大型组织样品的无冰玻璃化和纳米升温的制作方法

大型组织样品的无冰玻璃化和纳米升温
1.相关申请的交叉引用
2.本非临时申请要求2019年11月7日提交的美国临时申请号62/931943的权益。
技术领域
3.本公开涉及细胞，组织和器官保存领域，特别是本发明涉及细胞材料的无冰玻璃化保存方法，其中纳米升温与有效量的mnp如2mg/ml fe mnp组合应用，以致力于增强保存后的细胞存活和组织功能。


背景技术：

4.为了保存样品、细胞或组织，通常使用冷冻保护剂溶液来防止在降温或解冻/升温过程中由于冷冻造成的损害。为了使冷冻保存有用，保存的样品应在保存后将其完整性和/或活力保持在合理的水平。因此，保存样品的过程应避免和/或限制细胞和/或组织结构的损伤或破坏。
5.玻璃化(即，在“玻璃样(glassy)”而不是结晶相中的冷冻保存储存)是用于组织储存和再生医学的重要使能方法，提供储存和运输用于各种生物医学用途的细胞，组织和器官的能力。在通过玻璃化进行的无冰冷冻保存中，通过存在高浓度的称为冷冻保护剂的化学物质来防止冰的形成，所述化学物质与水相互作用并替换水并因此防止水分子形成冰。
6.虽然最近在玻璃化组织或器官方面取得了进展，但是对于大体积组织或器官的成功复温存在各种挑战。首先，需要快加热速率以避免在升温期间允许结晶的任何条件。例如，取决于所使用的冷冻保护剂材料/组分，样品必须比临界升温速率更快地加热以避免形成冰。其次，在整个体积中需要均匀的加热速率以避免大的热梯度，这可能产生引起断裂或裂缝的热应力。最近，悬浮在vs55中的二氧化硅涂覆的氧化铁纳米颗粒已被用于成功玻璃化和再升温人真皮成纤维细胞，猪动脉和猪主动脉心脏瓣膜小叶组织。将体积高达80ml置于均匀交变磁场(amf)中，以在称为纳米升温的过程中通过磁滞加热纳米颗粒。参见n.manuchehrabadi等，使用磁性纳米颗粒的感应加热改善的组织冷冻保存(improved tissue cryopreservation using inductive heating of magnetic nanoparticles)，sci.transl.med.，2017。虽然这种方法已成功用于维持细胞和组织样品的活力和功能，但特别是在高浓度冷冻保护剂存在下保存的材料的细胞活力方面仍有改进的余地。


技术实现要素：

7.发现用有效量的mnp(例如2mg/ml fe mnp)补充具有高浓度冷冻保护剂(例如vs83)的无冰玻璃化制剂以及使用本文所述的纳米升温程序导致保存后增加的细胞存活和改善的组织功能。
8.因此，本技术提供了用于处理大体积细胞材料(包括例如大血管(例如肺动脉)或软骨)的新方法和新制剂，其中将有效量的磁性纳米颗粒(mnp)，例如2mg/ml fe mnp，和任选的糖，诸如二糖(例如海藻糖和/或蔗糖)加入到无冰玻璃化冷冻保护剂制剂中。补充有效
量的这些组分降低了降温期间和复温期间形成冰的风险，特别是当应用本文所述的纳米升温条件时。
9.附图简要说明
10.图1(a)和1(b)是关于纳米升温如何在50ml系统中维持猪关节软骨的软骨细胞活力所获得的数据的图示。图1(a)是通过alamarblue测定法(vs55为n＝2；vs70和vs83为n＝4)测量的标准化为对照(生长培养基中的新鲜组织)的猪关节软骨活力的图示；对于每个相应的样品(从最右边的样品(vs83+fe)开始：第4天＝从最右边的第一栏/列，第3天＝从最右边的第二栏/列；第2天＝最右边的第3栏/列；第1天＝最右侧的第4栏/列，第0天＝最右侧的第5栏/列；图1(b)是使用活/死染色测定法(sigma)(绿色/浅灰色：活细胞；红色/深灰色：死细胞)的在猪关节软骨上活的和死的软骨细胞分布的图示(vs83 n＝4；新鲜组织n＝2)。
11.图2是关于软骨台盼蓝排除结果获得的数据的说明(数据显示为平均值
±
1标准偏差，未观察到显著差异)。
12.图3是关于软骨的gag结果获得的数据的图示(保存在纳米升温的软骨(n＝4)中的gag含量)。
13.图4是关于软骨的低渗渗透性结果获得的数据的说明(对流和纳米升温的软骨均显示渗透性降低)。
14.图5是关于软骨(常规(左)，纳米升温(中)和新鲜(右))的聚集模量结果获得的数据的图示；纳米升温的软骨看起来类似于新鲜软骨(n＝3)。
15.图6是关于软骨(常规(左)，纳米升温(中)和新鲜(右))的水力渗透性结果获得的数据的图示。
16.图7是关于使用对流升温的玻璃化策略获得的数据的图示。
17.图8是在纳米升温的短期和长期储存之后获得的关于活力评估的数据的说明。
18.图9(a)和9(b)是关于在37℃浴中使用纳米升温或对流储存和升温后新鲜与无冰玻璃化动脉的爆破压力(图9(a)，mmhg)和线性模量(图9(a)psi)获得的数据的说明(结果是5-8个个体肺动脉的平均值
±
1se，与新鲜未处理的对照相比通过双尾t检验的统计学显著增加表示为
×
；没有观察到其他显著差异)。
19.图10是针对径向应变绘制的压力数据(psi)的图示，其产生典型的软组织变形的应力-应变曲线(典型曲线示出)；线性区域用于产生最佳线拟合，产生线性模量(mmhg，破裂前记录的最大压力用于估计爆破压力(psi)。
20.详细说明
21.术语和定义
22.在下面的描述中，提出了许多细节以提供对本公开的理解。然而，本领域技术人员可以理解，本公开的方法可以在没有这些细节的情况下实施，并且可能存在来自所述实施方式的许多变化或修改。
23.首先应该指出的是，在制定任何这样的实际实施方式时，可以作出许多具体的实施决定，以实现开发人员的具体目标，例如遵守与系统相关和与业务相关的约束，这些约束将彼此不同。此外，将理解的是，这样的开发工作可能是复杂且耗时的，但是对于本领域普通技术人员而言，具有本公开的益处将是常规的任务。另外，本文使用/公开的组合物还可以包含除所引用的那些之外的一些组分。在摘要和本详细说明中，每个数值应按照术语“约”进行修饰来读取(除非已经明确修改)，然后除非文中另有说明，否则再读取未修改的数值。
24.如本文所用，与数量有关的术语“约”包括所述值，并具有由上下文决定的含义。例如，它至少包括与测量特定数量相关的误差程度。当在范围的上下文中使用时，修饰语“约”也应被视为公开由两个端点的绝对值定义的范围。例如，“从约2到约4”的范围也公开了“从2到4”的范围。
25.除非本文另有明确说明，否则关于温度(℃)的修饰语“约”是指所述温度或温度范围，以及所述温度或温度范围(所述温度或一定温度范围的终点)
±
1-4％。关于细胞活力和细胞保留(％)，除非本文另有明确说明，否则关于细胞活力和细胞保留(％)的修饰语“约”是指所述值或值范围以及所述值或值的范围
±
1-3％。关于表达内容，例如，以百万分之几(ppm)或十亿分之几(ppb)为单位，除非本文另有明确说明，关于细胞活力和细胞保留(％)修饰语“约”是指所述值或值范围以及所述值或值范围
±
1-3％。关于以μg/ml为单位的表达内容，除非本文另有明确说明，否则关于μg/ml值的修饰语“约”是指所述值或值范围以及所述值或值范围
±
1-4％。关于摩尔浓度(m)，除非本文另有明确说明，否则关于摩尔浓度(m)的修饰语“约”是指所述值或值范围以及所述值或值范围
±
1-2％。关于降温速率(℃/min)，除非本文另有明确说明，否则关于降温速率(℃/min)的修饰语“约”是指所述值或值范围以及所述值或值范围
±
1-3％。
26.此外，在总结和本详细描述中，应该理解的是，列出或描述为有用，合适或类似的范围旨在包括对该范围内任何可想象的子范围的支持，至少因为每个点在该范围内，包括终点，应被视为已被陈述。例如，将“1到10的范围”读作指示沿着约1和约10之间的连续体的每个可能的数字。另外，例如，
±
1-4％将被读作指示沿着1和4之间的连续体的每个可能的数字。此外，本实施例中的一个或多个数据点可以组合在一起，或者可以与说明书中的数据点之一组合以创建范围，并因此包括该范围内的每个可能的值或数字。因此，(1)即使明确标识了该范围内的许多特定数据点，(2)即使对该范围内的几个特定数据点进行了引用，或者(3)即使未明确标识该范围内的数据点，应理解的是(i)发明人认同并理解该范围内的任何可想象的数据点应被认为已被指定，和(ii)发明人知晓整个范围，范围内的每个可想象的子范围，以及范围内的每个可想象的点。此外，本文适当地公开的本技术的主题可以在不存在本文未具体公开的任何元素的情况下实施。
27.除非另有明确说明，否则“或”是指包容性或而非专有或。例如，条件a或b满足以下任何一个：a为真(或存在)且b为假(或不存在)，a为假(或不存在)且b为真(或存在)，a和b都为真(或存在)。
28.另外，使用“一个”或“一种”来描述本文实施方式的元素和组分。这样做仅仅是为了方便并且根据公开内容给出一般的概念感。除非另有说明，否则此描述应读作包括一个或至少一个，单数也包括复数。
29.本文使用的术语和短语用于描述目的，不应被解释为范围限制。诸如“包括”，“包含”，“具有”，“含有”或“涉及”及其变体的语言旨在是广泛的，并且包括此后列出的主题，等价物和未列举的其他主题。
30.而且，如本文所用，对“一个实施方式”或“实施方式”的任何引用意味着与该实施方式有关的特定元素，特征，结构或特性包括在至少一个实施方式中。说明书中各个地方出
现的短语“在一个实施方式中”不一定是指相同的实施方式。
31.如本文所用，术语“室温”是指在标准压力下约18℃至约25℃的温度。在各种示例中，室温可以是约18℃，约19℃，约20℃，约21℃，约22℃，约23℃，约24℃或约25℃。
32.如本文所用，“细胞材料”或“细胞样品”是指含有细胞组分的活生物材料，无论该材料是天然的还是人造的，并且包括细胞，组织和器官，无论是天然的还是人造的。这些术语也意味着要冷冻保存的任何种类的活材料，例如细胞，组织和器官。在一些实施方式中，细胞，组织和器官可以是哺乳动物器官(例如人体器官)，哺乳动物细胞(例如人体细胞)和哺乳动物组织(例如人体组织)。
33.如本文所用，术语“器官”是指任何器官，例如肝，肺，肾，肠，心脏，胰腺，睾丸，胎盘，胸腺，肾上腺，包括大血管(例如肺动脉)，动脉，静脉，淋巴结，骨或骨骼肌。如本文所用，术语“组织”包括包含任何类型的细胞类型(例如来自上述器官之一)及其组合的任何组织类型，包括例如卵巢组织，睾丸组织，脐带组织，胎盘组织，结缔组织，心脏组织，肌肉、软骨和骨骼组织，内分泌组织，皮肤和神经组织。术语“组织”也可以包括脂肪组织或牙髓组织。在一些实施方式中，组织或器官获自人，例如人肝，人肺，人肾，人肠，人心脏，人胰腺，人睾丸，人胎盘，人胸腺，人肾上腺，人动脉，人静脉，人神经，人皮肤，人淋巴结，人骨或人骨骼肌。
34.如本文所用，术语“细胞”包括任何类型的细胞，例如体细胞(包括组织或器官中的所有类型的细胞)，成纤维细胞，角质形成细胞，肝细胞，心肌细胞，软骨细胞，平滑肌细胞，干细胞，祖细胞，卵母细胞和生殖细胞。这些细胞可以是组织或器官的形式。在一些实施方式中，细胞来自哺乳动物组织或器官，例如上述人组织或器官。
35.如本文所用，“保存操作”是指为含有细胞的活生物材料提供保质期的方法。保存操作可包括通过玻璃化冷冻保存和/或通过冷冻干燥或干燥进行脱水保存。
36.如本文所用，术语“玻璃化”是指没有冰晶形成或没有大量冰晶形成的固化。在一些实施方式中，可以将待保存的样品(例如组织或细胞材料)玻璃化，使得可以在没有任何冰晶形成的情况下实现玻璃化和/或玻璃体冷冻保存(其全部从初始降温到复温完成)。在一些实施方式中，可以将待保存的样品(例如组织或细胞材料)玻璃化，使得可以实现玻璃化和/或玻璃体冷冻保存，其中待保存的样品(例如组织或细胞材料)的固化可以在没有大量冰晶形成的情况下发生(即玻璃化和/或玻璃体冷冻保存(从初始降温到复温完成的全部过程)即使存在少量或有限量(小于导致组织损伤的量)的冰，也可以实现)。
37.如本文所用，当待保存的样品(例如器官，组织或细胞材料)达到玻璃化转变温度(tg)时被玻璃化。随着温度降低，玻璃化过程涉及冷冻保护剂溶液的粘度显著增加，使得冰成核和生长受到抑制。通常，溶液可能超低温而不冻结的最低温度是均相成核温度th，在该温度下冰晶成核并生长，并且由该溶液形成结晶固体。玻璃化溶液具有玻璃化转变温度tg，在该温度下溶质玻璃化，或变成非结晶固体。
38.如本文所用，“玻璃化转变温度”是指在进行该过程的条件下溶液或制剂的玻璃化转变温度。通常，本公开的方法是在生理压力下进行的。然而，只要待保存的样品(例如组织或细胞材料)因此没有显著损坏，就可以使用更高的压力。
39.如本文所用，“生理压力”是指组织在正常功能期间经历的压力。因此，术语“生理压力”包括正常的大气条件，以及各种组织(例如血管化的组织)在舒张和收缩条件下经历
的较高压力。
40.如本文所用，术语“冷冻保护剂”是指与没有冷冻保护剂的降温效果相比，当组织降温至零下温度时使组织/器官内和周围的冰晶形成最小化并且在升温后基本上不会对组织/器官造成损害的化学物质。
41.如本文所用，术语“糖”可以指任何糖。在一些实施方式中，糖是多糖。如本文所用，术语“多糖”是指含有多于一个单糖单元的糖。也就是说，术语多糖包括寡糖如二糖和三糖，但不包括单糖。糖也可以是糖的混合物，例如其中至少一种糖是多糖的地方。在一些实施方式中，糖是至少一种选自二糖和三糖的成员。在一些实施方式中，糖是二糖，例如二糖是至少一种选自海藻糖和蔗糖的成员。在一些实施方式中，糖是三糖，例如棉子糖。糖也可以是海藻糖和/或蔗糖和/或棉子糖和/或其他二糖或三糖的组合。在一些实施方式中，糖包含海藻糖。
42.如本文所用，关于冷冻保存材料的术语“冷冻保存后的功能”是指冷冻保存后的冷冻保存材料，例如器官或组织，在冷冻保存后保持可接受和/或预期的功能。在一些实施方式中，冷冻保存后的细胞材料保留其所有预期功能。在一些实施方式中，通过本公开方法保存的细胞冷冻保存材料保留至少50％的预期功能，例如至少60％的预期功能，例如至少70％的预期功能，例如至少80％的预期功能，例如至少90％的预期功能，例如至少95％的预期功能，例如100％的预期功能。例如，除了保持细胞的活力之外，还重要的是维持/保持组织/器官的生理功能，例如对于心脏，泵送功能，和/或组织(例如，待移植的那些)与周围组织整合的能力。
43.如本文所用，术语“无菌”是指不含活细菌，微生物和能够增殖的其他生物。
44.如本文所用，术语“基本上不含冷冻保护剂”是指量小于0.01w/w％的冷冻保护剂。在一些实施方式中，本公开的方法可以使用和/或实现基本上不含冷冻保护剂的介质/溶液和/或细胞材料，例如基本上不含dmso的细胞材料(即dmso的量小于0.01w/w％)。在一些实施方式中，本公开的方法可以使用和/或实现基本上不含糖以外的任何冷冻保护剂(例如蔗糖和/或海藻糖)的培养基/溶液和/或细胞材料。
45.如本文所使用的，术语“mnp”是指通过放置在磁场(m)中而可被诱导产生热量的纳米颗粒，并且在一些实施方式中，mnp的集合(下文中，mnp的集合将简称为“mnp”)将由纳米级fe颗粒组成。在一些实施方式中，mnp可以通过射频(即，rf敏感的纳米颗粒)激发，包括例如交变磁频率或旋转磁频率。mnp可以是包含一种或多种元素(例如铁)的纳米颗粒，以及含有放置在磁场中时产生热量的原子的化合物。
46.实施方式
47.本公开描述了涉及已经保存在高浓度cpa制剂如vs83中的冷冻保存的组织样品(包括例如大血管(例如肺动脉)或软骨)的复温和均匀升温的方法和组合物。这导致冷冻保存的样品上较低的热应力(例如避免裂缝)和几乎没有或没有失透(例如避免晶体)，这提供了改善的细胞活力，聚集模量和透水性。
48.本公开涉及保存活材料/样品/器官/组织的方法(术语“材料”，“样品”，“器官”和“组织”可互换使用，包括任何含有细胞成分的活生物材料)。在一些实施方式中，被保存的活材料/样品/器官/组织可以是短语“大体积细胞材料”或“大体积样品”或“大体积细胞样品”中使用的“大体积”。这是指含有细胞成分的活生物材料，无论该材料是天然的还是人造
的，包括细胞材料、组织和器官，无论是天然的还是人造的，其中含有细胞成分的活生物材料(包括例如大血管(例如肺动脉)或软骨)的体积大于约4ml，例如体积大于约5ml，或体积大于约10ml，或体积大于约15ml，或体积大于约30ml，或体积大于约50ml，或体积大于约70ml，或体积在约4ml至约200ml的范围内，例如体积在约4ml至约50ml的范围内，体积在约4ml至约30ml的范围内，或体积在约5ml至约100ml的范围内，例如体积在约5ml至约50ml的范围内，或体积在约5ml至约30ml的范围内，或体积在约6ml至约100ml的范围内，或体积在约6ml至约50ml的范围内，或体积在约6ml至约25ml的范围内，或体积在约10ml至约100ml的范围内，或体积在约10ml至约50ml的范围内，或体积在约10ml至约25ml的范围内，或体积在约10ml至约20ml的范围内。这些术语还包括具有待冷冻保存的体积的任何种类的活性材料，例如细胞材料，组织和器官(包括例如大血管(例如肺动脉)或软骨)。在一些实施方式中，具有这样体积的组织和器官可以是哺乳动物器官(例如人体器官)，哺乳动物细胞和哺乳动物组织(例如人体组织)。
49.本文所述的冷冻保存方法使用包含fe纳米颗粒的冷冻保护剂溶液来帮助升温保存的玻璃化样品。在快速降温至玻璃体(非结晶或无定形)状态之前，将待保存的样品浸没在冷冻保护剂制剂如vs83中或灌注。在实施方式中，外部射频场可用于与纳米颗粒(例如fe mnp)的受控相互作用，导致在分散在整个生物材料中的纳米颗粒位点产生热量。在分散位置产生的这种热量导致冷冻保存样品的快速和均匀解冻。将射频场与磁性纳米颗粒结合使用允许受控加热速率在约0.5℃/秒至约20.0℃/秒的范围内，例如在从约-135℃升温至约-30℃期间，或在约0.6℃/秒至约10.0℃/秒的范围内，例如在从约-135℃至约-30℃升温期间，或在约0.8℃/秒至约5.0℃/秒的范围内，例如在从约-135℃至约-30℃升温期间，或在约1.0℃/秒至约2.5℃/秒的范围内，例如在从约-135℃至约-30℃升温期间。这些升温速率避免了过热，冰形成和软骨细胞活力的丧失。
50.在实施方式中，本公开涉及通过使用射频(例如234khz)激发的fe纳米颗粒均匀升温已保存在高浓度cpa制剂(例如vs83)中的玻璃化样品的新方法。与传统的边界加热相比，该技术可以更均匀地控制加热速率。用高浓度的包括本公开的纳米颗粒的冷冻保护剂灌注或孵育的样品的射频解冻降低了失透和随后的冰形成的风险。虽然现有方法包括在较低浓度的冷冻保护溶液中使用纳米颗粒(例如磁性纳米颗粒)，但是在较大尺寸的样品中关于毒性(在高冷冻保护剂浓度下)和加热均匀性的各种挑战限制了现有方法的应用。
51.在一些实施方式中，本公开的mnp可以包括纳米颗粒(例如，超顺磁性纳米颗粒和铁磁性纳米颗粒)的组合，以在一系列可以缩放到更大系统的应用场下在两种不同的冷冻保护剂溶液(其中至少一种溶液是vs83)中加热。
52.冷冻保存要求生物材料经历受控速率冷冻程序，其可以损伤并潜在地破坏悬浮液，单层或组织或器官内的细胞。在细胞水平上，这种损伤可能涉及脱水和/或细胞内冰形成。这些因素与降温速率相反：缓慢降温可导致脱水，快速降温可产生细胞内冰形成。当采取极端情况时，已知这两种因素都会降低悬浮液中的细胞活力，但在本公开的方法中，通过添加高摩尔浓度的冷冻保护剂，例如vs83，令人惊讶地观察到最佳的软骨细胞活力和代谢活性(即对比vs55和vs70)。
53.例如，在本公开的方法中，纳米温热组织(即保存的细胞材料)的代谢活性可以在复温24小时内(例如，在储存/玻璃化之后)，复温36小时内，或复温48小时内，或复温96小时
内完全恢复到对照值。在正被保存的特定组织的合适生长培养基中，用新鲜组织(即，与暴露于高浓度冷冻保护剂制剂的细胞材料具有相同的组织类型)评估/设定对照值。然后维持恢复的代谢活性(例如数小时，数天或至少3天，或至少5天或至少7天的时间段)，直到通过本公开的方法保存的冷冻保存的细胞材料被用于其预期用途，包括例如研究或治疗用途(例如移植)。
54.玻璃化依赖于加载足够高浓度的冷冻保护剂并足够迅速地降温至低于玻璃化转变温度(tg)，同时最小化或避免冰(th)的成核。一旦低于玻璃化转变温度，被冷冻保存的样品是稳定的并且可以储存。为了解冻，人们面临着类似的挑战，即在不允许晶体生长的情况下通过失透温度(td)。避免冰在移动通过失透和液体温度(td和tm)时生长可以通过增加冷冻保护剂浓度和/或解冻速率来实现。本公开的方法改进了如何用高浓度的冷冻保护剂实现从玻璃化状态成功解冻冷冻保存的样品。
55.在这方面，本公开描述了通过使用激发的mnp来保存和升温玻璃化样品的新方法。在众所周知的冷冻保护剂(vs83)中添加本公开的纳米颗粒对其降温/升温表现的影响可忽略不计。“vs83”是一种优化的冷冻保护剂混合物，已证明成功玻璃化组织基质。vs83溶液由以下构成：4.65mol/l二甲亚砜，4.65mol/l甲酰胺和3.31mol/l丙二醇在1x eurocollins溶液中)，如brockbank等，心脏瓣膜组织的玻璃化(vitrification ofheart valve tissues)，methods mol biol 2015；1257：399-421所述。
56.本文所述的研究使用来自ferrotec的市售emg308进行，所述emg308由在水性悬浮液中的10nm直径纳米颗粒构成。将储备溶液在vs83冷冻保护剂溶液中稀释以提供2mg/ml fe mnp的浓度。配制冷冻保护剂-mnp混合物以考虑mnp水溶液的体积，使得最终混合物为12.6m vs83(4.65m dmso，4.65m甲酰胺和3.31m 1，2-丙二醇在euro-collins中)。
57.vs83溶液通过差示扫描量热法(dsc)具有-118.69c的玻璃化转变(brockbank，k.g.m.，wright，g.j.，yao，h.，greene，e.d.，chen，z.z.，schenke-layland，k.(2011)同种异体心脏瓣膜保存-同种异体心脏瓣膜储存在-80℃的玻璃化转变以上(allogeneic heart valve preservation-allogeneic heart valve storage above the glass transition at-80℃)，the annals of thoracic surgery，91：1829-1835)。纯vs83既没有临界降温速率也没有临界升温速率，因此不会形成冰。然而，由于一些组织(特别是大组织)可能不是完全冷冻保护剂渗透的，因此需要快速降温和升温速率。
58.在实施方式中，保存的样品将包含足够均匀的纳米颗粒分布。或者，在一些实施方式中，纳米颗粒分布可能不完全均匀。使用纳米颗粒对已经在高浓度冷冻保护剂制剂(例如vs83)中冷冻保存的冷冻保存样品进行复温可以提供更均匀的升温速率，这反过来可以减少对冷冻保存样品的失透和/或其他有害影响。此外，使用所公开的纳米颗粒来重新升温冷冻保存的样品有助于具有较高摩尔浓度的冷冻保护剂的较大系统的冷冻保存。
59.在实施方式中，本公开描述了一种冷冻保护组合物，其包括有效解包括对组织/细胞材料的冻冷冻保存样品的冷冻保护剂/制剂(例如，高浓度，例如vs83)和纳米颗粒(例如mnp)，其对组织/细胞材料具有最小损伤。冷冻保护剂/制剂可包括适用于生物材料冷冻保存的任何材料。示例性合适的冷冻保护剂包括例如醇，糖，聚合物和阻冰分子的组合，其改变水的相图并允许更容易(和/或在更高温度下)形成玻璃，同时还降低降温或解冻期间冰成核和生长的可能性。在大多数情况下，冷冻保存剂不是单独使用，而是混合使用的。
60.本公开的方法包括使细胞材料(例如，大血管(例如，肺动脉)或软骨)与含有有效量的mnp(例如2mg/ml fe mnp)的冷冻保护剂溶液接触。在一些实施方式中，这可以包括在这种冷冻保护剂制剂/溶液中孵育大体积细胞材料(例如大血管(例如肺动脉)或软骨)以及至少一种糖，例如二糖(例如海藻糖和/或蔗糖)。在实施方式中，在降温和解冻期间，至少一种糖，例如二糖(例如海藻糖和/或蔗糖)可以以有效提供更有利于大体积细胞材料的细胞存活的环境的量存在于冷冻保护剂制剂/溶液中(例如大血管(例如肺动脉)或软骨)。
61.在一些实施方式中，通过本公开方法保存的细胞冷冻保存材料(例如大血管(例如肺动脉)或软骨)保留至少50％的预期功能，例如至少60％的预期功能，例如至少70％的预期功能，例如至少80％的预期功能，例如至少90％的预期功能，例如至少95％的预期功能，例如100％的预期功能。例如，除了保持组织和器官中细胞的活力之外，还保持/保留细胞/组织/器官的生理功能(例如对于心脏，泵送功能)和/或组织/细胞与周围组织/细胞整合的能力(例如，待移植的那些)可能是重要的。
62.在实施方式中，非常适合细胞，组织和器官的器官储存的溶液，例如已知溶液，如vs83，可以含有任何有效量的mnp，其有效地提供更有利于保存操作期间的大体积细胞材料的细胞存活的环境。
63.在一些实施方式中，在本公开的方法中，含有mnp与其他冷冻保护剂组合的培养基(术语“培养基”和“溶液”可互换使用)可以与细胞材料如组织和器官组合以制备冷冻保存组合物。为了这些目的，培养基(其可以是水性介质)可以含有任何合适浓度的mnp与冷冻保护剂的组合。
64.在一些实施方式中，至少一种类型的mnp与高浓度的冷冻保护剂(例如vs83)组合以本公开方法中的量使用，使得其导致选自器官，细胞和组织(例如哺乳动物器官哺乳动物细胞和哺乳动物组织(包括可能随后移植的组织))的活细胞材料/样品的改善的活力(冷冻保存后))。短语“改善的细胞活力”或“改善的活力”例如指至少60％(例如80％或更高)的细胞活力(％)。改善的细胞活力(％)可以是50％或更多，60％或更多，70％或更多，73％或更多，75％或更多，77％或更多，80％或更多，83％或更多，85％或更多，87％或更多，90％或更多，93％或更多，95％或更多，97％或更多，98％或更多，或99％或更多。
65.在实施方式中，包含mnp的制剂/溶液/培养基可以与待保存的样品接触任何所需的持续时间，例如直到mnp的所需剂量(例如有效剂量)存在于细胞或组织上/中以提供改善的活力(冷冻保存后)和/或在纳米升温时防止/避免组织损伤。
66.在一些实施方式中，待冷冻保存的细胞还可以与包含例如至少碱性盐溶液，能源(例如葡萄糖)和能够在降温后温度下维持中性ph的缓冲液的冷冻相容性ph缓冲液接触。众所周知的这些材料包括例如达氏改良伊氏培养基(dmem)。该材料也可以作为冷冻保存组合物的一部分包括在内。参见例如campbell等，“用二糖冷冻保存贴壁平滑肌和内皮细胞(cryopreservation of adherent smooth muscle and endothelial cells with disaccharides)”，载于：katkov i.(编)《冷冻保存前沿新编》(current frontiers in cryopreservation).克罗地亚：in tech出版社(2012)；和campbell等，“胰腺储存溶液的开发：低温储存后β细胞存活和代谢状态的细胞保护补充剂的初步筛选”，biopreservation and biobanking 11(1)：12-18(2013)。
67.在一些实施方式中，冷冻保护剂化合物(总共包括糖和任何其它冷冻保护剂)可以
以例如约8.5m至约15m，约9.0至约13m，约10至约13m，约10.5至约12.8m，约11.5至约12.8m，约12.2至约12.75m或约12.50至约12.75m存在。在一些实施方式中，冷冻保护剂化合物(总共包括糖和任何其它冷冻保护剂)可以以约12.6m，或约12.4m，或约12.2m，或约12.0m，或约12.8m，或约13.0m的量存在于冷冻保存组合物中。
68.在一些实施方式中，待保存的细胞材料可以与本公开方法的另一种冷冻保护剂(超出例如vs83)和/或含mnp的溶液/介质/制剂/组合物接触。
69.合适的其他冷冻保护剂可包括例如乙酰胺，琼脂糖，藻酸盐，丙氨酸，白蛋白，乙酸铵，抗冻蛋白，丁二醇(例如2，3-丁二醇)，硫酸软骨素，氯仿，胆碱，环己二醇，环己二酮，环己烷三醇，葡聚糖，二甘醇，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺(例如n-二甲基甲酰胺)，二甲亚砜，赤藓糖醇，乙醇，乙二醇，乙二醇单甲醚，甲酰胺，葡萄糖，甘油，甘油磷酸酯，甘油单乙酸酯，甘氨酸，糖蛋白，羟乙基淀粉，肌醇，乳糖，氯化镁，硫酸镁，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，甲醇，甲氧基丙二醇，甲基乙酰胺，甲基甲酰胺，甲基脲，甲基葡萄糖，甲基甘油，苯酚，普卢兰尼克多元醇，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，脯氨酸，丙二醇(如1，2-丙二醇和1，3-丙二醇)，吡啶n-氧化物，棉子糖，核糖，丝氨酸，溴化钠，氯化钠，碘化物，硝酸钠，亚硝酸钠，硫酸钠，山梨糖醇，三乙二醇，乙酸三甲胺，尿素，缬氨酸和木糖。可用于本公开中的其他冷冻保护剂在fahy等的美国专利号6395467；wowk等的美国专利号6274303；khirabadi等的美国专利号6194137；fahy等的美国专利号6187529；fahy等的美国专利号5962214；calaco等的美国专利号5955448；meryman的美国专利号5629145；和/或wo 02/32225 a2，其对应于khirabadi等的美国专利申请号09/691197中描述。
70.冷冻保存组合物还可以包括(或基于)非常适合于储存细胞，组织和器官的溶液。该溶液可包括众所周知的ph缓冲液。在一些实施方式中，溶液可以是例如由taylor等，“unisol与euro-collins溶液作为冷冻保护剂的载剂溶液的比较”(comparison of unisol with euro-collins solution as a vehicle solution for cryoprotectants)，transplantation proceedings 33：677-679(2001)描述的由葡聚糖，磷酸一氢钾和磷酸二氢钾，碳酸氢钠和氯化钾构成的eurocollins溶液。或者，可以将冷冻保护剂溶液配制成替代溶液，例如unisol。
71.此外，用于本公开方法的冷冻保存组合物还可以包括抗冻糖脂(afgl)，抗冻蛋白/肽(afp)，“热滞后”蛋白，(thp)或冰重结晶抑制剂(iri)。这些物质可以例如约0.001至约1mg/ml，约0.05至约0.5mg/ml或约0.1至约0.75mg/ml组合物的量存在于冷冻保存组合物中。
72.在一些实施方式中，至少一种糖，例如二糖(例如海藻糖和/或蔗糖)可以充当冷冻保护剂(例如dmso)的替代物，或作为这种其它冷冻保护剂的补充剂以降低其浓度，例如降低至无毒浓度(取决于所讨论的组织)，在冷冻保存过程中，在该浓度下，冷冻保护剂在保存冷冻保存材料/样品的功能方面达到相同或更好的保护效果。例如，在一些实施方式中，至少一种糖，例如二糖(例如海藻糖和/或蔗糖)，可以在称为“vs83”的溶液中充当冷冻保护剂(例如dmso)的替代物，所述溶液是优化的冷冻保护剂混合物，其已经证明许多生物系统成功玻璃化。在这方面，至少一种糖，例如二糖(例如海藻糖和/或蔗糖)可以充当vs83溶液中的冷冻保护剂的替代物，以降低其浓度，或作为vs83中其他冷冻保护剂的补充剂，其中冷冻保护剂在冷冻保存过程中保持与冷冻保存材料/样品一样多的功能方面达到相同或更好的
保护效果。
73.此外，用于本公开方法的冷冻保存组合物还可以包括一种或多种合适浓度的补充剂和/或添加剂，以实现预期的功能和/或作用机制。在一些实施方式中，抗氧化剂的有效浓度范围可以在约0.5μm至约1000μm，例如约5μm至约500μm，或50μm至约200μm的范围内。在一些实施方式中，凋亡抑制剂的有效浓度范围可以在约0.1μm至约100μm，例如约1μm至约50μm，或5μm至约20μm的范围内。
74.在一些实施方式中，可以添加到本公开的冷冻保存组合物中和/或用于本公开的方法中的示例性补充剂和/或添加剂包括下表i中列出的那些中的一种或多种。
75.表1：
[0076][0077][0078]
在一些实施方式中，trolox和/或α-生育酚的有效浓度范围可以在约0.5μm至约10mm的范围内，例如约5μm至约500μm，或约50μm至约200μm。在一些实施方式中，乙酰半胱氨酸的有效浓度范围可以在约0.1μm至约50mm的范围内，例如约1mm至约40mm，或约10mm至约30mm。在一些实施方式中，超氧化物歧化酶的有效浓度范围可以为约1mg/ml至约400mg/ml，例如约10mg/ml至约300mg/ml或约100mg/ml至约250mg/ml。在一些实施方式中，gsh-mee的有效浓度范围可以在约500μm至约20mm的范围内，例如约1000μm至约12mm，或约2mm至约10mm。在一些实施方式中，谷胱甘肽的有效浓度范围可以在约100μm至约11mm的范围内，例如约500μm至约6mm，或约2mm至约4mm。在一些实施方式中，q-vd-oph的有效浓度范围可以在
约0.5μm至约50μm的范围内，例如约5μm至约40μm，或约20μm至约30μm。在一些实施方式中，z-vad-fmk的有效浓度范围可以在约1μm至约100μm的范围内，例如约5μm至约80μm，或约40μm至约60μm。在一些实施方式中，ivachtin的有效浓度范围可以在约0.5nm至约50nm的范围内，例如约5nm至约40nm，或约20nm至约25nm。在一些实施方式中，pifithrin-α的有效浓度范围可以在约0.1mm至约60mm的范围内，例如约1mm至约40mm，或约10mm至约30mm。在一些实施方式中，bax抑制剂p5的有效浓度范围可以在约0.5μm至约0.5mm的范围内，例如约5μm至约400μm，或约50μm至约200μm。在一些实施方式中，3-omg的有效浓度范围可以在约0.1mm至约400mm的范围内，例如约10mm至约300mm，或约50mm至约200mm。在一些实施方式中，硫化氢的有效浓度范围可以在约0.1ppm至约60ppm的范围内，例如约1ppm至约40ppm，或约10ppm至约30ppm。
[0079]
可用于本公开方法的细胞材料中的细胞可以是任何合适的细胞组合物。在一些实施方式中，细胞可以是皮肤细胞，角质形成细胞，骨骼肌细胞，心肌细胞，肺细胞，肠系膜细胞，脂肪细胞，干细胞，肝细胞，上皮细胞，库普弗细胞，成纤维细胞，神经元，心肌细胞，软骨细胞，胰腺腺泡细胞，朗格汉斯岛，骨细胞，成肌细胞，卫星细胞，内皮细胞，脂肪细胞，前脂肪细胞，胆管上皮细胞和祖细胞或任何这些细胞类型的组合。
[0080]
在一些实施方式中，本公开方法中使用的细胞/组织(例如大血管(例如肺动脉)或软骨)可以来自任何合适的动物物种，例如哺乳动物，例如人，犬科(例如狗)，猫科(例如猫)，马科(例如马)，猪，绵羊，山羊或牛科哺乳动物。
[0081]
用于制备冷冻保存溶液的制剂/组合物可以以各种方式与mnp组合。在一些实施方式中，细胞材料(例如大血管(例如肺动脉)或软骨)可以与含有mnp的含水液体介质例如水溶液组合。例如，可以进行任选地温和搅拌的渐进组合。
[0082]
一旦制备了冷冻保存组合物(以及与待保存的细胞材料相关的mnp)，就可以以任何方式进行无冰玻璃化冷冻保存的降温，并且可以使用上述任何其他材料。在以下专利和出版物中描述了用于保存细胞材料的操作：fahy等的美国专利号6395467；wowk等的美国专利号6274303；khirabadi等的美国专利号6194137；fahy等的美国专利号6187529；toner等的美国专利号6127177；fahy等的美国专利号5962214；calaco等的美国专利号5955448；beattie等的美国专利号5827741；goodrich等的美国专利号5648206；meryman的美国专利号5629145；rudolph等的美国专利号5242792；和wo 02/32225 a2，其对应于khirabadi等的美国专利申请号09/691197。
[0083]
保存操作的冷冻保存部分通常涉及将细胞/组织(例如大血管(例如肺动脉)或软骨)降温至远低于水的冰点的温度，例如约-80℃或更低，更通常约-130℃或更低。可以使用本领域技术人员已知的任何冷冻保存方法。例如，用于冷冻保存的降温操作可以是冷冻保存温度可以低于(即较冷)约-20℃，例如约-80℃或更低(即较冷)或约-135℃或更低(即较冷)的任何合适类型。在一些实施方式中，冷冻保存温度可以在约-20℃至约-196℃，或约-120至约-196℃，或约-130℃至约-196℃，或约-140℃至约-190℃，或约-150℃至约-190℃，或约-150℃至约-180℃，或约-30至约-175℃或约-80℃至约-160℃，或约-85℃至约-150℃，或约-95℃至约-135℃，或约-80℃至约-180℃，或约-90℃至约-196℃，或约-100℃至约-196℃的范围内。
[0084]
在一些实施方式中，保存操作可以包括从温度控制开始点(+4至-30℃)至-80℃或
任何上述降温温度的连续控制速率降温，降温速率取决于被冷冻保存的细胞/组织的特征。例如，用于冷冻保存的降温操作可以是任何合适的速率，例如速率(和/或平均降温速率，例如从样品的初始温度到冷冻保存温度)可以大于约-0.1℃/分钟，或大于约-4.0℃/分钟，或大于约-6.0℃/分钟，或大于约-8.0℃/分钟，或大于约-10.0℃/分钟，或大于约-14.0℃/分钟，或大于约-25.0℃/分钟，或大于50℃/分钟。降温速率(和/或平均降温速率)，例如用于连续速率降温(或其他类型的降温)，可为例如约-0.1℃至约-10℃/分钟或约-1℃至约-2℃/分钟。降温速率可以是约-0.1至约-9℃/分钟，约-0.1至约-8℃/分钟，约-0.1至约-7℃/分钟，约-0.1至约-6℃/分钟，约-0.1至约-5℃/分钟，约-0.1至约-4℃/分钟，约-0.1至约-3℃/分钟，约-0.1至约-2℃/分钟，约0.1至约-1℃/分钟，约0.1至约-0.5℃/分钟，约-1至约-2℃/分钟，约-1至约-3℃/分钟，约-1至约-4℃/分钟，约-1至约-5℃/分钟，约-1至约-6℃/分钟，约-1至约-7℃/分钟，约-1至约-8℃/分钟，约-1至约-9℃/分钟，约-1至约-10℃/分钟，约-2至约-3℃/分钟，约-2至约-5℃/分钟，约-2至约-7℃/分钟，约-2至约-8℃/分钟，约-2至约-20℃/分钟，约-4至约-10℃/分钟，约-4℃至约-8℃/分钟，约-4至约-6℃/分钟，约-6至约-10℃/分钟，约-6至约-9℃/分钟，约-6至约-8℃/分钟，约-6至约-7℃/分钟，约-7至约-10℃/分钟，约-7至约-9℃/分钟，约-7至约-8℃/分钟，约-8至约-9℃/分钟，约-9至约-10℃/分钟，约-7至约-30℃/分钟，约-10至约-25℃/分钟，约-15至约-25℃/分钟，约-20至约-25℃/分钟，或约-20至约-30℃/分钟。在一些实施方式中，保存操作也可以独立于降温速率。
[0085]
一旦待保存的样品(例如，细胞材料和/或组织)通过连续降温降温至约-40℃至-80℃或更低，它们可以转移至液氮或液氮的气相以进一步降温至冷冻保存温度，其通常低于冷冻溶液的玻璃化转变温度。在进一步降温至冷冻保存温度之前，待保存的样品(例如细胞材料和/或组织)可降温至约-40℃至约-75℃，约-45℃至约-70℃，约-50℃至约-60℃，约-55℃至约-60℃，约-70℃至约-80℃，约-75℃至约-80℃，约-40℃至约-45℃，约-40℃至约-50℃，约-40℃至约-60℃，约-50℃至约-70℃，或约-50℃至约-80℃。或者，可以将样品降温至-120℃，然后进一步降温至所需的冷冻保存温度。然而，预计结果与降温速率无关，因为不会发生结冰。保留细胞活力的限制因素将是在接近零摄氏度的温度下冷冻保护剂暴露的持续时间，温度越低，细胞毒性作用的风险越小，直到达到预期活力不会降低的储存温度。
[0086]
补充有mnp和/或糖(例如海藻糖和/或蔗糖)的冷冻保护剂制剂在纳米升温和/或暴露于高于玻璃化转变温度的温度期间具有降低的冰成核倾向。因此，这些制剂中的细胞材料将耐受短期暴露于诸如-80℃的温度数分钟或数小时。确切的持续时间取决于冷冻保护剂mnp制剂。在每个温度下耐受的持续时间将取决于在该温度下使用的冷冻保护剂制剂的相对细胞毒性。此外，预计这些冷冻保护剂制剂可用于储存不需要细胞活力的组织(例如一些心脏瓣膜，皮肤，肌腱和周围神经移植物)，温度范围从液氮到生理温度低于胶原蛋白的变性温度范围(约60℃)。
[0087]
一些实施方式，本公开的方法可以包括逐步降温过程，其中组织的温度在玻璃-120℃和-20℃之间的第一温度下的含有冷冻保护剂的溶液中下降至第一温度，然后在第一溶液的玻璃化转变温度和-20℃之间的温度下的含有冷冻保护剂的相同溶液中进一步降低至第二温度，并且可以用第三，第四，第五，第六，第七溶液等重复该过程，直到达到所需的
温度。应在开始降温前将mnp引入/分配到第一步中保存的样品/材料中。
[0088]
在实施方式中，第一溶液(例如包括mnp的冷冻保护剂制剂)的玻璃化转变温度可以设定在任何期望的水平，例如，在约-100℃至约-140℃的范围内，例如约-110℃至约-130℃，或-115℃至约-130℃。
[0089]
在浸入初始溶液中后，可将待保存的样品(例如细胞材料或组织)浸入含有冷冻保护剂和mnp的溶液中。最终的冷冻保护剂和mnp浓度可以在逐步降温过程中达到。将冷冻保护剂溶液添加到细胞材料中是逐步过程，其中将冷冻保护剂添加4个或更多步骤，或者可以采用连续梯度。最终的冷冻保护剂步骤可以在零下温度，-25至-1℃的醇浴中进行。此外，在最后的冷冻保护剂添加步骤中添加mnp。
[0090]
在实施方式中，待保存的样品(例如细胞材料或组织)在保存操作(例如降温操作，储存和升温操作)期间可以保持无冰和/或无冰诱导的损伤。例如，在降温过程完成之后，待保存的样品(例如细胞材料或组织)可以在储存步骤/阶段期间长期保持无冰和/或无冰诱导的损伤，例如持续至少3天的时间段，或至少5天的时间段，或至少7天的时间段，或至少8天的时间段，数月或数年。
[0091]
在一些实施方式中，在开始降温过程时，在整个保存操作期间(即在降温操作，储存和升温操作期间)，待保存的样品(例如细胞材料或组织)可以保持无冰和/或无冰诱导的损伤，其中整个保存操作(例如，降温操作，储存步骤/阶段和升温操作)的持续时间范围为至少3天至约3个月，或持续时间范围为至少5天至约2个月，或持续时间范围为至少7天至约1个月，或持续时间范围为至少8天至约21天，或持续时间范围为至少8天至约14天。
[0092]
纳米颗粒(mnp)可以是可由射频(即，rf敏感的纳米颗粒)激发的任何mnp，包括但不限于交变磁频率或旋转磁频率，并且如下所述。纳米颗粒可以包括一种或多种元素，例如铁和含有当置于磁场中时产生热量的原子的化合物。
[0093]
如本文所使用的，如果颗粒具有不超过一微米(μm)的最大直径，但可以作为特征尺寸大于一微米的结构(例如聚集体)的一部分被纳入，则该颗粒可被认为是mnp。本文提供的尺寸是指纳米颗粒的尺寸，而不是较大结构的尺寸。因此，纳米颗粒的最大直径可以是例如不超过800纳米(nm)，不超过700纳米，不超过600纳米，不超过500纳米，不超过450纳米，不超过400纳米，不超过350纳米，不超过300纳米，不超过250纳米，不超过200纳米，不超过150纳米，不超过100纳米，不超过90纳米，不超过80纳米，不超过70纳米，不超过60纳米，不超过50纳米，不超过40纳米，不超过30纳米，不超过25纳米，不超过20纳米，不超过15纳米，不超过10纳米，或不超过1纳米。如果颗粒具有至少1nm，例如至少2nm，至少3nm，至少4nm，至少5nm，至少6nm，至少7nm，至少8nm，至少9nm，至少10nm，至少25nm，至少50nm，至少100nm，至少250nm或至少500nm的最小直径，则可以认为颗粒是mnp。在一些实施方式中，mnp的尺寸可以包括具有由上面列出的任何最大直径和上面列出的小于最大直径的任何最小直径定义的端点的范围。
[0094]
在一些实施方式中，mnp可以包括超顺磁性纳米颗粒。在其他实施方式中，mnp可以包括铁磁性纳米颗粒。mnp可以具有任何合适的形状，例如球形，立方体，金字塔形等。在一些实施方式中，mnp可以包括任何两种或更多种类型的纳米颗粒的组合。在一些实施方式中，mnp可以聚集。在这样的实施方式中，mnp可以彼此相互作用。在这些实施方式中的一些中，可以根据需要调节mnp的聚集以增强或减小特定应用中的升温速率。
[0095]
mnp可以以足以提供每毫升玻璃化组织最少0.5mg可被磁激发以产生热量的原子的量存在于冷冻保护制剂(例如vs83)中，例如至少1.0mg/ml，至少1.5mg/ml，至少3.0mg/ml，至少4.0mg/ml，至少5.0mg/ml，至少6.0mg/ml，至少7.0mg/ml，至少8.0mg/ml，至少9.0mg/ml，至少10mg/ml，至少11mg/ml，至少12mg/ml，至少13mg/ml，至少14mg/ml，至少15mg/ml，至少20mg/ml，至少25mg/ml或至少50mg/ml。在一些实施方式中，mnp可以以足以提供最大不超过100mg/ml，不超过75mg/ml，不超过50mg/ml，不超过25mg/ml，不超过20mg/ml，不超过15mg/ml，不超过10mg/ml，不超过9mg/ml，不超过5mg/ml，不超过3mg/ml，不超过2.5mg/ml，不超过2mg/ml，0.2mg/ml的量存在于冷冻保护制剂如vs83中。在一些实施方式中，冷冻保护组合物中磁性纳米颗粒的量可以表征为具有由上面列出的任何最小量和上面列出的小于最大量的任何最大量定义的终点的范围。
[0096]
冷冻保护组合物和mnp可用于以对组织/细胞材料的最小损伤解冻冷冻保存的样品的方法，所述冷冻保存的样品包括对组织/细胞材料。升温操作的变量(例如amp，khz和时间)对于被升温的组织(及其大小)，所选择的升温速率，mnp的种类以及mnp浓度/分布可以是适当有效的。
[0097]
例如，在一些实施方式中，电感加热系统的设置可以设定在10至800amp/10至1000khz/持续20至300秒的范围内，或者可以设定在100至700amp/50至700khz/持续40至200秒的范围内，或者可以设定在300至600amp/150至300khz/持续50至120秒的范围内，或者可以设定在450至550amp/150至300khz/持续60至100秒的范围内，或者可以设定在475至525amp/200至250khz持续70至90秒的范围内，或者可以设定在300至600amp/150至300khz持续50至120秒的范围内，或者可以设定为约500amp和约234khz持续约80秒。
[0098]
在一些实施方式中，射频场可以在约210khz至约250hz的范围内。在另一个特定示例中，射频场可以在230khz至约240khz的范围内，例如约234khz。
[0099]
在一些实施方式中，电磁能量可以包括射频场，交变磁场或旋转磁场。在这样的实施方式中，电磁能量可以表现出不超过1mhz，例如，不超过750hz，不超过500hz，不超过375hz，不超过300hz，不超过250hz，不超过225hz，不超过200hz，不超过175hz，不超过150hz，不超过125hz，不超过100hz，不超过75hz，或不超过50hz的最小频率。在一些实施方式中，射频场可以表现出至少1hz，例如，至少5hz，至少10hz，至少25hz，至少50hz，至少75hz，至少100hz，至少125hz，至少150hz，至少175hz，至少200hz，至少225hz或至少250hz的最大频率。在一些实施方式中，射频场的特征在于具有上面列出的任何最小频率和上面列出的大于最小频率的任何最大频率作为端点的频率范围，并且可以是时间依赖性的。在一些实施方式中，例如，射频场可以在约175hz至约375hz的范围内。在另一个特定示例中，射频场可以在100hz至约500hz的范围内。
[0100]
在一些实施方式中，升温操作(例如，涉及mnp)可涉及施加10至800amp，施加100至700amp，施加300至600amp或施加450至550amp，或施加475至525amp，或施加300至600amp，施加约500amp，例如，例如，在升温操作的至少部分期间(例如，涉及mnp)，例如，从低于-135℃至-30℃的温度，或在整个升温操作期间(例如，涉及mnp)。
[0101]
在一些实施方式中，升温操作(例如，涉及mnp)可涉及施加至少1amp/分钟，例如至少5amp/分钟，至少10ka/m，至少20ka/m，至少30ka/m，至少50ka/m，至少75ka/m或至少100ka/m。在一些实施方式中，射频场可具有不超过200ka/m例如，不超过150ka/m，不超过
100ka/m，不超过80ka/m，不超过50ka/m或不超过25ka/m的最大强度。在一些实施方式中，射频场的强度可以被表征为具有上面列出的任何最小强度和上面列出的大于最小强度的任何最大强度作为端点的范围，并且可以是时间依赖性的。在一些实施方式中，射频场可具有约10ka/m至约100ka/m的强度。在一个特定实施方式中，射频场可具有24ka/m的强度。
[0102]
在一些实施方式中，射频场可以具有至少1ka/m，例如，至少5ka/m，至少10ka/m，至少20ka/m，至少30ka/m，至少50ka/m，至少75ka/m或至少100ka/m的最小强度。在一些实施方式中，射频场可以具有不超过200ka/m，例如，不超过150ka/m，不超过100ka/m，不超过80ka/m，不超过50ka/m或不超过25ka/m的最大强度。在一些实施方式中，射频场的强度可以表征为具有以上列出的任何最小强度和上面列出的大于最小强度的任何最大强度作为端点的范围并且可以是时间依赖性的。在一些实施方式中，射频场可具有约10ka/m至约100ka/m的强度。在一个特定实施方式中，射频场可具有24ka/m的强度。
[0103]
在一些实施方式中，上述射频场和/或升温过程(例如，涉及mnp)可以施加/传导至少20秒的最小时间，例如至少30秒，至少50秒，至少70秒，至少90秒，至少110秒或至少150秒。在一些实施方式中，射频场可以具有不超过40秒，例如不超过60秒，不超过85秒，不超过105秒，不超过115秒，或不超过180秒的最大强度。在一些实施方式中，射频场的强度可以被表征为具有上面列出的任何最小强度和上面列出的大于最小强度的任何最大强度作为端点的范围，并且可以是时间依赖性的。
[0104]
在一些实施方式中，在从低于-135℃升温至约-30℃期间，样品可以以至少0.5℃/秒，例如至少1℃/秒，至少5℃/秒或至少20℃/秒的最小速率升温。在一些实施方式中，在从低于-135℃升温至约-30℃期间，生物材料可以以不超过0.5℃/秒，例如不超过1℃/秒，不超过5℃/秒，或不超过20℃/秒的最大速率升温。在一些实施方式中，生物材料可以以具有由上面列出的任何最小速率和上面列出的大于最小速率的任何最大速率作为端点的范围内的速率升温。在一些实施方式中，生物材料可以以约1℃/秒的速率升温。在其他特定实施方式中，生物材料可以以约0.5℃/秒或约20℃/秒的速率升温。
[0105]
在一些实施方式中，常规加热方法也可用于升温样品，例如与纳米升温组合。这种常规方法可以包括例如对流和微波加热。在本公开的方法之前，包括从外边界加热的对流加热的常规方法对于小玻璃化样品是有效的，但由于冷冻保护剂的细胞毒性和降温和升温过程中的冰形成而对大样品(例如，体积大于5ml)无效。
[0106]
在一些实施方式中，可用于使样品复温的低射频和感应加热方法是关于生物相容性磁性纳米颗粒描述的那些，例如，在美国专利申请公开号2016/0015025中描述的那些。
[0107]
在实施方式中，通过本公开方法保存的冷冻保存的细胞材料可以用于任何合适的用途，包括例如研究或治疗用途。例如，关于治疗用途，可以将冷冻保存的细胞材料给予人或动物患者以治疗或预防疾病或病症，诸如主动脉心脏病，退行性关节病，退行性骨病，结肠或肠道疾病，退行性脊髓病，慢性肾衰竭疾病，心脏病，椎间盘疾病，角膜疾病，脊柱创伤和因创伤而丢失的部位的替换，例如手指，四肢和面部。
[0108]
冷冻保存的细胞材料可以以任何合适的方式给予患者。在一些实施方式中，冷冻保存的细胞材料可以局部递送至患者(例如在治疗烧伤，伤口或皮肤病中)。在一些实施方式中，可以将冷冻保存的细胞材料递送至患者内的局部植入部位。这些或这些给药模式的任何组合可用于治疗患者。
[0109]
在第一方面，本公开涉及一种保存活的大体积细胞材料的方法，包括：将细胞材料暴露于含有mnp的冷冻保护剂制剂/溶液/培养基中，使细胞材料经受保存操作，其中不会发生冰诱导的细胞材料损伤，并获得冷冻保存的细胞材料。在第二方面，第一方面的方法可以是其中冷冻保护剂溶液中的细胞材料具有大于4ml的体积的方法。在第三方面，上述任何方面的方法可以是其中冷冻保护剂溶液中细胞材料的体积大于10ml的方法。第四方面，上述任何方面的方法可以是这样一种方法，其中细胞材料在使细胞材料经受保存操作后至少7天是无冰的。在第五方面，上述任何方面的方法可以是保存操作包括限制降温和升温期间冰的生长的玻璃化策略的方法，使得在保存操作或存储期间不会发生冰诱导的损伤。
[0110]
在另一方面，本公开还涉及通过在保存操作期间将活的大体积细胞材料暴露于含有mnp和任选的其他冷冻保护剂的冷冻保护剂制剂而获得的冷冻保存的细胞材料；其中保存操作后细胞材料的细胞存活率(％)至少为50％，并且冷冻保护剂溶液中的细胞材料的体积大于4ml，则可以例如通过上述任何方面的方法获得这种冷冻保存的细胞材料，并且可以给予患者。
[0111]
通过参考以下实施例进一步说明了上述内容，这些实施例是为了说明目的而提出的，并不旨在限制本公开的范围。
实施例
[0112]
软骨实验
[0113]
在以下无冰冷冻保存制剂补充实验中，将mnp以2mg/ml fe mnp的量添加到各种玻璃化制剂(vs55，vs70和vs83)中，以在50ml系统中获得维持猪关节软骨的软骨细胞活力的有效性。图1中描绘的结果令人惊讶地表明，在最高83％cpa制剂(vs83)中玻璃化并用2mg/ml fe mnp复温的关节软骨组中观察到最佳的软骨细胞活力和代谢活性。
[0114]
用于纳米升温的感应加热系统设置为500amp和234khz，持续80秒，从低于-135℃至-30℃的温度升温。更长时间和更高设置导致过热和软骨细胞活力丧失。
[0115]
关于上述数据，使用代谢活性作为初步筛选测定(图1a)，将取自大骨软骨样品的纳米升温组织对照和升温后关节软骨样品在2ml dmem培养基+10％fbs中孵育1小时以在生理条件下平衡，然后在标准细胞培养条件下添加20％alamarblue 3小时。在复温后每天进行该测量，持续4天，以表征组织中预热细胞的代谢行为。这些结果表明，在最高83％cpa制剂(vs83)中玻璃化并用2mg/ml fe mnp复温的关节软骨组中观察到最佳软骨细胞活力和代谢活性。另外，两天后，纳米升温组织的代谢活性完全恢复到对照值(参见图1a)。
[0116]
关于图1b所示的数据，在切割和染色后进行新鲜，对流升温和纳米升温组的活/死评估，以评估穿过猪关节软骨的软骨细胞分布。复温后不久，使用双光子荧光显微镜捕获图像。结果(图1b)表明，对于纳米升温组(vs83+fe(2mg/ml fe mnp))，大多数细胞(70-80％)在浅表和深部均存活，类似于新鲜软骨组织(90-100％)。相反，对流升温组中只有30-40％的细胞存活。
[0117]
关于图2中描绘的数据，在胶原酶消化后进行台盼蓝排除。
[0118]
图2中描绘的结果表明新鲜的对照软骨和对流升温和纳米升温的软骨样品可以获得活细胞(n＝4，图2)。两种升温方法之间台盼蓝排除没有显著差异，但对流(2.58
±
0.53
×
103个软骨细胞)和纳米升温的细胞产量差异有统计学意义(p＜0.05，t检验)，为从纳米软
骨(5.97
±
0.86
×
103个软骨细胞)中回收死细胞和活细胞的总细胞数量的两倍。据推测，对流升温的骨软骨移植物中的细胞损失是由于复温期间冰成核损伤细胞。使用台盼蓝法，纳米升温组显示新鲜活力值的87.6％
±
3.4％。
[0119]
生物材料测试：与对流升温相比，糖胺聚糖(gag)测量显示纳米升温后的统计学显著保存(p＜0.01)，与新鲜软骨相比没有差异(图3)。使用电导率方法测量渗透率。在低渗和等渗条件下测试组织(n＝3个实验中n＝7-14个样品)。使用低渗测试未观察到显著差异(图4)。在等渗条件下(未显示)观察到统计学显著(p＜0.05)较慢的电导率，可能是由于所用cpa的组织脱水。由于数据的标准偏差较大，各组之间的固定能量电荷没有差异。
[0120]
还测量了总模量和水力渗透率，结果如图5和图6所示。
[0121]
纳米升温样品的总模量结果与新鲜值相似，然而两个玻璃化组的水力渗透性结果表明渗透性较低(图6)，与图5中的电导率测量结果一致，再次表明软骨在玻璃化后未完全再水合。
[0122]
上述数据反映，与使用3种方法的对流升温相比，在vs83 cpa制剂中使用mnp(例如2mg/ml fe mnp)的纳米升温导致改善的活力(参见例如图1和2)。alamarblue方法没有破坏性，因此在组织培养中恢复4天。暴露于vs83cpa制剂的组织在组织培养的第2天达到新鲜值(100％)(图1a)。生物材料测试表明通过电导率和水力渗透性测量降低了渗透性。gag含量和聚集模量均与新鲜软骨值相似(图3和5)。
[0123]
方法
[0124]
猪关节软骨采购：样品来自其他iacuc批准的研究中使用的动物或死后食品加工厂。解剖组织，冲洗并置于含有抗生素的冰冷组织培养基的无菌杯中过夜，然后分配用于体外研究。
[0125]
玻璃化方法(关于vs55样品描述(vs70和vs83以类似方式玻璃化)：使用前面描述的方法在4℃组织逐渐渗入由euro-collins溶液中的3.10m dmso，3.10m甲酰胺和2.21m丙二醇组成的vs55。在冰上浓度增加的五个连续的15分钟步骤中加入预冷的稀玻璃化溶液(4℃)。在最后的第六添加步骤中，在预冷的-10℃或4℃全强度玻璃化溶液中加入2mg/ml fe mnp分散在其中的最后一个冷冻保护剂浓度，并在-10℃浴中保持15分钟或在4℃下在塑料管中的冰上。然后将样品分两步降温，首先通过置于-135℃的预冷2-甲基丁烷浴中快速降温至-100℃，然后通过转移至气相氮气储存以较慢降温至-135℃以下。最后，在测试之前，将样品在-130℃以下在气相氮气中储存至少24小时。
[0126]
升温：通过对流升温或纳米升温进行升温。对流升温是一个两阶段过程，包括缓慢升温至-100℃，然后尽可能快地升温至熔化。通过将样品置于-135℃冷冻机的顶部来产生缓慢升温速率，并且通过在室温下将塑料容器置于30％dmso/h2o的混合物中来产生对照升温速率。复温后，在冰上逐步除去玻璃化溶液以保持组织处于低温状态，并使由于存在残留的冷冻保护剂存在所致的细胞毒性最小化。
[0127]
肺动脉实验
[0128]
在肺动脉上测试具有二糖
±
mnp的冷冻保护剂(cpa)制剂。二糖是本公开的玻璃化制剂的重要补充剂。评估了四种制剂，三种含有0.6m蔗糖，一种含有0.3m蔗糖和0.3m海藻糖的组合(图7)。具体而言，在图7中，制剂制备如下：a)加载dp6+0.6m蔗糖并用dp7+0.6m蔗糖玻璃化；b)加载dp7+0.6m蔗糖并用dp7+0.6m蔗糖玻璃化；c)加载dp7+0.6m蔗糖并用dp8+
0.6m蔗糖玻璃化；和d)加载dp7+0.3m蔗糖+0.3m海藻糖并用vs55+0.3m蔗糖+0.3m海藻糖玻璃化。d组与a组比较有显著差异(p＜0.05，t检验)，与b组和c组比较无显著(ns)差异。尽管无统计学意义，但使用补充蔗糖和海藻糖的vs55获得最佳结果(图7)。
[0129]
测试了在零下温度(零下以最小化细胞毒性风险)下长时间暴露于cpa溶液。在早期实验
±
fe和纳米升温中，在0和-10℃下比较最后的冷冻保护剂加载步骤。结果尚无定论，因此在所有实验中均使用-10℃在安全方面保守地犯错误，以最小化对动脉细胞的细胞毒性风险。
[0130]
还测试了暴露于非常高浓度的cpa，然后在毒性较低的浓度下保存。结果：评估vs83和vs70(83和70％冷冻保护剂)的加载量，然后用vs55+0.3m蔗糖+0.3m海藻糖玻璃化。具有高冷冻保护剂加载浓度的玻璃化导致＜33％的组织活力(结果未显示)。因此这个策略已经停止。评估使用不含甲酰胺的较低浓度加载制剂的替代策略。在最后的加载步骤中以包括二糖的逐步方式进行加载。然后将加载溶液替换为四种玻璃化制剂之一，并将动脉玻璃化(图7)。d组(加载dp7+0.3m蔗糖+0.3m海藻糖并用vs55+0.3m蔗糖+0.3m海藻糖玻璃化)具有最高的平均活力值。
[0131]
选择d组(在最后加载步骤中dp7+0.3m蔗糖+0.3m海藻糖，然后用vs55+0.3m蔗糖+0.3m海藻糖玻璃化)用于使用物理和生物材料表征方法储存0-6个月后的进一步稳定性研究。
[0132]
如图8所示，测试了使用上述制剂(a组)进行纳米升温，对相同的操作进行修改，其中使用糖在冷冻保护剂暴露之前使动脉预脱水(图8，b组)为了便于更快速的冷冻保护剂加载。两种策略均未达到＞90％的活力(分别为76％和72％的活力)。还测试了另一种复温后策略，其中将复温后补充程序与vs55+0.3m蔗糖和0.3m海藻糖组合，并用2.5mg/ml fe纳米颗粒进行纳米升温。在抗氧化剂，α-生育酚(维生素e)和q-vd-oph(qvd)存在下，在生理条件下孵育纳米升温的动脉。该策略在短期和长期3个月的时间点都将活力提高到＞90％(图8)。对流升温的长期储存(新鲜对照的平均68.5％)显著低于纳米升温3个月时d组(anova和t检验，p＜0.0001，未显示)。
[0133]
一旦证实活力保持在＜90％，开始复温后对肺动脉进行生物材料测试(图9)。主要目的是确定(动脉的)爆破压力是否改变。在37℃浴中使用纳米升温或对流储存和升温后评估新鲜与无冰玻璃化动脉的爆破压力(a，mmhg)和线性模量(b，psi)。结果是5-8个个体肺动脉的平均值
±
1se，与新鲜未处理的对照相比，双尾t检验的统计学显示增加显示为
×
。没有观察到其他显著差异。
[0134]
确定与储存6个月的新鲜未处理对照动脉相比，模量或爆破压力没有显著降低(p＜0.05)。如图9所示，在某些情况下(统计学显著，p＜0.05(双尾t检验))，玻璃化冷冻保存的动脉具有比新鲜未处理的对照更高的爆裂压力。
[0135]
方法：
[0136]
组织采购：确为过量的组织血管来自当地usda查验的肉类加工厂的猪。将动脉部分解剖，冲洗并置于无菌冰冷的采购溶液(hanks平衡盐溶液)中并运送至实验室用于进一步的体外或体内研究。在实验室收到后进一步解剖肺动脉，并置于含达氏改良伊氏培养基(dmem)和抗生素的无菌杯中。由于微生物污染的风险较高，确为过量的组织将不会用于移植研究。
[0137]
玻璃化方法：组织逐渐渗入在4℃由euro-collins溶液中的3.10m dmso，3.10m甲酰胺和2.21m 1，2-丙二醇
±
≤0.6m二糖组成的vs55或等摩尔浓度(3.5m)的dmso和1，2-丙二醇以制成dp7
±
≤0.6m二糖。dp7策略的第一加载步骤是不含二糖，然后是dp7+0.3m蔗糖+0.3m海藻糖，最后用vs55+0.3m蔗糖+0.3m海藻糖玻璃化。二糖可以是蔗糖，海藻糖，单独或组合。在冰上浓度增加的五个连续的15分钟步骤中加入预冷的稀玻璃化溶液(4℃)。在预冷的-10℃全强度玻璃化溶液中的最后第六添加步骤中加入磁性纳米颗粒(2.5mg/ml fe，由ferrotec提供的emg-308)，并在-10℃浴中在50ml塑料管中保持15分钟。然后将样品分两步降温，首先通过置于-135℃的预冷的2-甲基丁烷浴中快速降温至-100℃，然后在测试前转移至气相氮气中以较慢地降温至-135℃并在-135℃以下储存至少24小时。在一些实施方式中，纳米颗粒的有效浓度范围可以在约0.5至约10mg/ml fe的范围内，例如约1.5至约5mg/ml fe，或2.0至约3mg/ml fe。
[0138]
复温方法：在≤-135℃下不同的储存时间后，使用对流或纳米升温对玻璃化的血管进行复温。对流升温是一个两阶段过程，包括缓慢升温至-100℃，然后尽可能快地升温至熔化。通过将样品置于-135℃冷冻机的顶部产生较慢的升温速率，并且通过将塑料样品容器在室温下置于30％dmso/h2o的混合物中产生更快的升温速率。通过将样品插入射频线圈并通过感应加热来进行纳米升温。上述测试采用6.0kw感应终端，但也可以采用其他合适的感应终端。复温后，将mnp从样品管中取出，并逐步除去冷冻保护剂。如果再灌注损伤导致细胞活力/功能丧失，也可以引入具有抗氧化剂和/或抗凋亡剂补充剂的复温后孵育步骤。
[0139]
复温后的恢复是在生理条件下，在抗氧化剂和凋亡抑制剂，100μmα-生育酚(维生素e)和10μm q-vd-oph(qvd)的存在下进行的。在一些实施方式中，抗氧化剂的有效浓度范围可以在约0.5μm至约1000μm，例如约5μm至约500μm，或50μm至约200μm的范围内。在一些实施方式中，凋亡抑制剂的有效浓度范围可以在约0.1μm至约100μm，例如约1μm至约50μm，或5μm至约20μm的范围内。
[0140]
可以添加到本公开的制剂中和/或用于本公开的方法中的其他示例性补充剂和/或添加剂列于表i(上文)中。
[0141]
活力评估：使用alamarblue
tm
刃天青分析评估肺动脉的代谢活性。将组织样品在dmem+10％fbs培养基中孵育1小时以平衡，然后在标准细胞培养条件下加入20％alamarblue 3小时。在以后的研究中，dmem补充了100μmα-生育酚(维生素e)和10μm q-vd-oph(qvd)，导致组织细胞活力＞90％。alamarblue是一种基于代谢活性检测的无毒荧光指示剂。在544nm的激发波长和590nm的发射波长下以等分试样测量荧光。
[0142]
生物材料测试：将压力数据(psi)相对于径向应变作图，产生典型的软组织变形的应力-应变曲线(典型曲线图10)。线性区域用于产生最佳线拟合，产生线性模量(mmhg)。破裂前记录的最大压力用于估计爆破压力(psi)。
[0143]
尽管已经参考特定手段，材料和实施方式在本文中完成前面的描述，但其并不打算限于本文公开的细节；相反，它扩展到所有功能上等同的结构，方法和用途，例如在所附权利要求的范围内。此外，尽管上面仅详细描述了几个实施例，但是本领域技术人员将容易地认识到，在实施例中可以进行许多修改，而不会实质性地偏离大组织样品的无冰玻璃化和纳米升温的公开内容。因此，所有这些修改旨在包括在本公开的范围内，如以下权利要求中所定义的。在权利要求中，功能性限定条款旨在涵盖本文所述的执行所述功能的结构，不
仅包括结构等同物，还包括等效结构。因此，虽然钉子和螺钉可能不是结构等同物，因为钉子采用圆柱形表面将木制部件固定在一起，而螺钉采用螺旋表面，但在紧固木制部件的环境中，钉子和螺钉可以是等效结构。