淀粉酶产色链霉菌代谢产物在防治浙麦冬黑斑病和炭疽病中的应用

1.本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种淀粉酶产色链霉菌代谢产物在防治浙麦冬黑斑病和炭疽病中的应用。


背景技术：

2.麦冬(ophiopogon japonicas)为百合科沿阶草属植物，临床上以其干燥块根入药。麦冬的有效成分为皂苷、黄酮、氨基酸以及多糖等物质，传统医学认为麦冬具有滋阴生津、润肺止咳等功效。现代药理学发现麦冬提取物可以消炎，麦冬多糖具有抗血栓、降血糖等作用，麦冬皂苷具有镇咳、抗氧化以及改善肝肺等作用。主要栽培地为浙江和四川，分浙麦冬和川麦冬，传统上认为浙麦冬质量为佳。如今对于麦冬药品的研究开发越来越多，各种剂型层出不穷，据浙江省中药材产业发展报告2015年时浙麦冬种植面积就达3933亩，开发的衍生中成药制剂如参麦注射液、生脉胶囊等产品年销售额达20多亿元，带来了巨大的经济效益。
3.然而浙麦冬产业的快速发展也带来了一些问题，如栽培技术不规范、农药使用不当等，这些问题严重影响了浙麦冬产量与质量，限制了浙麦冬的可持续发展。麦冬上常见的病害为黑斑病和炭疽病。调查发现化学防治仍然是浙麦冬种植地区的首要选择，但这也造成其成品药材农残超标、病原菌产生抗药性、种植环境被污染等种种问题。因此与环境相容性好的生物农药是防治中药材植物病害较佳的选择。淀粉酶产色链霉菌tz3
‑
1是本实验室通过核糖体工程选育获得的一株生防菌，其代谢产物包括核苷类抗生素和多烯大环内酯类抗生素，对多种病原真菌的菌丝生长均有较强的抑制作用。本发明通过菌丝生长速率法研究了该菌株代谢产物对浙麦冬黑斑病和炭疽病病原真菌的抑制作用，并进一步测定了其田间防效，发现该菌株代谢产物在防治浙麦冬黑斑病和炭疽病上作用比常规化学农药略优，为浙麦冬真菌病害生物防治提供新的手段。同时该发明也为微生物源农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对化学农药不安全与微生物源农药种类较少的不足，提供一株生防菌株淀粉酶产色链霉菌(streptomyces diastatochromogenes)代谢产物在防治浙麦冬黑斑病和炭疽病中的应用。
5.本发明目的通过以下技术方案来实现：
6.本发明首先公开了一种淀粉酶产色链霉菌(streptomyces diastatochromogenes)代谢产物在防治浙麦冬黑斑病和炭疽病中的应用；所述淀粉酶产色链霉菌(streptomyces diastatochromogenes)，编号为tz3
‑
1，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2019年12月3日，保藏登记号cgmcc no.19069。
7.根据本发明的一种实施方式，所述淀粉酶产色链霉菌(streptomyces diastatochromogenes)代谢产物直接作为防治浙麦冬黑斑病和炭疽病的药剂。
8.根据本发明的一种实施方式，所述淀粉酶产色链霉菌(streptomyces diastatochromogenes)代谢产物作为防治浙麦冬黑斑病和炭疽病的药剂中的组成成分。所述试剂还可以包括其它有利于防治杭白菊叶枯病和黑斑病的活性组分或可选的辅助组分，所述辅助组分指可接受的辅料，典型而非限定的，例如为稳定剂、稀释剂。
9.作为优选的，所述淀粉酶产色链霉菌(streptomyces diastatochromogenes)代谢产物通过如下步骤制备：
10.1)将淀粉酶产色链霉菌tz3
‑
1菌种在28℃
±
1℃条件下活化培养；
11.2)发酵培养液灭菌后，冷却，无菌条件下接种淀粉酶产色链霉菌tz3
‑
1，在28℃
±
1℃条件下，发酵培养，发酵液经离心后取上清液，上清液即作为淀粉酶产色链霉菌代谢产物。
12.作为优选的，所述的发酵培养液组成为：每1000ml中含有可溶性淀粉20g，caco
3 5g，kh2po4 3g，nh4cl 3g，fecl
2 1g，黄豆粉43g，酵母浸膏4g，麦芽提取物6g，余量为水。
13.作为优选的，离心所得上清液经0.22μm膜过滤后作为淀粉酶产色链霉菌代谢产物。
14.与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
15.1)黑斑病和炭疽病为麦冬上常见的病害；现有技术中缺乏可以同时有效防治两种病害的生物源试剂，本发明发现了淀粉酶产色链霉菌tz3
‑
1菌种的代谢产物可以用于同时防治浙麦冬黑斑病和炭疽病；相比于化学防治造成的种种问题，本发明为生物源试剂，环境相容性好，为浙麦冬真菌病害生物防治提供新的手段。
16.2)田间防效测定实验结果表明100％tz3
‑
1代谢产物对麦冬黑斑病和炭疽病均有较好的田间防治效果，校正防效分别可达74.08％和84.37％。50％tz3
‑
1和50％的多菌灵对麦冬黑斑病的田间防效无显著性差异。由此可知，本发明提供的淀粉酶产色链霉菌tz3
‑
1菌种的代谢产物相比于常规化学农药，其在防治浙麦冬叶枯病和黑斑病上的作用更优。
具体实施方式
17.实施例1：(淀粉酶产色链霉菌tz3
‑
1的液体发酵)
18.淀粉酶产色链霉菌(streptomyces diastatochromogenes)tz3
‑
1由淀粉酶产色链霉菌d经核糖体工程选育获得，具体见申请的发明专利(申请号：2019114179541)。
19.发酵培养液为每1000ml中含有可溶性淀粉20g，caco
3 5g，kh2po4 3g，nh4cl 3g，fecl
2 1g，黄豆粉43g，酵母浸膏4g，麦芽提取物6g，余量为水；每300ml三角瓶装60ml发酵培养液，配制后121℃灭菌20min，待冷却至50℃，无菌条件下挑取一铂金环淀粉酶产色链霉菌d或相应突变株接种，28℃
±
1℃，发酵培养5天；发酵液经5000r/min离心10min，上清液经0.22μm膜过滤后用于抑菌活性测定和田间防效试验。
20.实施例2：(淀粉酶产色链霉菌tz3
‑
1代谢产物抑菌活性测定)
21.取经0.22μm膜过滤后的发酵上清液1ml于无菌培养皿内，与9ml冷却至50℃的pda培养基迅速混匀，冷却后在培养基平面分别放1个直径为5mm的供试菌菌饼，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9cm)，置培养箱中28℃培养36h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采
用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率：菌丝生长抑制率(％)＝[(对照菌落直径
‑
5)
‑
(处理菌落直径
‑
5)]/(对照菌落直径
‑
5)
×
100％。
[0022]
测定结果表明：淀粉酶产色链霉菌(streptomyces diastatochromogenes)tz3
‑
1代谢产物对供试2种病原真菌菌丝生长都有较好的抑制效果，且抑制率均为98％以上。
[0023]
表1淀粉酶产色链霉菌tz3
‑
1代谢产物对浙麦冬真菌病害病原真菌的抑制效果
[0024][0025]
其中，表1中的抑制效果(％)
a
列数据为采用申请号cn201911417954.1中所述培养基和培养方法培养所得代谢产物对浙麦冬真菌病害病原真菌的抑制效果数据(该代谢产物为发酵液经离心所得的上清液，且未经分离四霉素z的步骤处理)，与本发明相比，由于液体发酵培养基不同，抑制效果有明显差异，利用本发明中的培养基和培养方法，代谢产物活性更高。
[0026]
实施例3：(淀粉酶产色链霉菌tz3
‑
1代谢产物田间防效测定)
[0027]
选择100％、50％的淀粉酶产色链霉菌tz3
‑
1代谢产物和50％的多菌灵作为田间防效测定的供试药剂，清水为阴性对照，且每块处理田之间用清水处理的阴性对照作间隔田。于7d调查发病情况，统计病情指数，计算校正防效。根据发病严重程度分为4级：0级，健康苗；1级，至少25％的叶片枯死；2级，26％～50％的叶片枯死；3级，51％～75％的叶片枯死；4级，76％～100％的叶片枯死。病情指数＝[∑(各级病株数
×
对应各级代表数值)/(调查总株数
×
发病最高级的代表数值)]
×
100；校正防效(％)＝100
×
(1
‑
(处理药后病指
×
对照药前病指)/(处理药前病指
×
对照药后病指))。
[0028]
实验结果(表2)表明：100％tz3
‑
1代谢产物对麦冬黑斑病和炭疽病均有较好的田间防治效果，校正防效分别可达74.08％和84.37％。50％tz3
‑
1和50％的多菌灵对麦冬黑斑病的田间防效无显著性差异。
[0029]
表2淀粉酶产色链霉菌tz3
‑
1代谢产物对浙麦冬真菌病害的防治效果
[0030][0031]
注：100％tz3
‑
1指直接发酵获得经0.22μm膜过滤的上清液；
[0032]
50％tz3
‑
1指100％tz3
‑
1上清液用无菌水体积比1:1稀释后的溶液；
[0033]
校正防效数值后不同小写字母表示不同生防药剂间防治效果存在差异显著(p<0.05)。