本发明涉及观赏植物生物技术领域，具体提供一种合欢体细胞胚诱导及植株再生的方法。
背景技术：
合欢(albizziajulibrissiondurazz.)又名夜合树，马缨花，芙蓉花树等，为豆科落叶乔木，高达16米。花淡红色，头状花序，多数，排列成伞房状，腋生或顶生。
合欢喜光，稍耐荫。喜温暖、湿润气候,耐寒力也较强，能适应多种气候条件，具有很强的生命力。耐干旱瘠薄，但以湿润肥沃的砂质土生长最好。根具根瘤菌，对瘠薄土壤有一定的改良作用,可作为绿化的先锋树种。合欢原产我国黄河、长江及珠江流域各省，华北甚至东北的辽宁省均有栽培。合欢是人们广泛栽培的风景树之一，其树冠成伞形，树皮光滑，羽状叶片优美，昼开夜合，十分清奇。入夏绿荫清幽，绒花吐艳，远看犹如红霞飘落，甚为美观。适于作为行道树，庭院栽植，在公园、池畔、水滨、河岸、小溪旁等。用于点缀风景，自然潇洒，亦可盆栽观赏。合欢树对各种有害气体均有较强的抗性，尤其适于用作大气污染比较严重地区的绿化树种。合欢具有较高的药用价值。合欢也具有丰富的营养价值。同时，合欢的木材纹理通直，结构细密，经久耐用，可制作家具、农具或用于造船建筑。
合欢传统繁殖方式主要为播种繁殖和扦插繁殖，但播种繁殖易产生变异，且繁殖速度较慢，扦插繁殖成活率低。近年来，随着细胞生物学和分子生物学等理论与技术的发展，利用体细胞胚胎发生技术，建立无性系是细胞工程中植株再生的重要途径之一。体细胞胚发生具有数量多、速度快、结构完整、再生率高和操作简单的特点。而且为研究植物细胞的分化、发育、全能性表达和遗传转化、突变体筛选提供了良好的基础。
前人对合欢组织培养和快繁的研究仅局限于用固体培养基来诱导嫩茎或种子萌发丛生芽。关于合欢体细胞胚诱导和植株再生的研究内容国内外尚无报道。为此，为建立更理想的合欢体细胞胚高频发生系统，提高其繁殖系数，本试验利用合欢不同器官诱导产生体细胞胚，实现植株再生，为快速繁殖提供了一种新途径。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种合欢体细胞胚诱导及植株再生的方法，本发明通过自主研发的体细胞胚诱导方法，成功诱导出了胚状体并萌发发育成苗。
本发明提供一种合欢体细胞胚诱导及植株再生的方法，包括：
步骤1)合欢无菌实生苗的培养及外植体的选取；2)体细胞胚的诱导；3)体细胞胚的分化；4)体细胞胚的诱导生根；5)移栽成苗。
进一步地，针对步骤1)，其特征在于，实生无菌苗的培养具体为：将合欢的种子在培养箱内培养进行发芽实验，将发芽的种子经无菌处理后接种到培养基中培养，获得无菌实生苗；所述外植体为实生无菌苗的真叶、子叶、下胚轴；所述培养基为：ms+b5+6-ba+iba。
进一步地，针对步骤2)，其特征在于，体细胞胚的诱导具体为：将步骤1)所得无菌实生苗的真叶、子叶或下胚轴剪成1.5-2.0mm的小块，接种在诱导体细胞胚的培养基上，在恒温黑暗条件下诱导体细胞胚。
所述步骤2)中，体细胞胚诱导培养基为：ms+2.0mg/l6-ba+0.3mg/liba。
进一步地，针对步骤3)，其特征在于，体细胞胚的分化具体为：将步骤2)所得的胚性愈伤组织接种在体细胞胚分化培养基上，在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下进行培养。
所述步骤3)中，体细胞胚分化培养基为：b5+1.0-2.0mg/l6-ba+0.3mg/liba或ms+1.0-2.5mg/l6-ba+0.3mg/liba，优选为b5+1.5mg/l6-ba+0.3mg/liba或ms+1.0mg/l6-ba+0.3mg/liba。
进一步地，针对步骤4)，体细胞胚的诱导生根具体为：当步骤3)中的幼苗长到3cm以上时，将幼苗接种到诱导生根的培养基中，在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下进行培养。
诱导生根培养基为：1/2ms+0.5-3.0mg/lnaa或1/2ms+1.0-3.0mg/liba。
进一步地，针对步骤5)，其特征在于，移栽成苗具体为：当步骤4)中的幼苗根长达到1.5-2.0cm，有3片真叶展开时，经炼苗后移栽。
所有培养基中的加添的蔗糖浓度均为30g/l，琼脂均为9g/l，ph均为5.7-5.8。
此外，本发明还公开了以上任一所述的合欢体细胞胚诱导及植株再生的方法在合欢遗传转化体系建立、原生质体培养、优良无性系繁殖、基因工程和突变体筛选中的用途。
本发明的有益效果在于：
本发明首次提出观赏植物合欢体细胞胚诱导及植株再生的方法，为合欢通过体细胞胚发生方式获得再生植株提供了一种方便、快捷和有效的方法，通过该方法在短时间内大量获得再生植株，为木本植物合欢快速繁殖、再生植株体系建立及转基因技术研究提供了物质基础和技术方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为外植体在体细胞胚诱导培养基上形成的胚性愈伤组织；
图2为外植体在体细胞胚诱导培养基上培养10天时，胚性愈伤组织中形成球形胚性细胞；
图3为外植体在体细胞胚诱导培养基上形成的球形胚；
图4为外植体在体细胞胚诱导培养基上形成的心形胚；
图5为外植体在体细胞胚诱导培养基上形成的鱼雷胚；
图6为外植体在体细胞胚诱导培养基上形成的子叶胚；
图7为体细胞胚在分化培养基上培养14天后形成胚芽；
图8为体细胞胚在分化培养基上分化形成植株。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明所述内容作进一步详细说明。但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或更变，均应包括在本发明的范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、合欢实生无菌苗的培养及外植体的选取
合欢种子来自于河北科技师范学院绿化园区。将合欢的种子用刀片切割(种脐对面)一缺口，在培养箱内培养，温度为25±1℃，进行发芽实验。每天冲洗一遍并换吸水纸。将发芽后的合欢种子用流水冲洗1d后用75％的酒精迅速冲30s，然后浸入体积分数为0.1％的hgcl2溶液中10min，用玻璃棒轻轻的翻动，使材料均匀消毒。在超净工作台上用无菌水冲洗3～5次，将种子接种到ms+b5+0.5mg/l6-ba+0.3mg/liba的培养基中。培养温度为(25±2)℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间12h/d。
选取实生无菌苗的真叶作为外植体。
实施例2、体细胞胚的诱导
将实施例1中的实生无菌苗的真叶、子叶或下胚轴剪成1.5-2.0mm的小块，接种在体细胞胚诱导培养基上，每种培养基接种40段。体细胞胚诱导培养基在ms或b5培养基中加入不同种类的激素，如下所示：
(1)b5+2.0mg/l2,4-d+0.1mg/lnaa
(2)b5+2.0mg/l2,4-d+0.5mg/lkt
(3)b5+0.5mg/l6-ba+0.3mg/liba
(4)b5+1.0mg/l6-ba+0.3mg/liba
(5)b5+2.0mg/l6-ba+0.3mg/liba
(6)ms+0.5mg/l6-ba+0.3mg/liba
(7)ms+1.0mg/l6-ba+0.3mg/liba
(8)ms+2.0mg/l6-ba+0.3mg/liba
并且，培养基中含3％的蔗糖，加琼脂前将ph调至5.7-5.8，随后在121℃、压力101kp高温、高压条件下灭菌15分钟。恒温(24±1)℃黑暗条件下分别培养40天以上至诱导出体细胞胚。
8种培养基均使合欢真叶碎片形成愈伤组织，诱导率100％，且前7天表现相似，叶片开始卷曲并形成愈伤，15天后愈伤上有绿色体细胞胚产生，30天后有大量体细胞胚发生，但是(1)和(6)号培养基没有诱导产生体细胞胚。(7)号培养基诱导出的体细胞胚数量最多,平均体胚数为11.18，但其愈伤诱导率并不高，仅有47.83％(表1)。以真叶为外植体时，体细胞胚诱导培养基优选为ms+2.0mg/l6-ba+0.3mg/liba。以真叶为外植体时，诱导效果最好。
将合欢子叶接种于体细胞胚诱导培养基中，7天后子叶发生卷曲并有少量绿色瘤状突起。12天时各个培养基中都有黄绿色愈伤出现，有些能够观察到体细胞胚产生。但直到40天时，(1)、(2)和(4)号仍未出现体细胞胚，而是产生白色愈伤，并有根的分化。。(7)号培养基中产生的平均体细胞胚数最多，达5.95，诱导率也最高，达77.78％，愈伤颜色以黄绿和白色为主。以子叶为外植体时，体细胞胚诱导培养基优选为ms+1.0mg/l6-ba+0.3mg/liba。
将合欢下胚轴接种于体细胞胚诱导培养基中，3天后下胚轴在各个培养基中都有不同程度的膨大。8天后，(6)号培养基中下胚轴有白色愈伤长出。20天后，可以看到各种培养基中都有白色愈伤出现，并且大多有体细胞胚长出。30天后，可见愈伤组织上有绿色的胚芽产生。其中以(3)号培养基中产生的体细胞胚数最多，平均每个外植体达到4.60个体胚，而诱导率却只有86.67％。相应地(2)号处理的诱导率最高达100％，但体胚数只有0.13。(1)号培养基中体细胞胚诱导效果最差，可能是由于培养基中只含有生长素而不含细胞分裂素的缘故。以下胚轴为外植体时，体细胞胚诱导培养基优选为ms+0.5mg/l6-ba+0.3mg/liba。
表1不同器官对体胚产生的影响单位：mg·l-1
当培养基基本成分相同时，附加生长素2,4-d对诱导愈伤组织有促进作用，即(2)号培养基诱导率最佳，达到75％，但体细胞胚的发生却很少，仅有0.43；(1)号培养基虽然有愈伤产生，但60天后仍没有体细胞胚形成。由此可见，细胞分裂素对体细胞胚发生是必需的。当培养基基本成分不同时，不同激素配比组合对体细胞胚发生的影响不同。ms基本培养基附加1.0mg/l6-ba和0.3mg/liba时的平均体细胞胚数最多，达到20.75；而b5基本培养基附加0.5mg/l6-ba和0.3mg/liba时体细胞胚数最多，达到16.87。因此，基本成分不同时，诱导体细胞胚发生的最佳激素组合不同(表2)。
表2不同激素配比对体胚发生的影响单位：mg·l-1
组织细胞学结合实体观察表明：体细胞胚的发生经历几个阶段，即先在外植体上形成胚性愈伤(图1)，颜色多为白色或乳白色，切片观察发现此时的细胞为许多无序的薄壁细胞。14天后压片观察发现愈伤组织中出现具分化能力的球形胚性细胞，其细胞质浓，细胞核明显(图2)；实体观察发现愈伤表面有球状突起，随着时间的推移，先后可以观察到球形胚(图3)、心形胚(图4)、鱼雷胚(图5)和子叶胚(图6)。实体显微镜观察到球形突起由透明到不透明，颜色由淡黄转黄，进而转绿，最终可以形成成熟的体细胞胚。
实施例3、体细胞胚的分化
将实施例2中诱导的体细胞胚接种在原培养基中继代，使体胚数不断增加。然后接种于体胚分化培养基中，胚性愈伤组织诱导培养基在ms或b5培养基中加入不同种类的激素，如下所示：
(1)b5+0.5mg/l6-ba+0.3mg/liba
(2)b5+1.0mg/l6-ba+0.3mg/liba
(3)b5+1.5mg/l6-ba+0.3mg/liba
(4)b5+2.0mg/l6-ba+0.3mg/liba
(5)b5+2.5mg/l6-ba+0.3mg/liba
(6)b5+3.0mg/l6-ba+0.3mg/liba
(7)ms+0.5mg/l6-ba+0.3mg/liba
(8)ms+1.0mg/l6-ba+0.3mg/liba
(9)ms+1.5mg/l6-ba+0.3mg/liba
(10)ms+2.0mg/l6-ba+0.3mg/liba
(11)ms+2.5mg/l6-ba+0.3mg/liba
(12)ms+3.0mg/l6-ba+0.3mg/liba
5天后，部分体细胞胚开始萌动，14天后所有培养基中的体细胞胚均开始萌动，有的体细胞胚分化形成胚芽(图7)。30天时，以b5为基本成分的处理中，(3)号培养基中体细胞胚分化率最好，达87.5％；(6)号培养基处理最差，分化率仅有50.0％，差异达37.5％。以ms为基本培养基时，(8)号的体细胞胚分化率最高，为82.9％；(7)号培养基的体细胞胚分化率最差，为58.6％，差异达24.3％。并且随6-ba浓度的升高幼苗分化率下降平缓(表3)。由此可见，培养基基本成分不同，体细胞胚分化效果存在差异。在体细胞胚分化过程中，大部分的体细胞胚只分化成无根的幼苗，但也有处理中出现两极生长(图8)。
纵观12种培养基，不同的基本培养基成分，与不同质量浓度的细胞分裂素组合，对合欢体细胞胚分化效果不同。以b5为基本成分的组合，细胞分裂素6-ba的质量浓度在1.0-2.0范围内其分化率在75.0％-87.5％之间。而以ms为基本成分的组合，6-ba的质量浓度在1.0-2.5之间，其分化率在71.4％-82.9％。
表3不同浓度的6-ba对体细胞胚分化的影响单位：mg·l-1
实施例4、体细胞胚的诱导生根
当实施例3中体胚分化的无根芽长到3cm以上时，将无根芽切下接种到诱导生根培养基中。诱导生根培养基在1/2ms培养基中加入不同种类的激素，如下所示：
(1)1/2ms+0.1mg/lnaa
(2)1/2ms+0.5mg/lnaa
(3)1/2ms+1.0mg/lnaa
(4)1/2ms+2.0mg/lnaa
(5)1/2ms+3.0mg/lnaa
(6)1/2ms+0.1mg/liba
(7)1/2ms+0.5mg/liba
(8)1/2ms+1.0mg/liba
(9)1/2ms+2.0mg/liba
(10)1/2ms+3.0mg/liba
(11)1/2ms0
并且，培养基中含3％的蔗糖，1％琼脂，加琼脂前将ph调至5.7-5.8，随后在121℃、压力101kp高温、高压条件下灭菌15分钟。在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下诱导体细胞胚生根。培养20天时调查生根率，并观察根质。
接种9天后便可以生根，但不同的生长素种类和浓度对诱导生根速度，根条数及根素质等方面存在差异。接种20天后观察，在以1/2ms为基本成分的11个处理中，加入不同质量浓度naa的五个处理中，(2)号和(5)号的生根率最大，达到90.0％，但两个处理所生的根不同，(2)号处理的平均根长达到1.30cm，平均根数为3.5条/株，根质以细长根毛多为主；(5)号的平均根长0.64cm，平均根数16.7条/株，根质以短粗愈伤根为主，根毛很少。这说明，naa的浓度高对合欢幼苗生根有抑制作用。加入iba的5个处理中，(10)号的生根率最高,达到100％，平均根长为1.60cm，平均根数11.8条/株，但根有愈伤化的出现，其根质差。(8)号处理的生根率为93.3％，根长适宜，平均根数3.2条/株，根质以细长多根毛为主。两种生长素相比较，naa的生理活性强，根粗且根毛相对较少，愈伤化明显；iba的生理活性弱，根细长且根毛多，愈伤化轻。对照的生根率为65.0％，说明合欢的生根力强，不加任何激素也能生根(表4)。
表4不同生长素对幼苗生根的影响单位：mg·l-1
实施例5、移栽成苗
当实施例4中(8)号生根培养基上的幼苗根长达到1.5～2.0cm，有3片真叶展开时，可以将小苗移栽入已灭菌的蛭石中。移栽时将根部的培养基冲洗干净，并尽量少损伤根系。移栽后浇透水，防止小苗失水死亡，加盖薄膜，保持水分在80％-90％之间，温度为24±1℃。在小苗展开新叶前，每天喷洒清水，待有新叶长出后可以适量施用营养液，促进苗壮。移栽成活率均达94.2％。