一种鸡爪槭新品种组培再生体系的建立方法与流程

1.本发明涉及植物组培技术领域，特别是指一种鸡爪槭新品种
‘
金陵丹枫
’ꢀ
组培再生体系的建立方法。


背景技术：

2.‘
金陵丹枫’是槭树科槭属鸡爪槭(acer palmatum)的一个园艺新品种， 由江苏省农业科学院经过多年选育而成。其叶片掌状5～7裂，叶片边缘具有重 锯齿，叶基部近心脏形，新叶为亮红色，观赏期长达100余天。由本案发明人 自主创新选育的新品种
‘
金陵丹枫’已获得植物新品种权证书与江苏省林木良 种认定证书。该新品种
‘
金陵丹枫’可孤植，群植或作为高档盆栽用，具有极 高的观赏和应用价值。
3.在
‘
金陵丹枫’种苗的生产中，通常采用嫁接的方式，但是嫁接成活率受 多种外界因素影响较大，如砧木和接穗的质量，嫁接季节和温湿度等，不利于 大规模生产。
‘
金陵丹枫’扦插不易生根，繁殖较困难。因此亟待建立
‘
金陵 丹枫’的组培再生体系，解决批量生产的问题。目前国内虽有少量鸡爪槭品种 已建立了组培再生体系，如
‘
金陵黄枫’，
‘
赤枫’，
‘
日本红枫’等，但是 不同品种的鸡爪槭对不同培养基和植物激素的适应性差异很大，还需要针对不 同品种细致研究其适宜的组培繁殖技术。
4.本发明以自主创新选育的新品种
‘
金陵丹枫’当年生枝条作为外植体，通 过启动培养，增殖培养和生根培养等阶段，筛选最适宜
‘
金陵丹枫’生长的激 素浓度。我们还研究了
‘
金陵丹枫’不定芽对不同浓度的羧苄青霉素 (carbenicillin，carb)和潮霉素(hygromycin，hyg)的敏感性，以期为
‘
金 陵丹枫’转基因体系的建立提供依据。


技术实现要素：

5.本发明实施方式的目的在于提供一种鸡爪槭新品种
‘
金陵丹枫’组培再生 体系的建立方法，该方法包括以下步骤：
6.步骤s001、创造组培条件
7.向培养基中添加蔗糖20g/l，琼脂5g/l，调整培养基ph值至5.7，并调 节组培环境光照强度为100μmol/m2/s，光周期为16h/8h，温度为25
±
2℃；
8.步骤s002、外植体消毒
9.将采集到的鸡爪槭外植体当年生枝条剪去叶片，切取约3cm的带芽茎段， 用洗洁剂清洗，然后流动清水冲洗1h，再用75％酒精以及0.1％氯化汞交互式 消毒分别不低于5min，同时添加0.2％的聚氧乙烯山梨糖醇酯，消毒完毕后再使 用无菌水漂洗3次，最后在无菌滤纸上晾干表面水分；
10.步骤s003、启动培养
11.将上述步骤s002中消毒处理后获得的无菌外植体分别接种到含有iaa、 iba、naa、6
‑
ba、tdz不同生长素的培养基中，培养45d后，统计腋芽诱导率， 观察腋芽萌动及后续生长状况；
12.步骤s004、增殖培养
13.将生长状况良好且长约1cm的腋芽剪下，放入含有细胞分裂素6
‑
ba或kt 与生长素iba或naa混合的培养基中，培养45d后统计平均增殖系数；
14.步骤s005、生根培养
15.将经过上述步骤s004增殖培养获得的约1cm丛生芽分别剪下，转移到含 有不同浓度生长素iaa(0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/l)、iba(0.1、0.2、 0.3、0.4和0.5mg/l)和naa(0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/l)配比的培 养基中，培养30d后统计生根数及平均根长。
16.对经过所述步骤s004增殖培养后的腋芽进行羧苄青霉素抗性试验，该实验 方式如下：选取增殖培养基上获得的生长状况良好的健壮不定芽接种到含有不 同浓度carb(0、100、200、300、400、500、600和700mg/l)的增殖培养基 中，培养45d后统计不定芽的诱导率及平均增殖系数，同时观察不定芽的成活 率及生长状况。
17.对经过所述步骤s004增殖培养后的腋芽进行羧苄青霉素抗性试验，该实验 方式如下：选取增殖培养基上获得的生长状况良好的健壮不定芽接种到含有不 同浓度hyg的(0、2.5、5、7.5、10、12.5、15和17.5mg/l)增殖培养基中， 培养45d后统计不定芽的增值率及增殖系数，同时观察不定芽的成活率及生长 状况。每个处理重复3次，每个处理50个芽。
附图说明
18.图1为本发明鸡爪槭
‘
金陵丹枫’丛生芽分化及生根情况图。图1中，将 丛生芽到生根的过程分为6个阶段，其中阶段a为单个不定芽侧拍、b为单个 不定芽顶拍、c为增殖产生的丛生芽侧拍、d为增殖产生的丛生芽顶拍、e为不 定芽长成的小苗、f为生根小苗。
具体实施方式
19.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对 本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解， 在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本发明而提出了许多技术细节。 但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可 以实现本发明所要求保护的技术方案。
20.本实施例所涉及的一种鸡爪槭新品种
‘
金陵丹枫’组培再生体系的建立方 法，该方法的具体实现如下：
21.将田间采集的外植体茎段用不同的消毒时间进行处理，结果如表1所示。
ꢀ‘
金陵丹枫’外植体使用75％酒精消毒40s和0.1％氯化汞消毒20min的组合 处理时，既能保证
‘
金陵丹枫’外植体具有较低的污染率(17.6％)，又能保持 较高的腋芽萌发率(90.3％)。因此，选用该处理对
‘
金陵丹枫’外植体消毒效 果最佳。
22.表1不同消毒处理对外植体的影响
23.[0024][0025]
表中小写英文字母表示同一组中不同均值在0.05水平上的差异显著(p＜0.05).
[0026]
不同激素配比对外植体启动培养的影响
[0027]
将无菌外植体上接种到不同激素配比的nn69培养基中，接种约10d后腋 芽开始萌动，同时茎基部开始形成愈伤组织。接种45d后统计腋芽诱导率，结 果如表2，在nn69培养基中添加单种激素对
‘
金陵丹枫’外植体启动培养的影 响显著优于同时添加多种激素。其中添加iba浓度为0.1mg/l时，腋芽诱导率 最高(90.6
±
3.1)，腋芽生长快且长势健壮。并最终选择该培养基为
‘
金陵丹 枫’最佳培养基。
[0028]
表2不同激素配比对外植体启动培养的影响
[0029][0030]
表中小写英文字母表示同一组中不同均值在0.05水平上的差异显著。(p＜0.05).
[0031]
不同激素配比对芽增殖培养的影响
[0032]
将无菌外植体在启动培养基上生长的腋芽剪下，放入不同激素浓度配比的 nn69培养基中培养45d后，统计观察腋芽平均增殖系数(增殖系数＝产生的丛 生芽数/接种的腋芽数
×
100％)。统计结果如表3所示，
‘
金陵丹枫’腋芽在不 同激素组合的增殖培养基中的平均增殖系数差异明显。6ba和iba组合的平均 增殖系数为3.1～3.6，tdz和iba组合的平均增殖系数为2.2～2.9，kt和iba 组合的平均增殖系数为6.2～8.3，明显优于其它激素组合。其中在添加0.4mg/lkt和0.1mg/l iba的nn69培养基中腋芽的增殖系数最高，为8.3，显著高于 添加其它激素组合的培养基，且该培养基上生长的丛生芽状态良好，长势健壮， 利于进行生根培养。
[0033]
表3不同激素配比对芽增殖培养的影响
[0034][0035]
表中小写英文字母表示同一组中不同均值在0.05水平上的差异显著。(p＜0.05).
[0036]
不同浓度生长素对生根的影响
[0037]
将在增殖培养基上产生的丛生芽剪下，分别转移到含有不同生长素浓度的 nn69培养基中，观察统计不定芽的生根状况。试验结果显示，
‘
金陵丹枫’不 定芽在添加不同生长素的培养基中生根状况差异显著。在添加iaa的培养基上， 生根率仅为55.9％～60.8％，平均根系量仅为3.5～3.7，平均根长仅为1.9～2.9 cm。在添加iba的培养基上，生根率明显升高，为75.9％～95.6％，平均根系量 为4.3～7.1，平均根长为3.0～3.9cm。在添加naa的培养基上，生根率仅为 67.8％～80.1％，平均根系量仅为3.1～3.9，平均根长仅为2.3～2.9cm。不定 芽在添加0.3mg/l iba的培养基上，生根率最高，平均根系量和平均根长最大， 小苗长势最好(表4)。鸡爪槭
‘
金陵丹枫’丛生芽分化及生根情况见图1
[0038]
表4不同浓度生长素对生根的影响
[0039]
[0040][0041]
表中小写英文字母表示同一组中不同均值在0.05水平上的差异显著。(p＜0.05).
[0042]
不同浓度的羧苄青霉素对诱导丛生芽的影响
[0043]
抗生素carb可以有效抑制农杆菌的生长，同时也会抑制丛生芽的诱导和增 殖。随着carb浓度的增高，
‘
金陵丹枫’丛生芽的诱导率和平均增殖系数显著 降低(表5)，表明
‘
金陵丹枫’丛生芽对carb非常敏感。carb浓度为700mg/l 时，丛生芽诱导率仅为45.9％，且丛生芽基本停止增殖。
[0044]
表5不同浓度的羧苄青霉素对诱导丛生芽的影响
[0045][0046]
表中小写英文字母表示同一组中不同均值在0.05水平上的差异显著。(p＜0.05).
[0047]
不同浓度的潮霉素对诱导丛生芽的影响
[0048]
抗生素hyg在遗传转化筛选过程中起着重要作用。hyg也会抑制丛生芽的 诱导和增殖，甚至会导致丛生芽白化死亡。hyg对
‘
金陵丹枫’丛生芽的生长 影响尤为明显。当hyg浓度为10.0mg/l时，丛生芽的诱导率仅为20.3％，且 丛生芽几乎不增殖。当hyg浓度为
12.5mg/l时，丛生芽不被诱导，且20.6％ 丛生芽出现白化死亡现象。
[0049]
表6不同浓度的潮霉素对诱导丛生芽的影响
[0050][0051]
表中小写英文字母表示同一组中不同均值在0.05水平上的差异显者。(p＜0.05).
[0052]
本发明以鸡爪槭
‘
金陵丹枫’为研究对象，建立了组培再生技术体系。以 当年生枝条为外植体，75％酒精消毒40s，0.1％氯化汞消毒20min，流水冲洗 后接种到nn69+0.1mg/l iba的培养基上进行启动培养，诱导腋芽萌发。将萌 发的腋芽切下，接种到nn69+0.4mg/l kt nn69+0.1mg/l iba的培养基上进行 增殖培养，诱导产生丛生芽。从产生的丛生芽切下的单个不定芽接种到 nn69+0.3mg/l iba的培养基上进行生根培养，长成带根小苗后可以移栽到穴 盘。通过
‘
金陵丹枫’不定芽对羧苄青霉素和潮霉素的敏感性的研究，发现当 carb浓度为700mg/l或者hyg浓度为10mg/l时，丛生芽基本停止增殖。
[0053]
进行组培再生体系的建立第一步是要解决外植体的污染问题。由于本发明 试验的外植体取自大田的当年生枝条，附生菌较多，故采用了75％酒精消毒和 0.1％氯化汞消毒组合消毒的方式，这与前人的研究结果一致
[3]
。在组培过程中， 常用的基本培养基有ms
[7]
、wpm
[8]
、nn69
[9]
、b5
[10]
、white
[11]
等，不同基本 培养基对槭属植物再生体系的建立具有重要影响。鸡爪槭
‘
赤枫’使用了ms 培养基作为基本培养基
[4]
，日本红枫
‘
青龙’使用了wpm培养基
[5]
，鸡爪槭
‘
金 陵黄枫’使用了nn69培养基
[3]
。本试验也选择nn69作为基本培养基进行培养。 植物生长调节剂是组培再生体系建立过程中不可或缺的物质，其种类、浓度和 配比等是诱导腋芽生长，腋芽增殖和不定芽生根的关键因子
[12，13]
。鸡爪槭
‘
赤 枫’[4]
、复叶槭
[14]
、红翅槭
[15]
和尖尾槭
[16]
均采用了6
‑
ba和iaa的组合实现 了腋芽的增殖。鸡爪槭
‘
金陵黄枫’利用tdz和naa组合使用时，腋芽增殖系 数最高
[3]
。日本红枫
‘
青龙’在tdz和iba组合中增殖最快
[5]
。这说明槭属植 物对激素种类和浓度的感知具有较大差异，不同基因型的槭属植物需要不同激 素浓度和配比。
[0054]
羧苄青霉素对根癌农杆菌具有很好的抑制作用，但是高浓度的羧苄青霉素 会抑制不定芽的生长和增殖，浓度过低又不足以抑制农杆菌生长。在贡菊叶片 诱导不定芽的过程中，当羧苄青霉素为250mg/l时，不定芽的诱导不受影响
[17]
。 蓝莓与树莓在分化阶段羧苄青霉素的临界值为200～300mg/kg
[18]
。
‘
金陵丹 枫’不定芽对羧苄青霉素的临界值则为300～400mg/l。在转基因体系建立过 程中，潮霉素做为抗性筛选标记具有重要作用。潮霉素浓度过高会导致植物细 胞死亡，严重抑制植株生长。不同物种对潮霉素的敏感性差异巨
大。巨霸杨对 潮霉素临界浓度为4～6mg/l
[19]
。甘蔗在愈伤组织形成过程中，潮霉素的筛选 浓度为30mg/l
[20]
。
‘
金陵丹枫’不定芽对潮霉素较为敏感，潮霉素浓度为2.5 mg/l时，已经影响丛生芽的诱导率和增殖系数。
[0055]
本发明建立了鸡爪槭
‘
金陵丹枫’组培再生体系，为大量工厂化育苗提供 了技术支撑；并且开展了不定芽对羧苄青霉素和潮霉素的抗性试验，筛选出了 临界浓度，以期为
‘
金陵丹枫’遗传转化体系的建立和优化提供参考。同时为 进一步目的基因的导入和分子遗传育种改良奠定了基础。
[0056]
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实 施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本 发明的精神和范围。