一种适用于高产油用牡丹实生选种方法与流程

本发明属于农作物筛选培养领域，涉及实生选种技术，尤其是一种适用于高产油用牡丹实生选种方法。

背景技术：

油用牡丹作为新兴木本油料作物，得到国家的大力扶持和推广，目前在全国各地均有种植。油用牡丹主要以实生繁殖为主，即播种繁殖，由于花期自然杂交，所产种子大多数为杂种，后代性状分离严重，同一品种间单株生长量、结实产量、种子出油率差异较大，造成亩产量较低，因此严重影响了油用牡丹行业的快速发展。目前关于油用牡丹主要集中在杂交育种、扦插育种、栽培育种、及提高产量和籽油成分等方面，但是以上育种方法不仅周期长而且所选育品种未必适应当地环境。

通过检索发现以下几篇与本申请相关的公开专利文献：

1、一种具有观赏和油用价值的牡丹新品种选育方法，公开号：cn105248270a，特点在于选择抗性较强的亲本，花期进行人工授粉，并在种子采收后进行药剂处理打破休眠促进种子萌发，赤霉素处理顶芽，后期选择花色及结实能力强的单株作为接穗嫁接及作为亲本进行亲本，再次进行杂交育种工作。但是本发明杂交育种后代容易出现杂种基因，即再次育种时出现性状分离，且杂交过程复杂、周期长，对操作人员要求较高，因此不适于推广。

2、一种高产油量牡丹新品种培育方法，公开号cn107896974a，其特征在于选择生长势强、无病虫害的牡丹作为母本，将母本放入肥料中进行根外施肥，赤霉素涂抹叶片，并选择适合扦插枝条前15-30天进行环剥，并用abt涂抹伤口，选择沙子作为扦插基质，进行扦插，并选择优良单株进行杂交育种。但是牡丹扦插繁殖系数低，且牡丹扦插后生根率极低尤其像‘凤丹’，因此无法满足短时间内获得大量扦插苗，且扦插苗后进行培养，至开花进行杂交，获得杂交种子，再次播种选育优良品种，周期长，人员投入较大，不利于全面推广。

3、一种油用牡丹的育种方法，公开号cn109496635a，其特征在于选择成熟无病虫害的种子，在40℃水中浸种24h，再用10％的次氯酸钠消毒10-15分钟，条播法进行播种，选择40-50％以下的遮阳度的林地种植，苗期追肥，花期露出芽鳞时，将鳞片剥掉，并加强田间管理，于生长后期选出生长状况良好的植株作为种苗。本发明主要是通过控制油用牡丹营养生长，促进生殖生长，进而选择表现性良好单株，但是仅仅以当年生长选育新品种存在误差，存在缓苗期植株间生长状态不一，因此不利于推广。

4、一种油用牡丹的高产培育方法，公开号cn106069132a，其特征在于由有机肥、菌液混合物(解淀粉芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液、枯草芽孢杆菌)、复合微量元素(硫酸亚铁、硼酸、硫酸锰、硫酸铜、硫酸锌和钼酸)制备的生物肥，并随着深耕施入土壤，加强田间管理，并于每年冬季、春季增施生物肥。但是本发明所述菌液混合肥需发酵设备，不仅过程复杂，而且需要购买发酵等精密仪器，增加投入，不利于全面推广。

5、一种油用牡丹矮化抗逆品种选育技术，公开号cn109430051a，其特征在于选育赤霉素合成关键基因的表达量较低的品种或植株，用赤霉素等处理和筛选矮化特性种子或植株，选育抗逆相关基因表达量较高的品种或植株，对其相关抗逆指标进行测定，进一步对单株产量进行测定。但是本发明仅限于抗逆基因表达量较高的品种或植株，对相关基因检测相对复杂，需要专业人员，且确定表达量较高植株相对困难，因此不适于推广。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术不足及提供一种适于高产油用牡丹的方法，主要花期初选、果期复选、主成分分析确定表现优良植株、基因多态性分析进行验证，本方法可操作性强、准确性高，便于推广应用。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种适用于高产油用牡丹实生选种方法，具体方法步骤如下：

1花期初选

主要是在花期测定单株开花数、心皮数、花期新梢长、新梢数、花期茎粗、花直径在内的6个表型和数量性状。

1)单株开花数：指单株所开花的总量，包括全开、半开以及未开的花骨朵。

2)心皮数：每朵花形成的心皮总数。

3)花期新梢长：盛花期新生长的枝梢长度，为该株牡丹的新梢长(cm)。

4)新梢数：单株新梢的总量，不包括二次梢。

5)花期茎粗：测量单株所有结实枝条粗度，求平均作为该株牡丹的茎粗(mm)。

6)花直径：单株植株每朵花的直径平均值，为该株牡丹的花直径(cm)。

2果期复选

主要测定果期新梢长、单株结果数、果荚横径、果荚纵径、果形指数、单株果角数、坐果率、单株种子数、单株产量、百粒重等10个主要性状指标。

1)果期新梢长：果实成熟期，新生长枝梢的长度，为该株牡丹的新梢长(cm)。

2)单株结果数：果实成熟期，测量单株结果数量。

3)果荚横径：果实成熟后，对每个单株所有果荚横纵径用数显游标卡尺进行测量，取其平均值作为该株牡丹的果荚横纵径(mm)。

4)果荚纵径：果实成熟后，对每个单株所有果荚纵径用数显游标卡尺进行测量，取其平均值作为该株牡丹的果荚纵径(mm)。

5)果形指数：果荚纵径(l)/横径(d)。

6)单株果角数：测量单株所结每个果荚的果角数，取平均值作为该株植株的果角数。

7)坐果率：测量单株所败育果荚的果角数。

8)单株种子数：待果荚自然开裂后，清点每株植株果荚内种子数。

9)单株产量：即该株牡丹所结全部种子的总重(g)。

10)百粒重：结果数占开花数的百分比。

3主成分分析

对候选植株进行主成分分析，根据主成分分析计算出各类指标的贡献率，得到主成分方程，以每类主成分对应的贡献率占累计贡献率的比例作为权重，代入方程计算出候选植株的综合得分，按照由大到小的顺序排列，得到综合排名。

4基因多态性分析

1)dna提取

采用ctab法提取油用牡丹基因组dna，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用分光光度法定量后在-20℃保存备用。

2)引物筛选

通过筛选得到多态性好、条带清晰的引物10条供pcr反应。

3)pcr扩增

papd-pcr反应体系的建立：dna模板(20ng/ul)1.0μl，10×taqgreenbuffer2.0μl，mgcl2(25mmol/l)1.6μl，引物(2.5μmol/l)0.8μl，dntps(2.5mmol/l)0.8μl，taqdna聚合酶(5u/μl)0.25μl，ddh2o定容20μl。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，36℃退火1min，72℃延伸1.5min，40个循环；最后72℃保温10min，4℃保存。

4)pcr产物的鉴定

pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离检测，经4sgelred核酸染料染色后在sn-nj0601凝胶成像分析系统上采集图像。

本发明的优点和积极效果是：

本发明提供一种适用于高产油用牡丹实生选种方法，通过基因多态性分析后可确定遗传物质是否发生改变，主要在花期、果期进行筛选，且测定指标较少，操作性简单、周期短、工作量小，选育植株准确性较高，便于推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例的优良植株的pcr扩增图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

选择天津市蓟州区国色天香牡丹园为基地，按照上述步骤进行操，在100亩地进行筛选，经过栽培及初选选取200株进行挂牌，经过复选后选取150株进行主成分分析进行排序，得到综合得分及排序，依据得分将150株油用牡丹进行分类，并将分类中优良株系进行基因多态性分析。

表1优良单株主成分分析

表2优良单株主成分分析得分

表3优良单株得分分类

表4优良单株及对照组多态性条带数目变化情况

通过本方法进行筛选的植株均为适和当地环境表现优良，单株产量高的植株，从基因多态性分析发现所选植株基因型较对照均有变化。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。