。由于在特定的某种激素浓度配比下6-ba和naa具有协同作用，促进石斛原球茎的增殖生长，激素浓度过低时，满足不了原球茎生长的需求，过高时又会产生抑制作用，本发明按照指定的激素配比向培养基中加入6-ba和naa，能够有利于石斛原球茎的生长，便于后期石斛的扩大培养。
附图说明
[0030]
图1是本发明的一种石斛原球茎组培用培养基的制备方法的流程示意图。
具体实施方式
[0031]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0032]
实施例1：
[0033]
本实施例的一种石斛原球茎组培用培养基的制备方法，包括以下制备步骤：
[0034]
s1、配制铁盐母液，具体配制步骤如下：
[0035]
称取3.37gna2-edta和2.78gfeso4
·
7h2o分别放入小烧杯内，加入适量的超纯水后加热溶解，溶解后倒入同一个放有磁力搅拌器的烧杯内进行搅拌，当溶液变为金黄色后将其ph值调至5.4，接着加入超纯水定容至1000ml，冷却后进行低温储存，所得记为铁盐母液；
[0036]
s2、配制激素溶液，具体配制步骤如下：
[0037]
a、称取0.125g6-ba用2ml无水乙醇和10滴1mol/l的hcl溶解，溶解后加入超纯水用体积为250ml的容量瓶对其进行定容，所得记为6-ba溶液；
[0038]
b、称取0.05giba，用8滴0.1mol/l的naoh溶液溶解，溶解后加入超纯水用体积为 250ml的容量瓶对其进行定容，所得记为naa溶液；
[0039]
s3、取80g去皮的香蕉搅碎后放入搅拌器内，将纱布以2层的方式对折以对搅拌后的香蕉进行过滤，过滤后倒入烧杯内定容至80ml，记为香蕉泥，接着以同样的过滤方式对30ml 椰子汁进行过滤；
[0040]
s4、在容器内倒入550份纯水进行加热，沸腾后加入9份琼脂，用玻璃棒搅拌至琼脂溶解后加入20份蔗糖，继续用玻璃棒搅拌直至完全溶解；
[0041]
s5、向s4中的容器内加入80份s3中制得的香蕉泥和25份s3中制得的椰子汁，混合均匀后加入95份ms大量元素母液、9份ms微量元素母液、10份ms有机物母液和10份s1中制得的铁盐母液，在加入的过程中使用玻璃棒不断搅拌；
[0042]
s6、向s5中的容器内加入1.0份在s2中配置的6-ba溶液和0.5份在s2中配置的naa 溶液，接着使用玻璃棒对其进行搅拌，所得记为培养基混合物；
[0043]
s7、将s6中制得的培养基混合物的ph调至6.0，最后加入适量的纯水对其定容至1000 份；
[0044]
s8、将s7中制得的培养基混合物分装至三角瓶内，并用封口膜和牛皮纸进行包扎，然后对装有培养基混合物的三角瓶进行高温高压灭菌，灭菌结束后放置在烘箱内烘干，冷却凝固后即为石斛原球茎组培用培养基。
[0045]
上述的容器可以采用搪瓷缸。
[0046]
更进一步地，s1中的磁力搅拌器的搅拌速率为100r/min。
[0047]
更进一步地，s3中的香蕉选用九成熟的香蕉，椰子汁选用从新鲜椰子内取出的椰子汁。
[0048]
更进一步地，s4中的琼脂选用琼脂条。
[0049]
更进一步地，s5中ms大量元素母液的配制方法为：称取19gkno3、16.5gnh4no3、3.7gmgso4.7h2o、1.7gkh2po4和4.4gcacl2.2h2o分别放入小烧杯内加入适量的超纯水进行溶解，溶解后倒入同一个放有磁力搅拌器的烧杯内进行搅拌，接着加入超纯水定容至1000ml，所得即为ms大量元素母液。
[0050]
更进一步地，s5中ms微量元素母液的配制方法为：称取2.23gmnso4.4h2o、 0.86gznso4.7h2o、0.62gh3bo3、0.083gki、0.025gna2moo4.2h2o、0.0025gcuso4.5h2o和 0.0025gcocl2.6h2o分别放入小烧杯内加入适量的超纯水进行溶解，溶解后倒入同一个放有磁力搅拌器的烧杯内进行搅拌，接着加入超纯水定容至1000ml，所得即为ms微量元素母液。
[0051]
更进一步地，s5中ms有机物母液的配制方法为：称取0.1g甘氨酸、0.02g盐酸硫胺素、 0.025g盐酸吡哆素、0.025g烟酸和5g肌醇分别放入小烧杯内加入适量的超纯水进行溶解，溶解后倒入同一个放有磁力搅拌器的烧杯内进行搅拌，接着加入超纯水定容至500ml，所得即为ms有机物母液。
[0052]
更进一步地，s8的分装过程中按照100份/瓶的量进行分装。
[0053]
实施例2：
[0054]
本实施例的一种石斛原球茎组培用培养基的制备方法，包括以下制备步骤：
[0055]
s1、配置铁盐母液，具体配制步骤如下：
[0056]
称取3.37gna2-edta和2.78gfeso4
·
7h2o分别放入小烧杯内，加入适量的超纯水后加热溶解，溶解后倒入同一个放有磁力搅拌器的烧杯内进行搅拌，当溶液变为金黄色后将其ph值调至5.4，接着加入超纯水定容至1000ml，冷却后进行低温储存，所得记为铁盐母液；
[0057]
s2、配制激素溶液，具体配制步骤如下：
[0058]
a、称取0.125g6-ba用2ml无水乙醇和13滴1mol/l的hcl溶解，溶解后加入超纯水用体积为250ml的容量瓶对其进行定容，所得记为6-ba溶液；
[0059]
b、称取0.05giba，用10滴0.1mol/l的naoh溶液溶解，溶解后加入超纯水用体积为 250ml的容量瓶对其进行定容，所得记为naa溶液；
[0060]
s3、取80g去皮的香蕉搅碎后放入搅拌器内，将纱布以2层的方式对折以对搅拌后的香蕉进行过滤，过滤后倒入烧杯内定容至80ml，记为香蕉泥，接着以同样的过滤方式对30ml 椰子汁进行过滤；
[0061]
s4、在容器内倒入500份纯水进行加热，沸腾后加入8份琼脂，用玻璃棒搅拌至琼脂溶解后加入20份蔗糖，继续用玻璃棒搅拌直至完全溶解；
[0062]
s5、向s4中的容器内加入75份s3中制得的香蕉泥和30份s3中制得的椰子汁，混合均匀后加入98份ms大量元素母液、10份ms微量元素母液、11份ms有机物母液和9份s1中的铁盐母液，在加入的过程中使用玻璃棒不断搅拌；
[0063]
s6、向s5中的容器内加入1.3份在s2中配置的6-ba溶液和0.3份在s2中配置的naa 溶液，接着使用玻璃棒对其进行搅拌，所得记为培养基混合物；
[0064]
s7、将s6中制得的培养基混合物的ph调至6.0，最后加入适量的纯水对其定容至1000 份；
[0065]
s8、将s7中制得的培养基混合物分装至三角瓶内，并用封口膜和牛皮纸进行包扎，然后进行高温高压灭菌，灭菌结束后放置在烘箱内烘干，冷却凝固后即为石斛原球茎组培用培养基。
[0066]
更进一步地，s1中的搅拌速率为110r/min。
[0067]
更进一步地，s3中的香蕉选用九成熟的香蕉，椰子汁选用从新鲜椰子内取出的椰子汁。
[0068]
更进一步地，s4中的琼脂选用琼脂条。
[0069]
更进一步地，s5中ms大量元素母液的配制方法为：称取19gkno3、16.5gnh4no3、 3.7gmgso4.7h2o、1.7gkh2po4和4.4gcacl2.2h2o分别放入小烧杯内加入适量的超纯水进行溶解，溶解后倒入同一个放有磁力搅拌器的烧杯内进行搅拌，接着加入超纯水定容至1000ml，所得即为ms大量元素母液。
[0070]
更进一步地，s5中ms微量元素母液的配制方法为：称取2.23gmnso4.4h2o、 0.86gznso4.7h2o、0.62gh3bo3、0.083gki、0.025gna2moo4.2h2o、0.0025gcuso4.5h2o和 0.0025gcocl2.6h2o分别放入小烧杯内加入适量的超纯水进行溶解，溶解后倒入同一个放有磁力搅拌器的烧杯内进行搅拌，接着加入超纯水定容至1000ml，所得即为ms微量元素母液。
[0071]
更进一步地，s5中ms有机物母液的配制方法为：称取0.1g甘氨酸、0.02g盐酸硫胺素、 0.025g盐酸吡哆素、0.025g烟酸和5g肌醇分别放入小烧杯内加入适量的超纯水进行溶解，溶解后倒入同一个放有磁力搅拌器的烧杯内进行搅拌，接着加入超纯水定容至500ml，所得即为ms有机物母液。
[0072]
更进一步地，s8的分装过程中按照100份/瓶的量进行分装。
[0073]
实施例3：
[0074]
本实施例的一种石斛原球茎组培用培养基的制备方法，包括以下制备步骤：
[0075]
s1、配置铁盐母液，具体配制步骤如下：
[0076]
称取3.37gna2-edta和2.78gfeso4
·
7h2o分别放入小烧杯内，加入适量的超纯水后加热溶解，溶解后倒入同一个放有磁力搅拌器的烧杯内进行搅拌，当溶液变为金黄色后将其ph值调至5.4，接着加入超纯水定容至1000ml，冷却后进行低温储存，所得记为铁盐母液；
[0077]
s2、配制激素溶液，具体配制步骤如下：
[0078]
a、称取0.125g6-ba用2ml无水乙醇15滴1mol/l的hcl溶解，溶解后加入超纯水用体
积为250ml的容量瓶对其进行定容，所得记为6-ba溶液；
[0079]
b、称取0.05giba，用9滴0.1mol/l的naoh溶液溶解，溶解后加入超纯水用体积为 250ml的容量瓶对其进行定容，所得记为naa溶液；
[0080]
s3、取80g去皮的香蕉搅碎后放入搅拌器内，将纱布以2层的方式对折以对搅拌后的香蕉进行过滤，过滤后倒入烧杯内定容至80ml，记为香蕉泥，接着以同样的过滤方式对30ml 椰子汁进行过滤；
[0081]
s4、在容器内倒入600份纯水进行加热，沸腾后加入8份琼脂，用玻璃棒搅拌至琼脂溶解后加入19份蔗糖，继续用玻璃棒搅拌直至完全溶解；
[0082]
s5、向s4中的容器内加入70份s3中制得的香蕉泥和20份s3中制得的椰子汁，混合均匀后加入100份ms大量元素母液、10份ms微量元素母液、10份ms有机物母液和9份s1中制得的铁盐母液，在加入的过程中使用玻璃棒不断搅拌；
[0083]
s6、向s5中的容器内加入1.5份在s2中配置的6-ba溶液和0.4份在s2中配置的naa 溶液，接着使用玻璃棒对其进行搅拌，所得记为培养基混合物；
[0084]
s7、将s6中制得的培养基混合物的ph调至6.0，最后加入适量的纯水对其定容至1000 份；
[0085]
s8、将s7中制得的培养基混合物分装至三角瓶内，并用封口膜和牛皮纸进行包扎，然后对装有培养基混合物的三角瓶进行高温高压灭菌，灭菌结束后放置在烘箱内烘干，冷却凝固后即为石斛原球茎组培用培养基。
[0086]
更进一步地，s1中的搅拌速率为120r/min。
[0087]
更进一步地，s3中的香蕉选用九成熟的香蕉，椰子汁选用从新鲜椰子内取出的椰子汁。
[0088]
更进一步地，s4中的琼脂选用琼脂条。
[0089]
更进一步地，s5中ms大量元素母液的配制方法为：称取19gkno3、16.5gnh4no3、 3.7gmgso4.7h2o、1.7gkh2po4和4.4gcacl2.2h2o分别放入小烧杯内加入适量的超纯水进行溶解，溶解后倒入同一个放有磁力搅拌器的烧杯内进行搅拌，接着加入超纯水定容至1000ml，所得即为ms大量元素母液。
[0090]
更进一步地，s5中ms微量元素母液的配制方法为：称取2.23gmnso4.4h2o、 0.86gznso4.7h2o、0.62gh3bo3、0.083gki、0.025gna2moo4.2h2o、0.0025gcuso4.5h2o和 0.0025gcocl2.6h2o分别放入小烧杯内加入适量的超纯水进行溶解，溶解后倒入同一个放有磁力搅拌器的烧杯内进行搅拌，接着加入超纯水定容至1000ml，所得即为ms微量元素母液。
[0091]
更进一步地，s5中ms有机物母液的配制方法为：称取0.1g甘氨酸、0.02g盐酸硫胺素、 0.025g盐酸吡哆素、0.025g烟酸和5g肌醇分别放入小烧杯内加入适量的超纯水进行溶解，溶解后倒入同一个放有磁力搅拌器的烧杯内进行搅拌，接着加入超纯水定容至500ml，所得即为ms有机物母液。
[0092]
更进一步地，s8的分装过程中按照100份/瓶的量进行分装。
[0093]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖
非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0094]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。