丙酰胺在制备杀线虫制剂中的应用的制作方法

1.本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及丙酰胺在制备杀线虫制剂中的应用。


背景技术：

2.目前已发现超过200余属5000余种能够寄生植物的线虫。其中，根结线虫(meloidogyne spp.)和孢囊线虫(heterodera spp.和globodera spp.)的危害最为严重。
3.根结线虫可以寄生几乎所有维管束植物，其中南方根结线虫(m.incognita)、北方根结线虫(m.hapla)、爪哇根结线虫(m.javanica)和花生根结线虫(m.arenaria)的危害最为严重，近年来在我国象耳豆根结线虫(m.enterolobii)的危害也日趋加重。根结线虫的雌虫将卵产于由保护性胶质基质组成的卵块中，经过胚胎发育形成的一龄幼虫会在卵内蜕皮成为具有侵染能力的二龄幼虫，其会在土壤中迁移寻找宿主，一旦找到宿主的根后会钻入植物体内，在取食位点处诱导植物形成数个巨大细胞，之后经过三次蜕皮二龄幼虫发育成为具有生殖能力的成虫，植物也由此产生根结。由此可见，根结线虫病的防治窗口期主要集中于二龄线虫在土壤中迁移寻找宿主的时期，一旦线虫进入宿主体内，几乎无法采取人工措施在消灭线虫的同时保护植物不受损伤。这个防治窗口期时间较短，一般为两周以内，这也增加了根结线虫防治的难度。
4.鉴于根结线虫的生活史特点，我国针对植物线虫病害提倡“预防为主，综合防治”的植保方针。现有针对根结线虫的防治方法主要包括农业防治、物理防治、化学防治和生物防治等。其中农业防治和物理防治的效率较低，不符合现代农业发展的需求；化学防治是目前的主要防治手段，但部分化学药品对环境不友好，且目前线虫的抗性问题已日趋严重；生物防治是利用线虫天敌或具有杀线虫活性的生物天然产物防治植物线虫。例如阿维菌素已作为农田杀线剂得到广泛使用；淡紫拟青霉可以有效抑制线虫虫卵并已开发出相应产品；其他还有一些生防菌，如少孢节丛孢菌、芽胞杆菌、假单胞菌等相关的防线产品也都在开发中。
5.本发明所述丙酰胺(propionamide)(cas号：79-05-0)是一种小分子物质，分子式为c3h7no，物理性质溶于水、乙醇、乙醚和氯仿。丙酰胺可由丙酸与氨反应而得。
6.本技术首次发现丙酰胺具有杀线虫活性。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供丙酰胺在制备杀线虫制剂中的应用，特别是根结线虫杀虫剂和/或孢囊线虫杀虫剂中的应用。所述的丙酰胺分子式为c3h7no，分子量为73.09。该小分子物质具备杀线虫活性，其化学式如下：
[0008][0009]
为了达到以上目的，本发明采用以下技术措施：
[0010]
丙酰胺在制备线虫杀虫剂中的应用，应用过程包括以丙酰胺为主效成分或者主效成分之一制备成杀线虫制剂；
[0011]
以上所述的应用中，优选的，所述的线虫为南方根结线虫、爪哇根结线虫或大豆孢囊线虫。
[0012]
以上所述的应用中，优选的，丙酰胺与甜菜碱或甲基丙二酸复配制备成杀线虫制剂，所述丙酰胺与甜菜碱或甲基丙二酸的质量比为1～10:1～10。
[0013]
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
[0014]
本发明首次报道了丙酰胺其杀线虫活性，该制剂为新型杀植物线虫制剂的研发提供了新的资源。
[0015]
丙酰胺制备的杀线剂具有高效、低毒、持续性好的优点，对多个危害严重的植物寄生线虫均有防效。
[0016]
本发明的丙酰胺与甜菜碱或甲基丙二酸复配后，对杀线虫的杀虫能力具有显著提高，二者互相有协同增效作用。
附图说明
[0017]
图1为丙酰胺杀南方根结线虫的效果图；
[0018]
图中a为200μg/ml丙酰胺作用线虫48h的效果；b为空白对照中的线虫。
具体实施方式
[0019]
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为报道的微生物学常规操作方法，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
[0020]
实施例1：
[0021]
丙酰胺在制备杀南方根结线虫制剂中的应用，应用过程如下：
[0022]
从感染南方根结线虫的番茄根部挑取线虫卵块，将卵块置于盛有15ml无菌水的培养皿中20℃黑暗孵育，观察根结线虫孵化情况。通过离心收集线虫，并计算线虫浓度。
[0023]
将购买自公司的丙酰胺配置成1mg/ml的水溶液，加入到96孔板中，通过加无菌水使使丙酰胺终浓度依次为200，100，50，25，12.5，6.25μg/ml，每孔加入30—40头线虫，生测总体系为100μl，以无菌水做阴性对照，每组3次重复。置于20℃培养箱中黑暗培养48h后镜检统计线虫死亡率，镜检前在96孔板中加入1μl 5m naoh溶液，如图1所示，线虫僵直不动的为死亡线虫，线虫弯曲扭动的为活线虫。丙酰胺对南方根结线虫的活性如表1所示，lc
50
为22.87μg/ml。
[0024]
表1丙酰胺对南方根结线虫的杀虫活性
[0025][0026]
利用上述方法，申请人对已报道的杀线虫物质甜菜碱和甲基丙二酸的杀虫活性进行了测试，经测试甜菜碱和甲基丙二酸对南方根结线虫的lc
50
分别为124.54μg/ml和28.04μg/ml。
[0027]
实施例2：
[0028]
丙酰胺在制备杀爪哇根结线虫制剂中的应用，应用过程如下：
[0029]
从感染爪哇根结线虫的番茄根部挑取线虫卵块，将卵块置于盛有15ml无菌水的培养皿中20℃黑暗孵育，观察根结线虫孵化情况。通过离心收集线虫，并计算线虫浓度。
[0030]
将1mg/ml的丙酰胺水溶液加入到96孔板中，使丙酰胺终浓度依次为400，200，100，50，25，12.5μg/ml，每孔加入30—40头线虫，生测总体系为100μl，以无菌水做阴性对照，每组3次重复。置于20℃培养箱中黑暗培养48h后镜检统计线虫死亡率，丙酰胺对爪哇根结线虫的活性如表2所示，lc
50
为107.02μg/ml。
[0031]
表2丙酰胺对爪哇根结线虫的杀虫活性
[0032][0033][0034]
实施例3：
[0035]
丙酰胺在制备杀大豆孢囊线虫制剂中的应用，应用过程如下：
[0036]
从感染大豆孢囊线虫(heterodera glycines)的大豆根部挑取线虫孢囊，将孢囊擦破释放卵后置于盛有15ml无菌水的培养皿中20℃黑暗孵育，观察根结线虫孵化情况。通过离心收集线虫，并计算线虫浓度。
[0037]
将1mg/ml的丙酰胺水溶液加入到96孔板中，使丙酰胺终浓度依次为400，200，100，50，25，12.5μg/ml，每孔加入30—40头线虫，生测总体系为100μl，以无菌水做阴性对照，每组3次重复。置于20℃培养箱中黑暗培养48h后镜检统计线虫死亡率，丙酰胺对大豆孢囊线虫的活性如表3所示，lc
50
为46.09μg/ml。
[0038]
表3丙酰胺对大豆孢囊线虫的杀虫活性
[0039][0040]
实施例4：
[0041]
丙酰胺在制备杀腐烂茎线虫制剂中的应用，应用过程如下：
[0042]
从感染腐烂茎线虫(ditylenchus destructor，另一种危害马铃薯、甘薯的植物线虫)的甘薯中通过浅盘法使混合龄期线虫迁移到水中。通过离心收集线虫，并计算线虫浓度。
[0043]
将1mg/ml的丙酰胺水溶液加入到96孔板中，使丙酰胺终浓度依次为800，400，200，100，50，25μg/ml，每孔加入30—40头线虫，生测总体系为100μl，以无菌水做阴性对照，每组3次重复。置于20℃培养箱中黑暗培养48h后镜检统计线虫死亡率，丙酰胺对腐烂茎线虫的活性如表4所示，lc
50
为167.38mg/ml，活性较低。
[0044]
表4丙酰胺对腐烂茎线虫的杀虫活性
[0045][0046]
实施例5：
[0047]
丙酰胺在制备杀秀丽隐杆线虫制剂中的应用，应用过程如下：
[0048]
从培养有4龄秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans)幼虫的培养皿中使用m9缓冲液将线虫洗脱下来，通过离心收集线虫，并计算线虫浓度。
[0049]
将500μg/ml的丙酰胺水溶液加入到96孔板中，通过加无菌水使丙酰胺终浓度依次为400，200，100，50，25，12.5μg/ml，每孔加入30-40头线虫，生测总体系为100μl，以无菌水做阴性对照，每组3次重复。置于20℃培养箱中黑暗培养48h后镜检统计线虫死亡率，丙酰胺对秀丽隐杆线虫的活性如表5所示，lc50为21760.91mg/ml。
[0050]
表5丙酰胺对秀丽隐杆线虫的杀虫活性
[0051][0052][0053]
实施例6：
[0054]
丙酰胺复配甜菜碱在制备杀南方根结线虫制剂中的应用，应用过程如下：
[0055]
从感染南方根结线虫的番茄根部挑取线虫卵块，将卵块置于盛有15ml无菌水的培养皿中20℃黑暗孵育，观察根结线虫孵化情况。通过离心收集线虫，并计算线虫浓度。
[0056]
将1mg/ml的丙酰胺和甜菜碱复配水溶液(质量比为1:1)加入到96孔板中，通过加
无菌水使复配溶液终浓度依次为200，100，50，25，12.5，6.25μg/ml，每孔加入30—40头线虫，生测总体系为100μl，以无菌水做阴性对照，每组3次重复。置于20℃培养箱中黑暗培养48h后镜检统计线虫死亡率，丙酰胺和甜菜碱复配水溶液(质量比为1:1)对南方根结线虫的活性如表6所示，lc
50
为13.92μg/ml，两种物质复配后对根结线虫的活性表现为协同增效。
[0057]
表6丙酰胺复配甜菜碱对南方根结线虫的杀虫活性
[0058][0059]
按照上述方法，测得丙酰胺和甜菜碱复配水溶液(质量比为5:1)对南方根结线虫的lc
50
为22.04μg/ml，丙酰胺和甜菜碱复配水溶液(质量比为1:5)对南方根结线虫的lc
50
为45.61μg/ml，丙酰胺和甜菜碱复配水溶液(质量比为10:1)对南方根结线虫的lc
50
为20.07μg/ml，丙酰胺和甜菜碱复配水溶液(质量比为1:10)对南方根结线虫的lc
50
为25.43μg/ml，两种物质按上述比例复配后对根结线虫的活性均表现为协同增效。
[0060]
实施例7：
[0061]
丙酰胺复配甲基丙二酸在制备杀南方根结线虫制剂中的应用，应用过程如下：
[0062]
从感染南方根结线虫的番茄根部挑取线虫卵块，将卵块置于盛有15ml无菌水的培养皿中20℃黑暗孵育，观察根结线虫孵化情况。通过离心收集线虫，并计算线虫浓度。
[0063]
将1mg/ml的丙酰胺和甲基丙二酸复配水溶液(质量比为1:1)加入到96孔板中，通过加无菌水使复配溶液终浓度依次为200，100，50，25，12.5，6.25μg/ml，每孔加入30—40头线虫，生测总体系为100μl，以无菌水做阴性对照，每组3次重复。置于20℃培养箱中黑暗培养48h后镜检统计线虫死亡率，丙酰胺和甲基丙二酸复配水溶液(质量比为1:1)对南方根结线虫的活性如表7所示，lc
50
为22.56μg/ml，两种物质复配后对根结线虫的活性表现为协同增效。
[0064]
表7丙酰胺复配甲基丙二酸对南方根结线虫的杀虫活性
[0065][0066]
按照上述方法，测得丙酰胺和甲基丙二酸复配水溶液(质量比为5:1)对南方根结线虫的lc
50
为18.20μg/ml，丙酰胺和甲基丙二酸复配水溶液(质量比为1:5)对南方根结线虫的lc
50
为21.44μg/ml，丙酰胺和甲基丙二酸复配水溶液(质量比为10:1)对南方根结线虫的lc
50
为14.48μg/ml，丙酰胺和甲基丙二酸复配水溶液(质量比为1:10)对南方根结线虫的lc
50
为18.12μg/ml，两种物质按上述比例复配后对根结线虫的活性均表现为协同增效。