一种灌注保存液

1.本发明属于器官移植技术领域，特别涉及一种灌注保存液。


背景技术：

2.目前在国内除自行研制的hca保存液之外，其他器官保存液例如university of wisconsin(uw)价格不但昂贵,基本都依赖于进口。因此，尽早研制出我们自己的对多器官或者单个器官保存效果优良且价格低廉的灌注保存液迫在眉睫。另外,目前器官的灌注保存液的缺点是仅能对器官或细胞进行静态冷藏应用，器官或细胞储存时间有限，且当保存温度升高时，器官或细胞的活力和增殖力急速降低，极易出现器官损伤或细胞凋亡的情况，从而出现不利于移植的情况。


技术实现要素：

3.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种灌注保存液，该灌注保存液能用于器官或细胞的动态保存应用，保证器官或细胞的活性，减轻移植细胞、组织或器官的冷缺血再灌注损伤,从而在保存温度变化的环境中提高细胞、组织或器官存活率，提高移植效果质量。
4.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
5.一种灌注保存液，包括以下浓度的组分：柠檬酸钾8.5
‑
10g/l；柠檬酸钠8
‑
9g/l；甘露醇30
‑
35g/l；硫酸镁8
‑
12g/l；hif
‑
ph抑制剂25
‑
1000μm；所述灌注保存液用于在保存温度发生变化条件下细胞、组织或器官的动态保存。
6.优选的，所述hif
‑
ph抑制剂为钴盐类化合物。
7.优选的，所述hif
‑
ph抑制剂为水合氯化钴，且所述水合氯化钴在所述灌注保存液中的浓度为25
‑
200μm。
8.进一步优选的，所述hif
‑
ph抑制剂为水合氯化钴，且所述水合氯化钴在所述灌注保存液中的浓度为100μm或200μm。
9.优选的，所述hif
‑
ph抑制剂为二甲基草酰甘氨酸，且所述二甲基草酰甘氨酸在所述灌注保存液中的浓度为125
‑
1000μm。
10.进一步优选的，所述hif
‑
ph抑制剂为二甲基草酰甘氨酸，且所述二甲基草酰甘氨酸在所述灌注保存液中的浓度为500或1000μm。
11.优选的，所述灌注保存液的ph为7.0
‑
8.0。
12.优选的，所述灌注保存液的渗透压为450
‑
500mosmol/kg。
13.上述灌注保存液在细胞、组织或器官移植中的应用，所述灌注保存液能减缓细胞、组织或器官在保存过程中由于保存温度变化产生的应激损伤。
14.一种细胞的保存方法，包括以下步骤：
15.(1)将细胞以一定的接种密度接种到细胞培养板中，并在常氧培养箱中培养20
‑
30小时；
16.(2)将培养后的细胞分别在如上所述的灌注保存液中冷藏20
‑
30小时，冷藏温度为3
‑
5℃；
17.(3)将细胞放回到新鲜培养基中，缓慢升温至35
‑
40℃，并培养5
‑
8天，进行细胞存活，复苏和恢复。
18.优选的，步骤(1)中细胞的接种密度为7000
‑
9000细胞/平方厘米。
19.本发明的有益效果是：
20.(1)本发明的灌注保存液体系中含有特定的hif
‑
ph抑制剂，其能有效抑制hif
‑
1α的分解，能将延长离体细胞中hif
‑
1α的寿命，提高离体细胞对环境的适应能力，能用于对细胞的动态保存，能有效减少应激损伤，在经过24小时的低温(4℃)保存后，再复温至37℃后，仍然具有较高的细胞存活率和细胞活性；
21.(2)申请人首次发现本发明的灌注保存液体系能促进hepg2球体形成模仿肝内天然组织；
22.(3)本发明的灌注保存液体系在处理离体细胞后，能使离体细胞的子细胞在离体培养时仍然具有较强的复苏能力及存活率。
附图说明
23.图1中a为admscs细胞在培养1天、3天及7天后细胞代谢活动量，图1中b为admscs细胞在培养1天、3天及7天后细胞培养液中dna的含量；
24.图2中a为hepg2细胞在灌注保存液中冷藏24小时(4℃)后细胞代谢活动量，图2中b为hepg2细胞在培养1天、3天及7天后细胞培养液中dna的含量；
25.图3为hepg2细胞在培养7天后，在约100μm厚的3d水凝胶中对hepg2细胞进行染色封装后的荧光图；
26.图4为hepg2细胞在复温(37℃，21％常氧)后30分钟细胞的hif
‑
1α表达量荧光图；
27.图5为hepg2细胞在通过试验例的方法培养后得到的hepg2子细胞，再次通过试验例的方法进行培养，且再次通过试验例的方法进行培养过程中灌注保存液均使用对比例1的灌注保存液，图5中a为hepg2子细胞在培养1天、3天及7天后细胞代谢活动量，图5中b为hepg2子细胞在培养1天、3天及7天后细胞培养液中dna的含量。
具体实施方式
28.下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
29.实施例1：
30.一种灌注保存液，包括以下浓度的组分：柠檬酸钾8.6g/l；柠檬酸钠8.2g/l；甘露醇33.8g/l；硫酸镁10g/l；水合氯化钴25μm，灌注保存液的ph为7.1，灌注保存液的渗透压为486mosmol/kg。
31.实施例2：
32.一种灌注保存液，包括以下浓度的组分：柠檬酸钾8.6g/l；柠檬酸钠8.2g/l；甘露醇33.8g/l；硫酸镁10g/l；水合氯化钴50μm，灌注保存液的ph为7.1，灌注保存液的渗透压为486mosmol/kg。
33.实施例3：
34.一种灌注保存液，包括以下浓度的组分：柠檬酸钾8.6g/l；柠檬酸钠8.2g/l；甘露醇33.8g/l；硫酸镁10g/l；水合氯化钴100μm，灌注保存液的ph为7.1，灌注保存液的渗透压为486mosmol/kg。
35.实施例4：
36.一种灌注保存液，包括以下浓度的组分：柠檬酸钾8.6g/l；柠檬酸钠8.2g/l；甘露醇33.8g/l；硫酸镁10g/l；水合氯化钴200μm，灌注保存液的ph为7.1，灌注保存液的渗透压为486mosmol/kg。
37.实施例5：
38.一种灌注保存液，包括以下浓度的组分：柠檬酸钾8.6g/l；柠檬酸钠8.2g/l；甘露醇33.8g/l；硫酸镁10g/l；二甲基草酰甘氨酸125μm，灌注保存液的ph为7.1，灌注保存液的渗透压为486mosmol/kg。
39.实施例6：
40.一种灌注保存液，包括以下浓度的组分：柠檬酸钾8.6g/l；柠檬酸钠8.2g/l；甘露醇33.8g/l；硫酸镁10g/l；二甲基草酰甘氨酸250μm，灌注保存液的ph为7.1，灌注保存液的渗透压为486mosmol/kg。
41.实施例7：
42.一种灌注保存液，包括以下浓度的组分：柠檬酸钾8.6g/l；柠檬酸钠8.2g/l；甘露醇33.8g/l；硫酸镁10g/l；二甲基草酰甘氨酸500μm，灌注保存液的ph为7.1，灌注保存液的渗透压为486mosmol/kg。
43.实施例8：
44.一种灌注保存液，包括以下浓度的组分：柠檬酸钾8.6g/l；柠檬酸钠8.2g/l；甘露醇33.8g/l；硫酸镁10g/l；二甲基草酰甘氨酸1000μm，灌注保存液的ph为7.1，灌注保存液的渗透压为486mosmol/kg。
45.实施例9：
46.一种灌注保存液，包括以下浓度的组分：柠檬酸钾10g/l；柠檬酸钠9g/l；甘露醇35g/l；硫酸镁8g/l；水合氯化钴50μm，灌注保存液的ph为7.0，灌注保存液的渗透压为450mosmol/kg。
47.实施例10：
48.一种灌注保存液，包括以下浓度的组分：柠檬酸钾8.5g/l；柠檬酸钠8g/l；甘露醇30g/l；硫酸镁12g/l；二甲基草酰甘氨酸500μm，灌注保存液的ph为8.0，灌注保存液的渗透压为500mosmol/kg。
49.对比例1：
50.一种灌注保存液，与实施例1相比唯一的不同之处在于该灌注保存液中不含hif
‑
ph抑制剂，其余配方及配方浓度与实施例1完全相同。
51.试验例：
52.按照以下步骤进行试验：
53.(1)分别将admscs细胞(人脂肪来源间充质干细胞)和hepg2细胞(人肝细胞)以8000细胞/平方厘米的密度接种到96孔板中，并在常氧培养箱中培养24小时；
54.(2)将培养后的细胞分别在实施例1
‑
8及对比例1中的灌注保存液中冷藏24小时，
冷藏温度为4℃；
55.(3)将细胞放回到新鲜培养基中，慢慢变暖至37℃，并培养7天，进行细胞存活，复苏和恢复。
56.分析细胞的代谢活性、并通过dna含量分析细胞的增殖情况。
57.测试结果如图1
‑
图5所示。
58.由图1可知，当采用本发明的灌注保存液对admscs细胞进行处理后，对admscs细胞的代谢活性及增殖均产生了较大影响，经过本发明的灌注保存液处理后，然后再复温(37℃)应激后，admscs细胞仍然具有较强的复苏和恢复能力，从而表明本技术的灌注保存液能显著提高admscs细胞复苏能力及细胞存活率。
59.由图2中a可知，当采用本发明的灌注保存液对hepg2细胞进行处理后，hepg2细胞在4℃下进行冷藏时仍然具有较强的代谢能力，由图2中b可知，当采用本发明的灌注保存液对hepg2细胞进行处理后，对hepg2细胞的增殖产生了较大影响，经过本发明的灌注保存液处理后，然后再复温(37℃)应激后，hepg2细胞仍然具有较强的复苏和恢复能力，可知本技术的灌注保存液能显著提高hepg2细胞复苏能力及细胞存活率。
60.由图3可知，当本技术的灌注保存液中水合氯化钴的浓度为100μm或者200μm时，或者当本技术的灌注保存液中二甲基草酰甘氨酸的浓度为500μm或者1000μm时，本技术的灌注保存液能促进hepg2球体形成模仿肝内天然组织。
61.由图4可知，当本技术的灌注保存液中水合氯化钴的浓度为100μm或者200μm时，或者当本技术的灌注保存液中二甲基草酰甘氨酸的浓度为500μm或者1000μm时，本技术的灌注保存液能稳定hif
‑
1α半衰期由不到5分钟延长至30分钟。
62.由图5可知，当本技术的灌注保存液中水合氯化钴的浓度为100μm或者200μm时，或者当本技术的灌注保存液中二甲基草酰甘氨酸的浓度为500μm或者1000μm时，hepg2细胞在通过试验例的方法培养后得到的hepg2子细胞，再次通过试验例的方法进行培养，且再次通过试验例的方法进行培养过程中灌注保存液均使用对比例1的灌注保存液，hepg2子细胞仍然具有较强的代谢能力，同时在复温(37℃)应激后，hepg2子细胞仍然具有较强的复苏和恢复能力，说明本发明的灌注保存液在处理离体细胞后，能使离体细胞的子细胞在离体培养时仍然具有较强的复苏能力及存活率。
63.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。