一种种子消毒制剂、其制备方法、使用方法和用途与流程

本发明属于烟草病害防治技术领域，具体涉及一种种子消毒制剂、其制备方法、使用方法和用途。

背景技术：

烟草是一种重要的经济作物。由烟草花叶病毒(tmv)引起的烟草花叶病是世界各烟区的重要病毒病害。烟草花叶病严重影响了烟叶产量和质量，突出表现在病烟叶变小，单叶重下降，有效叶数减少，一般的产量损失达5-16％，严重时造成绝产。开展防治烟草花叶病的研究，对提高烟叶的产量和质量均具有重要意义。种子携带病毒的是烟草花叶病的传播途径之一。烟草花叶病毒可能沾附在种子的外表或未清理干净的碎屑中，造成苗床污染。病毒可在出苗、移苗过程中，通过造成的微伤进入幼苗而使其感染，然后再经过田间做业等传播而发展为病害。

在基因编辑工厂化育种工作推进过程中，烟草花叶病也是常发性病害。烟草花叶病发病会影响烟株的正常生长，进而严重影响了烟叶产量和质量，突出表现在病烟叶变小，单叶重下降，有效叶数减少，产量损失严重。而且还会烟叶糖的含量降低，总氮和蛋白质含量升高，刺激性增加，香气不纯，杂气增加；烟碱减少，燃烧性变差。这对编辑素材的品系比较和筛选造成严重的干扰，严重时还会造成关键素材报废，影响工作进度。种子消毒是烟草花叶病防治的重要环节，通过种子消毒，可有效防治花叶病种源传播，也可实现挈带花叶病烟株的种子脱毒，使其下一代能正常生长。

为了解决上述问题，提出本发明。

技术实现要素：

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

本发明公开了一种挈带花叶病毒的烟草种子消毒剂，其具有良好的烟草种子脱除病毒效果，而且至今尚未见到相关报道。

本发明第一方面提供一种种子消毒制剂，所述消毒制剂包含以下组分：4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮、醇溶剂；

所述4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮结构式如下：

优选地，所述消毒制剂还包含以下组分：磷酸钠、二苄基联苯基聚氧乙烯醚、水，且各组分占比为：磷酸钠8-12wt％、4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮0.05-1wt％、醇溶剂20wt％、二苄基联苯基聚氧乙烯醚1-2wt％，以所述消毒制剂的总质量为基准。

优选地，所述消毒制剂中，去除磷酸钠、4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮、醇溶剂和二苄基联苯基聚氧乙烯醚以外的余量为水。

优选地，所述4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮的制备方法，包括以下步骤：

a、浸膏提取：取基因编辑烟草的茎皮为原料，粉碎，用90～99wt％乙醇超声提取后，提取液加入到乙酸乙酯与3wt％的酒石酸混合液中，待混合溶液静置分层后，再用na2co3溶液将水层ph值调节至9.0，并用乙酸乙酯再次萃取，经过滤，减压浓缩成浸膏；

基因编辑烟草为将nttom3基因敲除的烟草；

b、硅胶柱层析：将步骤a得到的浸膏用200～300目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析；以体积配比分别为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，合并相同极性的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；其中，所述硅胶与所述浸膏的质量比为2～5；收集其中用体积比为9:1的氯仿-甲醇溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第一洗脱液；将上述第一洗脱液用硅胶层析柱继续分离，用体积配比依次为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的一系列氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集其中用体积比为8:2的氯仿-丙酮溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第二洗脱液；

c、高效液相色谱分离：将b步骤最终得到的第二洗脱液通入高效液相色谱进行分离纯化，所述高效液相色谱法分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的zorbaxprephtgf色谱柱，流速为20ml/min，流动相为53wt％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为338nm，第三洗脱液每次进样200μl，收集每次进样后色谱峰保留时间为22.9min时所对应的洗脱液，称为第三洗脱液，将该第三洗脱液脱除溶剂后即得所述4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮。

基因编辑烟草(编辑位点为nttom3基因敲除)是市场可获得的，也可以通过常规技术手段得到，因此该基因编辑烟草的制备方法不再赘述。

在本发明所述消毒剂配方组成中：

4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮为从基因编辑烟草茎皮中新发现的喹啉生物碱类化合物，该化合物具有显著的抗烟草花叶病毒活性。

磷酸钠为常用的消毒剂，用磷酸钠溶液浸种能使大部分外表面的病毒都失去了活力，但是，对在外种皮内侧病毒杀灭效果有限，不能彻底的脱除种子挈带烟草花叶病毒。

醇溶剂为助溶剂，由于消毒制剂主成分中4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮为有机物，磷酸钠为无机物，醇-水混合物对两种成分均有较好的溶解度。醇溶剂优选为乙醇。

二苄基联苯基聚氧乙烯醚为常用的助溶剂和稳定剂，具有很好的助溶和增加消毒制剂稳定性的效果，能使消毒制剂长期保持稳定。

本发明第二方面提供第一方面任一项所述消毒制剂的制备方法，所述消毒制剂包含以下组分：4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮、醇溶剂、水；

所述4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮结构式如下：

所述消毒制剂的制备方法包括以下步骤：至少将所述消毒制剂的上述组分混合后，即得到消毒制剂。

本发明第三方面提供第一方面任一项所述消毒制剂的使用方法，包含以下步骤：将烟草种子中加入5-10倍质量的所述消毒制剂，在40-50℃浸泡30-45min进行消毒，消毒完成后再用10-15倍体积的水漂洗，晾干后即可用于点种。

本发明第四方面提供第一方面所述消毒制剂的用途，所述消毒制剂用于抑制烟草花叶病毒。

本发明第五方面提供第一方面所述消毒制剂的用途，所述消毒制剂用于脱除烟草编辑素材种子挈带花叶病毒。

本发明第六方面提供第一方面所述消毒制剂的用途，所述消毒制剂用于脱除种传花叶病毒。

本发明所述抗烟草花叶病毒活性生物碱，4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮的结构鉴定方法，具体为：

本发明化合物为棕色胶状物；

紫外吸收光谱显示其在230与336nm处有最大吸收，证明该化合物中存在芳香环结构；

红外光谱(溴化钾压片)显示该化合物中有胺基(3278cm^-1)、羰基(1680、1654cm^-1)、芳香环(1612和1441cm^-1)特征官能团；高分辨质谱(hresims)给出准分子离子峰266.1112[m+na]⁺，可确定化合物的分子式为c15h17no2，不饱和度为8。结合¹h和¹³c与hsqcnmr数据，显示该化合物包括一个1,2,4,5-四取代的苯环(c-5～c-8,c-4a和c-8a,h-5和h-8)，一个异丙基(c-4'～6',h-4',和h6-5',6')，一个乙酰基(c-1',c-2',和h3-2')，一个-nh-co-ch-c-基团(c-2～4,h-1,h-3和nh)。为了满足化合物的8个不饱和度，两个羰基、一个双键、苯环和-nh-co-ch-c-基团应形成1个喹啉-2(1h)-酮结构。该推断可进一步由h-3与c-2、c-4、c-4a；nh与c-2、c-3、c-8、c-4a、c-8a；h-8与c-4a、c-8a；h-6与c-4a的hmbc相关得到证实。

化合物的母体骨架确定后，剩余的取代基位置可通过进一步分析其hmbc相关确定。根据h-2'与c-4，h-3与c-1'的hmbc相关，可确定乙酰基取代在c-4位；根据h-4'与c-6、c-7、c-8，h6-5',6'与c-7的hmbc相关，可确定异丙基取代在c-7位。最后，根据h3-3'与c-5、c-6、c-4a的hmbc相关，可确定甲基(c-1')取代在c-5位。至此，本发明化合物的结构得到确认，鉴定为4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮。

表-1.化合物的¹hnmr和¹³cnmr数据(cdcl3)

化合物的红外、紫外光谱和质谱数据：uv(meoh)λmaxnm210(4.21)、230(3.52)和336(3.15)；ir(kbr)νmax3278、2928、1680、1654、1612、1441、1229、1134、872和750cm^-1；正离子采集esimsm/z266[m+na]⁺，正离子采集hresimsm/z266.1112(计算值266.1106，对应分子式c15h17nnao2)。

本发明的有益效果如下：

1、本发明采用无机杀灭病毒成分磷酸钠和有机烟草花叶病毒抑制剂(即本发明的4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮)进行复配，并通过溶剂和助溶剂的优化，获得了可长期稳定保存的基因编辑素材种子消毒制剂。该消毒制剂可克服：“传统单独用磷酸钠溶液浸种，能使大部分外表面的病毒都失去了活力，但对在外种皮内侧病毒杀灭效果有限”的缺陷，不能完全脱除种传烟草花叶病毒。

本发明的种子消毒制剂的消毒效果非常显著，可完全的脱除烟草种子挈带的烟草花叶病毒，完全从源头上控制了烟草花叶病的传播，这是传统用磷酸钠消毒方法无法做到的。因此本发明的消毒剂为控制烟草种源花叶病的传播提供了更有效的方法。

可以比较完全脱除种传烟草花叶病毒的原因是：本发明的消毒制剂中的有机烟草花叶病毒抑制剂(即本发明的4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮)属于有机小分子化合物，可以渗透到种子的细胞壁和细胞膜中，可使种皮内侧的病毒粒体断裂，抑制病毒衣壳蛋白的聚合，从而抑制了病毒的复制。而传统的磷酸钠溶液浸种，无机杀灭病毒成分磷酸钠无法渗透到种子的细胞壁和细胞膜中，因此对在外种皮内侧病毒杀灭效果有限。

2、本发明的有机烟草花叶病毒抑制剂4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮是首次从基因编辑烟草(编辑位点为nttom3基因敲除)茎皮中分离出一种新的化合物，通过核磁共振和质谱测定方法确定了为喹啉生物碱类化合物，并表征了其具体结构。且该喹啉生物碱类化合物具有很好的抗烟草花叶病毒活性：经对抗烟草花叶病毒的实验，发现该喹啉生物碱类化合物的相对抑制率达到42.2％，其活性高于对照品宁南霉素的相对抑制率(33.0％)。以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性好，可作为抗烟草花叶病毒药物的先导性化合物。

3、由于烟草茎皮生物产量巨大，在烟叶生产过程中一般作为废弃物丢弃，本发明中的抗病毒活性关键化合物4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮提取制备原料易得、提取方法简单，容易分离得到，产业化制备容易实现。而且，本发明化合物分子结构也简单，容易实现人工合成，后续的产业化也可通过人工合成实现。

4、本发明4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮的制备中，采用了常规柱层析和高效液相色谱结合的制备方法，化合物制备操作流程简单，所获得的本发明化合物纯度高，后续的工业化生产中化合物的品质、纯度有保障。

附图说明

图1为本发明4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮化合物的核磁共振碳谱。

图2为本发明4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮化合物的核磁共振氢谱。

图3为本发明4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮化合物的主要hmbc相关。

具体实施方式

下面对本发明通过实施例作进一步说明，但不仅限于本实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例和对比例中所需要的原料均为市售。

本发明所用原料不受地区限制，均可以实现本发明，下面以具体实施例对本发明做进一步说明：

实施例1

本实施例为本发明所述喹啉生物碱类抗烟草花叶病毒活性化合物，4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮的制备方法。该化合物以烟草茎皮为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离步骤得到，具体为：

a、浸膏提取：取风干的基因编辑烟草的茎皮为原料，粉碎至20～40目，用90～99％乙醇超声提取后，提取液加入到乙酸乙酯与3％的酒石酸混合液中，待混合溶液静置分层后，再用na2co3溶液将水层ph值调节至9.0，并用乙酸乙酯再次萃取，经过滤，减压浓缩成浸膏；

基因编辑烟草为将nttom3基因敲除的烟草；

b、硅胶柱层析：浸膏用200～300目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析；以体积配比分别为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，合并相同极性的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；其中，所述硅胶与所述浸膏的质量比为2～5。氯仿-甲醇9:1洗脱液浓缩的部分再次进行硅胶柱层析，以体积配比分别为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-丙酮溶液进行洗脱，收集洗脱液的8:2部分浓缩，供高效液相色谱制备用。

c、高压液相色谱分离纯化：b步骤氯仿-丙酮8:2洗脱得到的洗脱液浓缩后，进一步用高效液相色谱分离纯化即得所述的喹啉生物碱类化合物。高效液相色谱分离纯化采用21.2mm×250mm，5μm的zorbaxprephtgf色谱柱，流速为20ml/min，流动相为53％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为338nm，每次进样200μl，收集22.9min的色谱峰，多次累加后蒸干可得化合物粗品。所得化合物粗品再次用纯甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化，获得纯度更高的纯品。

实施例2

本实施例为本发明所述4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮的结构鉴定方法。该化合物通过核磁共振、质谱、红外、紫外等波谱数据鉴定结构，具体为：

本发明化合物为棕色胶状物；

紫外吸收光谱显示其在230与336nm处有最大吸收，证明该化合物中存在芳香环结构；

红外光谱(溴化钾压片)显示该化合物中有胺基(3278cm^-1)、羰基(1680、1654cm^-1)、芳香环(1612和1441cm^-1)特征官能团；高分辨质谱(hresims)给出准分子离子峰266.1112[m+na]⁺，可确定化合物的分子式为c15h17no2，不饱和度为8。结合¹h和¹³c与hsqcnmr数据，显示该化合物包括一个1,2,4,5-四取代的苯环(c-5～c-8,c-4a和c-8a,h-5和h-8)，一个异丙基(c-4'～6',h-4',和h6-5',6')，一个乙酰基(c-1',c-2',和h3-2')，一个-nh-co-ch-c-基团(c-2～4,h-1,h-3和nh)。为了满足化合物的8个不饱和度，两个羰基、一个双键、苯环和-nh-co-ch-c-基团应形成1个喹啉-2(1h)-酮结构。该推断可进一步由h-3与c-2、c-4、c-4a；nh与c-2、c-3、c-8、c-4a、c-8a；h-8与c-4a、c-8a；h-6与c-4a的hmbc相关得到证实。

化合物的母体骨架确定后，剩余的取代基位置可通过进一步分析其hmbc相关确定。根据h-2'与c-4，h-3与c-1'的hmbc相关，可确定乙酰基取代在c-4位；根据h-4'与c-6、c-7、c-8，h6-5',6'与c-7的hmbc相关，可确定异丙基取代在c-7位。最后，根据h3-3'与c-5、c-6、c-4a的hmbc相关，可确定甲基(c-1')取代在c-5位。至此，本发明化合物的结构得到确认，鉴定为4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮。

实施例3

本实施例为本发明所述4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮的抗烟草花叶病毒活性测试方法，采用半叶法测试，具体为：

在药剂的质量浓度均为20m时对本发明化合物进行抗烟草花叶病毒活性测定。在5～6株烤烟的植株上，选取适用于测试的叶片(叶行正常，无病无虫)，先将叶片均匀撒上细金刚砂，用毛笔将备用的烟草花叶病毒源(3.0×10-3)均匀抹在撒有金刚砂的叶片上，待所有中选的叶片接毒结束后，立即放在盛有药液的培养皿中处理20min，取出，洒去叶片上水珠和约液，将两个半叶复原排放在铺有卫生纸保湿的搪瓷衙内加盖玻璃，控温(23±2)℃，放在温室自然光照射，2～3d即可见枯斑.每个处理都设另一半叶为对照，另外设有1组为商品宁南霉素的处理作为对比，按下公式计算相对抑制率：

xi％＝(ck-t)/ck×100％，

x：相对抑制率(％)，ck：浸泡于清水中半片接毒叶的枯斑数(个)，t浸泡于药液中半片接毒叶的枯斑数(个)。

结果证明：本化合物的相对抑制率为42.2％，高于对照宁南霉素的相对抑制率33.0％，说明化合物有很好的抗烟草花叶病毒活性。

实施例4

本实施例为本发明所述基因编辑素材种子消毒制剂的配制方法，具体为：

消毒制剂各成分的质量配比为：磷酸钠12％、4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮1％、乙醇30％、二苄基联苯基聚氧乙烯醚2％，余量为水。以所述制剂的总质量为基准。将上述各成分按比例混合均匀，并充分溶解，得到稳定均匀的溶液，即为本发明的消毒制剂。

实施例5

本实施例为本发明所述基因编辑素材种子消毒的方法，具体为：

在烟草种子中加入10倍质量的所述消毒制剂，在50℃浸泡45min进行消毒，消毒完成后再用15倍体积的纯净水漂洗3次，晾干后消过毒的种子即可用于点种。

用花叶病发病严重的编辑素材烟株进行收种，种子分为相同的两份，一份采用本发明的消毒制剂进行消毒作为实验组，另一份以传统的10％磷酸钠消毒作为对照组。将消毒后的实验组和对照组种植进行点种，育苗，水培移栽(苗移栽量每份为50株)；到烟株现蕾期，统计烟草花叶病的发病率。结果表明，对照组的烟草花叶病发病率为16％，而采用本发明的消毒制剂消毒的实验组未发现花叶病发病烟株。

实施例6

选择正常基因编辑素材烟株，采用人工接种病毒让其感染花叶病，然后对发病严重的植株进行收种。挈带病毒的种子分为相同的两份，一份采用本发明的消毒剂进行消毒后作为实验组，另一份以传统的10％磷酸钠消毒后作为对照组。消毒后的实验组和对照组进行点种，育苗，水培移栽(苗移栽量每份为50株)；到烟株现蕾期统计烟草花叶病的发病率。

结果表明，对照组的烟草花叶病发病率为22％，而采用本发明的消毒制剂消毒的实验组未发现花叶病发病烟株。

实施例7

实验消毒制剂：消毒制剂各成分的质量配比为：磷酸钠8％、4-乙酰-7-异丙基-5-甲基喹啉-2(1h)-酮0.05％、乙醇15％、二苄基联苯基聚氧乙烯醚1％，余量为水。以所述制剂的总质量为基准。将上述各成分按比例混合均匀，并充分溶解，得到稳定均匀的溶液，即为实验消毒制剂。

对比消毒制剂：消毒制剂各成分的质量配比为：磷酸钠8％、宁南霉素0.05％、乙醇15％、二苄基联苯基聚氧乙烯醚1％，余量为水。以所述制剂的总质量为基准。将上述各成分按比例混合均匀，并充分溶解，得到稳定均匀的溶液，即为对比消毒制剂。

选择正常基因编辑素材烟株，采用人工接种病毒让其感染花叶病，然后对发病严重的植株进行收种。挈带病毒的种子分为相同的两份，一份采用本实施例的实验消毒制剂进行消毒后作为实验组，另一份以本实施例的对比消毒制剂消毒后作为对照组。消毒后的实验组和对照组进行点种，育苗，水培移栽(苗移栽量每份为50株)；到烟株现蕾期统计烟草花叶病的发病率。

结果表明，对照组的烟草花叶病发病率为22％，而采用本发明的消毒制剂消毒的实验组未发现花叶病发病烟株。

选择正常种植过程中花叶病发病严重的植株进行收种。挈带病毒的种子分为相同的两份，一份采用本实施例的实验消毒制剂进行消毒后作为实验组，另一份以本实施例的对比消毒制剂消毒后作为对照组。消毒后的实验组和对照组进行点种，育苗，水培移栽(苗移栽量每份为50株)；到烟株现蕾期统计烟草花叶病的发病率。

结果表明，对照组的烟草花叶病发病率为16％，而采用本发明的消毒制剂消毒的实验组未发现花叶病发病烟株。

上述结果表明本发明所述的消毒制剂对烟草种传花叶病具有显著的抑制效果。