一种褪黑素增强棉花种子抗旱性的方法及应用与流程

[0001]
本发明涉及干旱胁迫下棉花种子生长研究技术领域，尤其涉及一种褪黑素增强棉花种子抗旱性的方法及应用。


背景技术：

[0002]
棉花(gossypium hirsutuml.)是我国重要的经济作物，其产区集中到北方干旱或半干旱地区。干旱是限制世界很多地区作物生长和产量形成的主要因素，其损失超过任何其他单一环境因素。然而，全球气候的不断变化正是加重这一趋势。
[0003]
种子萌发是植物生命周期中的起始阶段，种子内部生理生化系统在萌发过程中相互作用，促进种胚发育，诱导出苗。种子萌发吸胀期遭遇干旱胁迫，吸水量减少，是造成出苗率降低的主要原因。干旱逆境从多方面抑制了种子萌发：干旱缺水加剧了种皮机械化，致使种皮吸水性能减弱，限制了种子萌发；干旱胁迫则使种子内的活性氧过量产生，引起核酸和蛋白质的过氧化损伤，破坏了种子细胞膜结构，可能导致种子中抗氧化酶活性降低；干旱胁迫破坏了aba分解代谢和ga生物合成的动态平衡，严重影响了种子萌发；干旱胁迫导致细胞膜透性变化、生理代谢紊乱，抑制种子萌发，甚至可能导致死亡。如何促进干旱胁迫下棉花种子萌发及产量形成，提高棉花种子抗旱性成为棉农关注的焦点。利用高效的植物生长调节剂对种子进行预处理，从而提高种子活力及抗逆性，是农业生产中的有效措施。
[0004]
褪黑素(melatonin，mt)是一种具有多种生物学功能的吲哚类激素，1969年首次证明存在于植物体内。褪黑素在植物中具有广泛的生理作用，能够调节植物的昼夜节律和光周期、参与非生物胁迫、促进种子萌发及幼苗生长、促进不定根的形成、清除活性氧自由基、保护组织细胞、增加渗透调节物质含量、提高抗氧化酶活性等。因此，本发明旨在探究干旱胁迫下外源褪黑素对棉花种子萌发及其生理机制的影响，旨在探索利用外源褪黑素来缓解干旱胁迫对作物的损伤，为提高干旱胁迫下棉花的出苗率提供理论指导及科学依据。
[0005]
中国发明cn201710168853.x中，提供了一种提高冬小麦幼苗抗旱能力的种子播前处理方法，其对处理好的小麦种子使用褪黑素溶液进行浸种处理，以提高小麦种子的抗旱性。
[0006]
中国专利cn201510130846.1中，提供了一种玉米抗旱浸种液，由褪黑素、l-天冬氨酸、氢氧化钾、乙醇和水混合溶解而成。但是，小麦和玉米与棉花，三者是三种完全不同的农作物，玉米和小麦是单子叶植物，棉花是双子叶植物，而且三者种子的解剖结构、生长条件、生理活性等方面均有显著差异，所以，并不能从现有技术中预测褪黑素对棉花种子具有怎样的影响，更不能显而易见的得知褪黑素对棉花种子的抗旱性具有怎样的作用。
[0007]
因此，如何提供将褪黑素应用于增强棉花种子抗旱性中，以提高干旱胁迫下棉花种子发芽势、发芽率、胚根长度等，从而促进棉花种子萌发，是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

[0008]
有鉴于此，本发明提供了一种褪黑素在增强棉花种子抗旱性中的应用，探讨褪黑素浸种在维持干旱胁迫下棉花种子萌发的生理机制，为在生产中促进棉花在旱地种植时种子萌发出苗提供实用技术。
[0009]
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0010]
本发明的第一个目的是提供一种褪黑素在增强棉花种子抗旱性中的应用。
[0011]
本发明的另一个目的是提供一种褪黑素增强棉花种子抗旱性的方法，在恒温培养箱中，使用褪黑素对棉花种子浸种12～24h，然后再将上述浸种后的棉花种子进行在恒温培养箱中进行黑暗培养。
[0012]
优选的，使用浓度为10～100μm褪黑素进行浸种。
[0013]
进一步优选的，使用浓度为100μm褪黑素进行浸种。
[0014]
优选的，所述恒温培养箱的温度设置为25℃。
[0015]
优选的，所述黑暗培养的时间为7d。
[0016]
优选的，所述棉花种子品种为任意品种的棉花种子。
[0017]
进一步优选的，所述棉花种子品种为国欣棉9号。
[0018]
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0019]
1、本发明保护了褪黑素在抗旱胁迫棉花种子萌发中的应用。经应用结果显示，适当浓度褪黑素浸种能够促进干旱胁迫下棉花种子萌发，100μm褪黑素对种子萌发的促进效果最佳，与对照相比，100μm褪黑素浸种处理下棉花种子发芽率显著提高10.42％。100μm褪黑素浸种缓解了干旱胁迫对棉花种子萌发及生长的抑制效应，在干旱胁迫下褪黑素浸种下种子的发芽势、发芽率、胚根长度和鲜重较水浸种分别显著增加8.9％、9.8％、7.62％和13.37％。
[0020]
褪黑素处理能够增强干旱胁迫下种子中抗氧化酶活性，减少ros积累，提高渗透调节物质含量，调控激素代谢平衡，进而促进棉花种子萌发。此外，褪黑素浸种减轻了种皮的机械化程度，提高了种皮气孔数量及开张度，增强了种子吸水性能。
[0021]
由本发明的技术方案可知，褪黑素可提高干旱胁迫下棉花种子发芽势、发芽率、胚根长度及鲜重，增强干旱胁迫下棉花种子中抗氧化酶活性，缓解干旱胁迫下棉花种子过氧化损伤，提高干旱胁迫下棉花种子渗透调节物含量，调节干旱胁迫下棉花种子激素含量，改变棉花种皮微观结构，从而促进棉花种子萌发。
附图说明
[0022]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0023]
图1附图为干旱胁迫下种子的发芽率随褪黑素浓度的变化趋势；
[0024]
图2附图为褪黑素浸种对干旱胁迫下种子发芽势、发芽率、胚根长度及鲜重的影响；
[0025]
图3附图褪黑素浸种对干旱胁迫下棉花种子抗氧酶活性的影响；
[0026]
图4附图为褪黑素浸种对干旱胁迫下棉花种子ros积累的影响；
[0027]
图5附图为褪黑素浸种对干旱胁迫下棉花种子渗透调节物质含量的影响；
[0028]
图6附图为褪黑素浸种对干旱胁迫下棉花种子内源激素含量的影响；
[0029]
图7附图为褪黑素浸种对棉花种皮微观结构的影响。
具体实施方式
[0030]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0031]
实例中采用国欣棉9号为试验材料，褪黑素(mt)纯度为99％，购自美国sigma公司。
[0032]
实例1、一种褪黑素缓解棉花种子干旱胁迫中的应用。方法流程：
[0033]
一、试验设计
[0034]
选取饱满且胚完整、大小一致的棉花种子用75％的乙醇消毒10min，蒸馏水冲洗5次后用3％次氯酸钠消毒10min，用蒸馏水反复冲洗干净。将消毒后的种子浸泡于不同浓度的褪黑素溶液(0、10、50、100、200、500μm)中24h，温度为25℃，避光处理。浸种后用蒸馏水冲洗3次，将种子冲洗干净，用滤纸将种子表面水分吸干后开展发芽试验。每个培养皿底部铺3层定量滤纸，均匀摆放50粒种子，加10mlpeg-6000溶液，置于25℃恒温培养箱中，黑暗培养7d，每个处理5次重复。记录种子萌发数量。根据发芽率、发芽势、胚根长度和鲜重确定促进种子萌发的最适褪黑素浓度。
[0035]
二、试验处理
[0036]
利用预实验中筛选出的最适浓度(100μm)的褪黑素浸种24h，以蒸馏水浸种作为对照(0μmmt)，以10％peg-6000模拟干旱胁迫。每个培养皿50粒种子，每个处理5次重复。试验处理如下：
[0037]
①
w：为水浸种+0％peg-6000，即0μmmt+0％peg-6000；
[0038]
②
w+ds：水浸种+10％peg-6000，即0μmmt+10％peg-6000；
[0039]
③
mt：褪黑素浸种+0peg-6000，即100μmmt+0％peg-6000；
[0040]
④
mt+ds：褪黑素浸种+10％peg-6000，即100μmmt+10％peg-6000。
[0041]
种子萌发至2d、4d、6d，分别对不同处理的种子进行取样(剥种皮后取胚+胚根)。混匀后，准确称取0.3g，3个生物学重复，液氮速冻，然后存放于-80℃冰箱备用。样品采集完全后统一测定抗氧化酶活性、ros、渗透调节物以及激素含量。
[0042]
三、种子萌发及生理指标测定
[0043]
1种子萌发及生长指标测定
[0044]
试验过程中每天观察并记录种子萌发数量。发芽势(gp)＝(第3d萌发的种子数/供试种子数)
×
100％；发芽率(gr)＝(第7d萌发的种子数/供试种子数)
×
100％；发芽指数(gi)＝∑(gi/i)，gi为在第i天种子萌发的数量；活力指数(vi)＝gi
×
rl，rl为萌发第7d种子的胚根长度。
[0045]
萌发后第7d取样，每个处理设置5次重复，每个重复中各取10粒种子，用直尺测量胚根长度。种子萌发试验结束当天，每个处理取50粒种子，吸水纸吸干表面水分后，用分析
天平称量鲜重。
[0046]
2生理指标测定
[0047]
测定所取种子样品的超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)活性、过氧化物酶(peroxidase,pod)活性、过氧化氢酶(catalase,cat)活性，过氧化氢(h2o2)含量、超氧阴离子(o2-)含量，脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量，所用试剂盒均购置于南京建成生物工程研究所。
[0048]
3 aba和ga3含量测定
[0049]
采用由中国农业大学提供的包被板条，用酶联免疫吸附法(elisa)在酶标仪上测定492nm处吸光值，logit曲线作图并计算激素含量。
[0050]
4种皮微观结构观察
[0051]
取新鲜的种子样品在4℃条件下用预冷的3％戊二醛固定12h。吸出固定剂，用pbs浸洗2次，每次10min，然后在4℃下用预冷的1％锇酸固定1h，用pbs清洗2次。用丙酮/醋酸异戊酯(1:1)脱水10min，再用连续稀释的乙醇(30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％)，每个乙醇浓度脱水2次，每次15min。用二氧化碳将样品干燥至临界点。样品被安置在离蒸发源约10-15cm处的样品台上，喷金，完成后在su-8020扫描电镜下进行观察、拍照。
[0052]
四、数据处理和分析
[0053]
试验数据统计分析采用microsoftexcel2016进行原始数据处理，用spss statistics17.0分析软件进行单因素方差分析，选用duncan方法进行多重比较及差异显著性检验，差异显著性p<0.05，图中的字母不同表示差异有统计学意义，使用graphpad prism8.0进行绘图。
[0054]
五、测定结果
[0055]
1不同浓度褪黑素对干旱胁迫下种子萌发特性的影响
[0056]
图1显示，干旱胁迫下种子的发芽率随褪黑素浓度的提高呈先上升后下降的趋势。与0μm相比，低浓度褪黑素对种子萌发的影响较小，在10、50μm褪黑素处理下，棉花种子发芽率较水浸种分别增加了5.56％、2.08％。当褪黑素浓度为100μm时，种子发芽率最高为79.58％，较水浸种提高了10.42％。浓度为200、500μm褪黑素处理与0μm褪黑素处理相比，发芽率分别下降了12.22％、29.86％，显著抑制了棉花种子的萌发(p<0.05)。100μm褪黑素浸种可促进干旱胁迫下种子萌发。
[0057]
2褪黑素浸种对干旱胁迫下种子发芽势、发芽率、胚根长度及鲜重的影响
[0058]
图2显示，干旱胁迫降低种子发芽势和发芽率。与水浸种相比，褪黑素浸种处理显著提高了干旱胁迫下种子的发芽势，与w+ds相比，mt+ds处理下棉花种子发芽势增加了8.9％。干旱胁迫下，褪黑素浸种提高了棉花种子的发芽率，mt+ds处理的发芽率较w+ds处理提高了9.8％。100μm褪黑素浸种处理对种子发育具有促进作用。在干旱胁迫下，褪黑素浸种明显缓解了干旱胁迫对棉种生长的抑制。mt+ds的胚根长度和鲜重为6.78cm和17.63g，与w+ds处理相比分别增加了7.62％和13.37％，具有显著性差异。3褪黑素浸种对干旱胁迫下棉花种子抗氧酶活性的影响
[0059]
由图3a可知，各处理的sod活性均呈先升高后降低的变化趋势，萌发4d时，sod活性最高。在无胁迫条件下，mt处理的sod活性在萌发2d、4d、6d时，分别比w提高了3.34％、2.56％、6.34％。干旱胁迫导致sod活性降低，经褪黑素处理后sod活性增强。与w+ds相比，mt
+ds处理的sod活性在萌发2d、4d、6d时分别增加了5.7％、2.9％、6％。
[0060]
图3b所示，褪黑素浸种提高了棉种内pod活性，萌发2d、4d、6d时，与w处理相比mt处理的pod活性分别增加了45.38％、38.74％、17.9％。褪黑素浸种增强了干旱胁迫下pod活性，mt+ds处理的pod活性显著高于w+ds处理。在萌发2d、4d时，mt+ds处理的pod活性较w+ds处理分别提高了28.28％和36.2％，具有显著差异。萌发至6d时，mt+ds的pod活性增加了0.56％。
[0061]
图3c所示，干旱胁迫下cat活性降低，褪黑素浸种明显提高了干旱胁迫下棉种中cat活性。种子萌发2d、4d、6d时，mt+ds的cat活性较w+ds分别提高了1.16％、46.08％、25.49％。
[0062]
4褪黑素浸种对干旱胁迫下棉花种子ros积累的影响
[0063]
由图4a可知，干旱胁迫明显增加了棉种内h2o2。然而，外源褪黑素浸种均有效降低了棉种内h2o2含量。在无干旱胁迫处理下，种子萌发2d、4d、6d时，mt处理下h2o2含量与w处理相比，分别降低24.44％、4.33％、31.61％。在peg-6000胁迫下，与w+ds相比，mt+ds处理的h2o2含量分别降低37.91％(2d)、2.85％(4d)、30.3％(6d)。
[0064]
由图4b所示，褪黑素浸种也能降低棉种内o
2-含量。当种子在干旱胁迫下萌发时，mt+ds处理的o2-含量比w+ds处理下降了6.19％(2d)，差异未达显著性水平。萌发至第2d和6d时，与w+ds处理相比，mt+ds处理的o
2-含量分别降低了6.81％和2.86％，且具有显著性差异。
[0065]
5褪黑素浸种对干旱胁迫下棉花种子渗透调节物质含量的影响
[0066]
如图5a所示，干旱胁迫提高了棉种中脯氨酸含量。外源褪黑素对干旱胁迫下脯氨酸含量的积累具有明显的促进作用。在不同萌发时期，褪黑素浸种后脯氨酸含量较高，与w+ds处理相比，在萌发第2d、4d、6d，mt+ds处理的脯氨酸含量分别增加了7.11％、9.92％、3.08％。
[0067]
由图5b所示，随棉种萌发时间的延长，可溶性糖含量呈先升高后降低的趋势，干旱胁迫提高了可溶性糖含量，褪黑素浸种处理的可溶性糖含量要高于未施加褪黑素的处理。在干旱条件下，种子萌发2d、4d、6d时，mt+ds处理的可溶性糖含量分别比w+ds处理增加了6.91％、6.82％和6.89％。100μm褪黑素浸种也增加了正常水分下棉种内可溶性糖含量，在种子萌发第2d、4d和6d时，与w处理相比，mt处理的可溶性糖含量分别提高了16.37％、2.85％、28.22％。
[0068]
图5c所示。无论在正常或干旱条件下，褪黑素浸种都可以减小可溶性蛋白含量的降低趋势。在正常水分处理下，mt处理的可溶性蛋白含量在第2d、4d和6d分别比w处理提高了2.16％,5.03％和7.98％。在干旱胁迫下，与w+ds处理相比，mt+ds处理的可溶性蛋白含量分别提高了6.36％(2d)和7.95％(4d)。在萌发至第6d时，褪黑素浸种对干旱胁迫下蛋白含量的影响要比正常水分处理下显著。与w+ds处理相比，mt+ds处理的可溶性蛋白含量增加了5.22％。
[0069]
6褪黑素浸种对干旱胁迫下棉花种子内源激素含量的影响
[0070]
由图6a所示，ga3含量随萌发时间的推移呈逐渐升高的趋势，但干旱胁迫对ga3的生物合成产生了抑制影响。干旱胁迫下褪黑素浸种的ga3含量明显高于水浸种处理。干旱胁迫下萌发第2d，mt+ds处理的ga3含量比w+ds处理升高了10.81％。萌发第4d时，与w+ds出相比，mt+ds处理的ga3含量增加了16.09％。在种子萌发末期(6d)，mt浸种进一步提高了干旱
胁迫下ga3含量。
[0071]
由图6b可看出，在任何培养环境下，褪黑素浸种均可加速aba的分解代谢。种子萌发期间，peg-6000诱导的干旱胁迫使得aba的分解代谢受到限制。在正常水分处理下，mt处理的aba含量要低于w处理。当种子萌发于干旱条件下，mt+ds处理的aba含量分别比w+ds处理降低了6.22％(2d)、4.2％(4d)、6.42％(6d)。
[0072]
7褪黑素浸种对棉花种皮微观结构的影响
[0073]
如图7a-c所示，干燥种子的种皮表明气孔很少。水浸种处理后，种子表皮会有少量气孔打开。然而，外源褪黑素浸种后，棉花种子的种皮气孔数量明显增加。从图中可以看出，种皮的气孔是位于不规则表皮表面的细胞脊之间，但气孔内侧未被表皮包围。干燥种子表皮的气孔呈椭圆形，没有凹陷(图7d)。经过蒸馏水浸种后，种皮气孔为椭圆形，向中间逐渐变为圆形，但内部保卫细胞被残余的角质层覆盖(图7e)。然而，褪黑素浸种处理对种子气孔的开张具有理想的效果。与干燥种子和水浸种处理相比，褪黑素浸种后，棉花种皮气孔呈完全开放状态，且具有较大的保卫细胞(图7f)。
[0074]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0075]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。