凌霄花提取物在抑制革兰氏阳性细菌生长中的应用

本发明属于中药材提取分离技术领域，涉及凌霄花提取物中抗菌成分及其在抑制革兰氏阳性细菌生长中的应用，具体涉及凌霄花提取物的制备及其抗菌成分鉴定，同时还涉及到凌霄花提取物在抑制革兰氏阳性菌生长中的应用。

背景技术：

食品安全属于民生问题，是社会和谐稳定发展的一个基本保障。病原微生物(尤其是病原细菌)是引起食源性疾病的最主要因素之一。超过200多种疾病可以通过食物传播，其大部分是食用被病原菌污染的食物或者水引起。蔬菜和水果在种植、收获、贮存、流通及预加工等从农田到餐桌的整个过程的任何环节，都可能受到土壤致病菌(如单核细胞增生李斯特菌、肉毒梭状芽孢杆菌)及粪便致病菌(如大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌)或者动物病原菌(如金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌)的污染。近几年越来越多的食源性疾病疫情都与新鲜果蔬的污染有关，因此在食物中毒溯源调查中，新鲜果蔬的病原菌污染已作为常规监测的一部分。果蔬贮藏中常使用化学保鲜剂，虽然能够杀死病原菌，达到防腐保鲜的目的，但是大多数化学合成物质对人体健康有一定的影响，甚至出现致癌、致畸、致突变等情况。此外，化学杀菌剂长期在某一地区使用会导致抗药菌株的产生，从而降低防治效果。其结果是：化学杀菌剂的使用剂量及其化学残留量大大加重，对人类健康的威胁也加大。随着科学技术的发展，人们已认识到化学防腐保鲜剂有危害健康、污染环境等缺陷，迫切需要研究无公害的高效防腐保鲜剂产品及技术，以取代化学杀菌剂的大量使用。

我国有着丰富的中草药资源，药用植物种类约为11020种。其中许多经报道含有各式各样的抗菌成分，对许多细菌微生物具有较强的抗菌能力。据不完全统计，这些中草药(主要是植物药)分属78个科，大约196种，其中已经试验证实具有抗细菌作用的有131种，抗真菌的有50种，抗病毒的有23种，有的既有抗细菌作用，又有抗真菌作用。从抗菌中草药中分离出来的活性成分，已经试验证实有抗细菌作用的有128种，抗真菌的有27种，抗病毒的有12种，其中有的既有抗细菌作用又有抗霉菌作用和抗病毒作用。研究结果表明，这些抑菌或抗菌有效成分主要有：萜类化合物及其衍生物；生物碱、酰胺及蛋白质等含氮含硫化合物；脂肪类化合物，主要是长链碳烷和脂肪酸；芳香族化合物，包括酚类、黄酮类以及醌类等。植物源杀菌剂含有复合抑菌成分，对病原菌具有多种作用机制，尤其是对那些产孢量大、繁殖周期短又易产生抗性的真菌能从多方面加以抑制，从而避免了化学杀菌剂引起的抗药性问题。与化学杀菌剂相比，植物源杀菌剂更加安全、无副作用，并能通过扩大栽培而得到价廉而丰富的原料，因此它是控制果蔬采后病害的一个很有潜力的发展方向。

凌霄花为紫葳科植物凌霄(campsisgrandiflora(thub.)k.schum.)的干燥花，具有清热凉血，化瘀散结，祛风止痒之功效。凌霄分布于长江流域至华北一带各省区，通常多栽培。凌霄花始载于《神农本草经》，列为中品，主要化学成分有黄酮类、三萜类、二苯乙烯苷类成分。现代研究表明，凌霄花具有改善血液循环、改善血流量，抑制血栓形成、抗自由基等作用。临床常用于治疗月经不调、椎基动脉供血不足、脑溢血、失眠、痤疮等。现代药理实验证明凌霄花能抑制大鼠血栓形成，其水提醇沉上清液提取物能改善老龄大鼠微循环，其甲醇提取物能显著改善致敏小鼠血流量的降低，这些均佐证凌霄花具有行血祛瘀作用。近年，分别从凌霄叶中分离出五环三萜成分和两种新的环烯醚萜，均具有抗血小板凝集作用。目前，研究多侧重于对凌霄花中抗凝血作用活性部位的研究，而尚未有对凌霄花中抗菌成分的研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种凌霄花提取物中抗菌成分及其在抑制革兰氏阳性细菌生长中的应用。本发明提供的凌霄花提取物，该提取物外观为棕色固体粉末，可溶于水，甲醇，乙醇等溶剂。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种凌霄花提取物在抑制革兰氏阳性细菌生长中的用途。

本发明还涉及一种凌霄花提取物在作为抗菌剂中的用途。本发明的凌霄花提取物可作为抗菌剂的一个新来源，用于预防由食源性致病菌引起的食物中毒和食源性疾病。具体地，如可作为叶类蔬菜的抗菌剂；可用于叶类蔬菜的保鲜贮藏，减少叶类蔬菜中的细菌负荷，预防由这些细菌引起的食物中毒或食源性疾病。

作为本发明的一个实施方案，所述抑菌剂用于抑制革兰氏阳性细菌生长。

作为本发明的一个实施方案，所述革兰氏阳性细菌包括单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌中的至少一种。

作为本发明的一个实施方案，所述凌霄花提取物中抗菌活性物质包括麦角甾苷、芹菜素-7-o-二葡萄糖醛酸甙和皮诺敛酸。

作为本发明的一个实施方案，所述凌霄花提取物是通过包括如下步骤的方法制备而得：称取干燥的凌霄花并磨碎，用有机溶媒结合超声辅助提取得到提取溶液后，再经分离和富集后得到凌霄花提取物，最后通过真空冷冻干燥机干燥得到凌霄花提取物粉末。

作为本发明的一个实施方案，所述有机溶媒为80％(v/v)乙醇；凌霄花与有机溶媒的重量用量比为1∶10-1∶20。优选凌霄花与有机溶媒的重量用量比为1∶20。

作为本发明的一个实施方案，所述微波辅助提取方法的参数为40-60℃，480w维持1-2小时。优选所述微波辅助提取方法的参数为40℃，480w维持1小时。

作为本发明的一个实施方案，所述分离方法为900-1000×g离心10-20分钟，收集上层清液。优选为900xg离心15分钟，收集上层清液。

作为本发明的一个实施方案，所述富集方法为使用旋转蒸发仪蒸发浓缩上层清液，浓缩比例为5∶1-4∶1。优选浓缩比例为4∶1。

作为本发明的一个实施方案，真空冷冻干燥的条件为：-50℃，4小时；-35℃，10小时；-10℃，10小时；25℃，24小时。

结合上述的所有技术方案，本发明具有如下有益效果：

1)本发明在研究中草药提取物的抗菌活性，以获得抗菌能力和抗菌范围更优的抗菌剂时，发现中草药凌霄花对两种代表性的革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌)具有明显的抑菌活性；

2)本发明通过使用超声波辅助提取方法，提高了凌霄花中抗菌化合物的提取效率和得率(产率为19％)；

3)通过hplc-dad和uplc-qtof-ms鉴定出凌霄花提取物中的主要抗菌成分为麦角甾苷，芹菜素-7-o-二葡萄糖醛酸甙和皮诺敛酸，明确了凌霄花提取物发挥抗菌活性的物质组成。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为不同浓度的凌霄花提取物对金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的时间-杀菌曲线；其中，a为对金黄色葡萄球菌的时间-杀菌曲线，b为对单增李斯特菌的时间-杀菌曲线；

图2为hplc-dad检测凌霄花提取物中主要化学成分色谱图；其中，a为麦角甾苷标准物质的色谱图，b为凌霄花提取物的色谱图；

图3为凌霄花提取物的uplc-ms色谱图；其中，a为正离子模式下的色谱图，b为负离子模式下的色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

具体地，本发明提供的凌霄花提取物通过以下方法制备而得：

步骤一，取干燥的凌霄花经研磨机研磨后过20-40目筛，获得凌霄花粉末。

步骤二，向步骤一中得到的凌霄花粉末中加入80％(v/v)乙醇溶液，结合超声波辅助提取的方提取凌霄花中的抗菌成分，离心取上层清液即为凌霄花提取物溶液，操作重复两次以提高凌霄花提取物的得率；凌霄花提取物粉末与乙醇的添加比例为1∶10-1∶20；超声提取的参数为40-60℃，480w下提取1-2小时；得到的凌霄花提取物溶液室温下900-1000g离心10-15分钟，收集上层清液。

步骤三，将步骤二中得到的凌霄花提取物溶液经旋转蒸发仪蒸发浓缩至适当体积(蒸发浓缩比例为原体积的1/5-1/4)后置于-80℃冰箱冷冻过夜。

步骤四，将步骤三中冷冻之后的凌霄花提取物浓缩液经真空冷冻干燥机干燥制得凌霄花提取物粉末；凌霄花提取物浓缩液真空冷冻干燥的条件为：-50℃，4小时；-35℃，10小时；-10℃，10小时；25℃，24小时。

步骤五，将步骤四中得到的凌霄花提取物粉末溶于甲醇(凌霄花提取物的甲醇溶液浓度为20mg/ml)，通过高性能液相色谱-二极管阵列检测(hplc-dad)和超高性能液相色谱-四极飞行时质谱仪(uplc-qtof-ms)检测凌霄花提取物主要抗菌成分。

步骤六，将步骤四中得到的凌霄花提取物粉末溶于dmso中，制成不同浓度(分别为25mg/ml，50mg/ml，100mg/ml和200mg/ml)的凌霄花提取物溶液，用于检测凌霄花提取物对单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性。凌霄花提取物的抗菌活性评价方法包括抑菌圈直径diz的测量，最小抑菌浓度mic和，最小杀菌浓度mbc检测和时间杀菌实验。

具体示例如下：

实施例1、凌霄花提取物的制备

将干燥的凌霄花研磨成粉，过20-40目筛。向100克凌霄花粉末中加入2升80％的乙醇，辅助超声提取的方法在40℃，480w下超声1小时。室温下900xg离心15分钟，去上层清液，残留物再次加入2升的80％乙醇重新提取1小时。上层清液在40℃的旋转蒸发仪中蒸发浓缩至原体积的1/5-1/4，浓缩后的提取物经过-80℃冷冻过夜后在真空冷冻干燥机中干燥，得到凌霄花提取物粉。本发明所述的凌霄花提取物粉末的得率为19％。

实施例2、凌霄花提取物的抗菌活性

将凌霄花提取物粉末以不同浓度(25mg/ml，50mg/ml，100mg/ml和200mg/ml)溶于二甲基亚砜(dmso)中，以进行抗菌活性研究。本发明选用两种代表性的革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(s.aureusatcc25923)和单增李斯特菌(l.monocytogenesatcc7644)。首先将胰蛋白胨大豆肉汤(tsb)琼脂板上生长的单个菌落接种到tsb培养基中，并在37℃和250rpm条件下振荡过夜培养。将细菌悬浮液调为1×10⁶cfu/ml的浓度用于以下抗菌实验。

1.抑菌圈直径diz的测定

为了测试凌霄花提取物对革兰氏阳性菌的抑菌作用，本发明设置了四个不同浓度的凌霄花提取物(25mg/ml，50mg/ml，100mg/ml和200mg/ml)，通过0.22μm滤膜过滤，4℃储存备用。用无菌lb培养基将所有细菌稀释至约1×10⁶cfu/ml，然后通过无菌玻璃珠(直径6mm)将100μl的每种细菌悬浮液均匀地分散在lb琼脂平板的表面上。将牛津杯(内径为6mm，外径为7.8mm，高度为10mm)轻轻放在琼脂表面上，然后向牛津杯中滴加60微升不同浓度的凌霄花提取物(25mg/ml，50mg/ml，100mg/ml和200mg/ml)，37℃培养16～18小时，测量抑菌圈的直径。使用氨苄青霉素(10μl/ml)作为阳性对照，dmso(60μl/cup)作为阴性对照，实验重复两次，每次三个平行。

2.最低抑制浓度(mic)和最小杀菌浓度(mbc)测试

将100μlmh培养基添加到96孔培养板中，然后将100mg/ml的凌霄花提取物进行两倍连续稀释，最终浓度范围为0.39mg/ml至50mg/ml。依次向各个孔中添加不同浓度的凌霄花提取物20μl。之后将100μl的标准细菌悬浮液(1x10⁶cfu/ml)添加到每个测试孔中，以使每个孔中的最终体积为220μl。将孔板在37℃下孵育24小时。孵育后，将30μl新鲜制备的刃天青(0.015％)添加到所有测试孔中，并进一步孵育2小时，以使存活的微生物将蓝色刃天青染料代谢为粉红色刃天青。另设阳性对照(菌液+mh肉汤)、阴性对照(只含mh肉汤)。mic的定义为未显示颜色变化的测试孔所对应的凌霄花提取物浓度。将浓度等于或高于mic值的孔中的溶液直接孵育到mh平板上，将没有菌落生长的最低浓度定义为mbc。氨苄青霉素和奥沙西林用作阳性对照，实验重复三次，每次三个平行。

表1凌霄花提取物对两种革兰氏阳性菌的抑菌活性

表1结果表明：凌霄花提取物显示出对革兰阳性细菌(单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌)明显的抑菌活性，对两种革兰氏阳性菌的mic值均为5mg/ml。

实施例3、时间-杀菌实验

使用不同浓度的凌霄花提取物(1/2×mic，mic×，2×mic和4×mic)处理上述两种革兰氏阳性菌。通过确定lgcfu/ml与时间之间关系构建时间-杀菌曲线。新鲜芹菜叶(10g)用蒸馏水清洗三次之后，放在生物安全柜中干燥2小时，以去除水分。干燥后，将芹菜叶暴露在紫外线下30分钟，以消除原生微生物群。用含有10⁷cfu/ml的细菌悬浮液浸泡芹菜液2分钟后，干燥30分钟，以允许细菌附着。干燥后记录细菌的初始负荷。将附着由细菌的芹菜叶分别浸入200ml的无菌蒸馏水中和不同浓度的凌霄花花提取物溶液中15分钟。结束后将青菜叶放入无菌水中均质，取100μl均质液于tsa培养基中培养24小时。检测3，6，9，12和24小时的细菌数，实验重复三次，每次两个平行。

表220mg/ml凌霄花提取物处理芹菜叶24小时其表面细菌负荷数量变化

图1、表2结果表明：与对照相比，凌霄花提取物处理芹菜叶24小时内使其表明附着的活菌数量的明显减少。2％的凌霄花提取物处理芹菜叶24小时后，芹菜叶表面的金黄色葡萄球菌数量降至4.74±0.40lgcfu/ml，单增李斯特菌的数量降至4.29±0.10lgcfu/ml。证明凌霄花提取物可以减少芹菜叶上的细菌负荷，可用于减少新鲜叶类蔬菜中食源性致病菌的存在。

实施例4：凌霄花提取物中抗菌成分鉴定

1.hplc-dad(高性能液相色谱-二极管阵列检测)

在hplc分析之前，凌霄花提取物溶解在甲醇(20mg/ml)中。使用配备二极管阵列探测器的shimadzulc-20arhplc系统进行分析。分离是在35℃下，使用shim-packgis-c18逆相柱(4.6×250毫米，5μm)进行。移动相为0.1％(v/v)甲酸(a)和100％乙酰甲酸(b)。梯度条件为0～70分钟，10～80％b；70～71分钟，80～100％b；71～74分钟，100％b；74～76分钟，100-20％b，76～86分钟，20％b。流速为0.6ml/min，上样量为20μl。通过比较保留时间和紫外光谱，对hplc的峰值进行识别。

2.uplc-qtof-ms(超高性能液相色谱-四极飞行时质谱)

样品在behc18柱(2.1毫米×100毫米，1.7μm)上分离，设置如下：柱温度：45℃；流速：0.4ml/min。移动相由0.1％(v/v)甲酸(a)和乙酰酸盐(b)(含有0.1％(v/v)甲酸)组成。梯度洗脱按如下方式执行：0分钟，5％b；3分钟，20％b；10分钟，100％b。上样量为1μl。使用配备电喷离子源(esi)的vionimsqtof质谱仪进行质量分析。质谱分析的参数如下：毛细管电压，2kv(正离子模式)，2kv(负离子模式)；锥形电压，40v；溶解气体流速，900l/h；锥形气体流速，50l/h；溶解气体温度，450℃；源温度，115℃；碰撞能量，6ev/20～45ev；采集范围，50-1000m/z。

表3uplc-qtof-ms鉴定凌霄花提取物中主要的植物化学成分

表4凌霄花提取物3种主要成分的抑菌活性

表3以及图2、图3结果表明：根据hplc-dad和uplc-qtof-ms结果分析，确定了凌霄花提取物中的主要化合物为麦角甾苷，芹菜素-7-o-二葡萄糖醛酸甙和皮诺敛酸。表4表明。麦角甾苷为凌霄花提取物中的主要抗菌物质，发挥抑制金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌生长的作用。

对比例1

本对比例参考cn201010576491中的提取方法来制备凌霄花提取物，即向100克凌霄花粉末中加入1升重量质量浓度为70％的乙醇，浸泡30分钟，提取1小时，过滤得上清液；沉淀中再加入1升重量质量浓度为70％的乙醇，提取1小时，过滤得上清液；合并两次上清液，放置蒸发皿中在水浴锅中浓缩，真空干燥，得凌霄花提取物粉末，此方法获得的凌霄花提取物得率为10％。对此方法获得凌霄花提取物(a提取物)的抗菌活性与本发明中的凌霄花提取物(b提取物)进行比较，结果如表5所示，本发明中的凌霄花提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性明显优于本对比例方法获得的凌霄花提取物，两种提取物对金黄色葡萄菌的mic分别为5mg/ml和10mg/ml；对单增李斯特菌的mic都为5mg/ml。本发明得到的凌霄花提取物可以有效抑制金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的生长。可见，本发明明显提高了凌霄花提取物的得率，且本发明获得的凌霄花提取物抑菌活性更强。

表5两种方法得到的凌霄花提取物的抗菌活性

综上所述，本发明通过体外抑菌试验发现凌霄花提取物对革兰氏阳性菌具有明显的抑制作用，并结合hplc-dad和uplc-qtof-ms鉴定出凌霄花提取物中的主要抗菌成分，为明确其抗菌机制奠定了基础。这说明凌霄花是开发抗菌剂的一个新来源，可用于预防由食源性致病菌引起的食物中毒和食源性疾病，具有极大的推广价值。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。