一种心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法及应用与流程

131，将碘-131通过腹腔注射的方式给药，给药时间为8～10周。
18.结合第一方面，在本技术的第一方面的第七种可能的示例中，上述大鼠包括sd大鼠、wistar大鼠和bn大鼠中的任意一种或多种。
19.结合第一方面，在本技术的第一方面的第八种可能的示例中，上述大鼠的重量为180～300g。
20.在第二方面，本技术示例提供了一种上述心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法得到的心肌肥大和骨质疏松的动物模型在筛选甲状腺功能亢进疾病、甲状腺功能亢进性心脏病、甲状腺功能亢进性骨质疏松疾病药物中的应用。
21.在上述技术方案中，基于构建的心肌肥大和骨质疏松的动物模型，可以进行治疗甲状腺功能亢进疾病、甲状腺功能亢进性心脏病、甲状腺功能亢进性骨质疏松疾病药物的药物验证、药物筛选。
附图说明
22.为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
23.图1为本技术对照组和实施例1的大鼠的骨质疏松micro-ct检测图像；
24.图2为本技术实施例1的心脏短轴超声m型分析图；
25.图3为本技术对照组的心肌肥厚病理检测图；
26.图4为本技术实施例1的心肌肥厚病理检测图；
27.图5为本技术实施例5的心肌肥厚病理检测图。
具体实施方式
28.下面将结合实施例对本技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本技术，而不应视为限制本技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
29.心脏病和骨质疏松症之间存在明确的关联性，两种疾病存在多种相同的致病因素。在临床上甲状腺功能亢进会诱发甲状腺功能亢进性心脏病，甲状腺功能亢进性骨质疏松等并发症。甲状腺功能亢进症简称“甲亢”，是由于甲状腺合成释放过多的甲状腺激素，造成机体代谢亢进和交感神经兴奋，引起心悸、出汗、进食和便次增多和体重减少的病症。但目前国内外尚无同时可诱发心肌肥厚和骨质疏松两种疾病类型的动物模型，使得该类疾病发病机制的探索，两种病症的关联性及药物评价难以开展。
30.心肌肥厚通常是作为对血流动力学压力或心肌损伤的适应性反应而引发的，表现为心肌质量增加，收缩力增加，对增强心脏功能降低心室壁张力和耗氧量具有补偿作用，有助于维持心输出量，维持正常的血液循环，是一种缓慢发展的有效代偿功能。但这种代偿功能也有其不利之处，主要因为肥大的心肌需氧增加，而冠状动脉的供血量往往不能予以满足，造成心肌缺血，这将最后导致心肌收缩力的减退，甚至引发心力衰竭，危及生命。
31.现有心肌肥厚动物模型构建方法主要包含了物理法、化学法和生物法。其中物理法又包括主动脉缩窄法(transverse aortic constriction，tac)、腹主动脉缩窄法(abdominal aortic constriction，aac)、肾型高血压法、动静脉造瘘法和doca盐敏感性高血压法。这几种方法全部需要通过手术的方式结扎或缩窄机体血管，或损伤/摘除机体组织器官。化学法主要包括使用去甲肾上腺素、去氧肾上腺素、异丙肾上腺素和血管紧张素等方式进行。
32.目前人类心肌肥厚疾病动物模型制作主要存在以下问题：
33.1、无法模拟人类心肌肥厚发病机制，难以准确评估药物疗效：人类心肌肥厚发病主要因为心脏负荷增大的代偿反应，而上述造模方法通过手术的方法缩窄损伤血管，损伤脏器，与临床的发病机制相差甚远。无法模拟人类心肌肥厚发病机制，用于药效研究，不能充分模拟药物在人类心肌肥厚疾病的作用，难以准确评估药物疗效。
34.2、手术造模方法创伤大：主动脉缩窄法需要对动物进行开胸手术，创伤极大，死亡率高。腹主动脉缩窄法、doca盐敏感性高血压法、肾型高血压法和动静脉造瘘法，需要对动物进行开腹手术，腹主动脉、肾动脉等均位于腹腔后壁，需要将肠道翻开，术后极大概率发生腹腔粘连，造成动物消化不良，甚至肠梗阻等副作用频繁发生，引起动物死亡。
35.3、伤口感染几率大：由于开胸或开腹手术造成的损伤较大，破坏的毛细血管较多难免造成出血，不利于伤口愈合，存在一定感染几率。术后大部分动物伴随炎症。
36.4、手术时间长：现有技术操作流程从消毒、开口、分离、夹持、缝合到消炎处理在操作熟练的情况下每只动物大约需要50分钟。
37.5、副损伤多：为避免开胸引起的胸腔内正压还需要进行气管插管，对动物气管及肺部均造成损伤；开腹手术造成的腹腔和肠道粘连，容易诱发其他疾病。
38.6、模型一致性差，损伤程度不一：由于动物个体差异，血管粗细程度不同，位置不同，造成手术中缩窄程度不一致，结扎位点会出现偏差，造成手术本身诱发的伤害程度不一致。且由于动物对手术创伤的耐受性不同，造成不同程度的副损伤，引起疾病模型本身不应具备的损伤，例如高血压等。
39.7、各种肾上腺素类激素造模方式会引发除疾病本身的疾病，例如心动过速，库欣综合征，机体多器官负荷过重。
40.骨质疏松症是由于多种原因导致的骨量低下、骨组织微结构损坏、骨脆性增加和易于发生骨折为特征的全身性骨病，常引起胸腰椎、髋部、尺骨和肱骨骨折。椎体压缩性骨折会导致胸廓畸形，腹部受压，影响心肺功能。骨质疏松引起的全身性疼痛是患者活动受限，增加肺部感染、褥疮发生率，给个人、家庭和社会带来沉重的经济负担。
41.目前骨质疏松动物模型构建方法主要包含手术摘除卵巢法、手术摘除甲状旁腺法、手术损毁下丘脑法、皮质激素诱导法和其他性激素(促黄体生成激素、卵泡刺激素等)法。
42.目前人类骨质疏松症动物模型制作主要存在以下问题：
43.1、无法模拟人类骨质疏松症发病机制，难以准确评估药物疗效：人类骨质疏松发病主要因为年龄增长造成的骨质丢失，而甲状腺功能亢进性骨质疏松症，主要由于因甲状腺激素过量或缺乏而造成代谢性骨病，而上述造模方法通过手术的方法这摘除/损坏甲状腺、卵巢、下丘脑等方式形成，与临床的发病机制相差甚远。无法模拟骨质疏松症发病机制，
用于药效研究，不能充分模拟药物在人类骨质疏松症的作用，难以准确评估药物疗效。
44.2、手术创伤大：卵巢摘除法、甲状旁腺摘除法和下丘脑损毁法均需要对动物进行不同部位的手术，涉及到麻醉，手术切口等，手术操作本身的创伤大，甚至引起动物死亡。
45.3、伤口感染几率大：由于手术造成的损伤较大，破坏的毛细血管较多难免造成出血，不利于伤口愈合，存在一定感染几率。术后大部分动物伴随炎症。
46.4、手术时间长：现有技术操作流程从消毒、开口、分离、夹持、缝合到消炎处理在操作熟练的情况下每只动物大约需要20～50分钟。
47.5、副损伤多：各类手术操作，除本身疾病模型需要的损伤外，或多或少都伴有其他副损伤，容易诱发其他疾病。
48.6、模型一致性差，损伤程度不一：由于动物个体差异，造成手术本身诱发的伤害程度不一致。
49.7、注射各种糖皮质激素和性激素造模方式会引发除疾病本身的疾病，例如生殖系统疾病。
50.以下针对本技术实施例的一种心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法及应用进行具体说明：
51.本技术提供一种心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法，其包括：给药大鼠，每天给药1次，持续8～14周。
52.药物包括左甲状腺素钠片(优甲乐)或碘-131。
53.本技术的心肌肥厚和骨质疏松的动物模型的构建方法具有以下特点：
54.1、无需手术，无需麻醉，不会对动物造成其他损伤，灌胃或腹腔注射操作简单易行。
55.2、该模型同时诱导两种疾病症状，即心肌肥厚疾病和骨质疏松症，且两种疾病具有确切的相关性。
56.3、该模型两种疾病症状发病机理与临床上甲状腺功能亢进并发症中的心脏病和骨质疏松症的发病机制完全一致，均因甲状腺功能亢进，引发机体新陈代谢加快，心脏负荷过重，处于代偿的原因导致了心肌肥厚，进而形成甲状腺功能亢进性心脏病；同时，因为机体代谢加快，心脏负荷增加，血液循环速度加快，导致了骨的过度消耗，从而形成了甲状腺功能亢进性骨质疏松症。
57.4、该模型两种疾病与临床上甲状腺素功能亢进性心脏病和骨质疏松病症特点完全一致。首先在甲亢方面，经优甲乐灌胃或碘-131腹腔注射的大鼠出现明显的亢奋，具有攻击性，体重增长缓慢甚至降低，进食增加，饮水量增加，和临床上甲亢病人三多一少的症状完全吻合。另外经血液生化检测，游离三碘甲腺原氨酸(ft3)、游离甲状腺素(ft4)、促甲状腺素(tsh)较正常动物显著增高，与临床症状一致。骨质疏松经micro-ct检测，相对骨体积和骨小梁厚度均显著降低，与临床诊断骨质疏松症症状吻合。经优甲乐灌胃或碘-131腹腔注射后大鼠心脏/体重比明显增加，结合超声和病理检测，显示心脏结构发生代偿性改变，心脏内心肌数量增加，心肌发生肿胀肥厚，与临床症状一致。
58.5、该模型两种疾病发展进程与临床上甲状腺素功能亢进性心脏病和骨质疏松疾病进程基本一致。
59.6、一致性较高：因灌胃剂量或腹腔注射可控，灌胃操作稳定可行，造模手段完全一
致，所以模型一致性好，重复性高。
60.当药物包括左甲状腺素钠片时，将左甲状腺素钠片通过灌胃的方式给药。
61.灌胃包括先将灌胃针插入大鼠的食管内，注入左甲状腺素钠片溶液。
62.需要说明的是，在灌胃前，需要使左甲状腺素钠片充分溶解于溶剂，并摇匀，以保证药物剂量的一致性。
63.每天给药1次，大鼠每100g每次给药左甲状腺素钠片40～80μg，持续给药10～14周。
64.可选地，大鼠每100g每次给药左甲状腺素钠片60μg。
65.在本技术的一种实施方式中，大鼠每100g每次给药左甲状腺素钠片60μg。在本技术的其他一些实施方式中，大鼠每100g每次给药左甲状腺素钠片40μg、45μg、50μg、55μg、65μg、70μg、75μg或80μg。
66.可选地，持续给药12周。
67.在本技术的一种实施方式中，持续给药12周。在本技术的其他一些实施方式中，持续给药10周、11周、13周或14周。
68.左甲状腺素钠片溶液的浓度为40～80μg/ml，左甲状腺素钠片溶液的每次注入量为2～5ml。
69.左甲状腺素钠片溶液的溶剂为超纯水、去离子水或纯净水。
70.可选地，药物还包括铝碳酸镁片。
71.铝碳酸镁片能够减少左甲状腺素钠片对胃肠道的刺激，减缓大鼠急、慢性胃炎，反流性食管炎，胃、十二指肠溃疡以及与胃酸有关的胃部不适症状，如胃痛、胃灼热、酸性嗳气、饱胀等。铝碳酸镁片和左甲状腺素钠片配合使用，降低动物应激反应，使得动物的顺应性更好，从而降低大鼠的死亡率，提高成模率。
72.给药时，先将铝碳酸镁片和左甲状腺素钠片按照配比和浓度溶解于溶剂中，再将得到的混合溶液通过灌胃的方式给药大鼠。
73.可选地，大鼠每100g每次给药铝碳酸镁片3～6mg。
74.在本技术的一种实施方式中，大鼠每100g每次给药铝碳酸镁片5mg。在本技术的其他一些实施方式中，大鼠每100g每次给药铝碳酸镁片3mg、3.5mg、4mg、4.5mg、5.5mg或6mg。
75.当药物为碘-131时，将碘-131通过腹腔注射的方式给药。
76.每天给药1次，大鼠每100g每次给药碘-131 7～13mci，持续给药8～10周。
77.可选地，大鼠每100g每次给药碘-131 10mci。
78.在本技术的一种实施方式中，大鼠每100g每次给药碘-131 10mci。在本技术的其他一些实施方式中，大鼠每100g每次给药碘-131 7mci、7.5mci、8mci、8.5mci、9mci、9.5mci、10.5mci、11mci、11.5mci、12mci、12.5mci或13mci。
79.可选地，持续给药8周。
80.在本技术的一种实施方式中，持续给药8周。在本技术的其他一些实施方式中，持续给药9周或10周。
81.可选地，大鼠包括sd大鼠、wistar大鼠和bn大鼠中的任意一种或多种。
82.可选地，大鼠为雌鼠和/或雄鼠。
83.可选地，大鼠的重量为180～300g。
84.本技术还提供一种上述心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法得到的心肌肥大和骨质疏松的动物模型在筛选甲状腺功能亢进疾病、甲状腺功能亢进性心脏病、甲状腺功能亢进性骨质疏松疾病药物中的应用。
85.基于构建的心肌肥大和骨质疏松的动物模型，可以进行治疗甲状腺功能亢进疾病、甲状腺功能亢进性心脏病、甲状腺功能亢进性骨质疏松疾病药物的药物验证、药物筛选。
86.以下结合实施例对本技术的一种心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法及应用作进一步的详细描述。
87.实施例1
88.本技术实施例提供一种心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法，其包括：
89.随机选择10只体重为200
±
20g的雄性sd大鼠，每只每天灌胃1次，大鼠每100g每次给药左甲状腺素钠片60μg，持续给药12周。
90.实施例2
91.本技术实施例提供一种心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法，其包括：
92.随机选择10只体重为200
±
20g的雄性sd大鼠，每只每天灌胃1次，大鼠每100g每次给药左甲状腺素钠片60μg和铝碳酸镁片5mg，持续给药12周。
93.实施例3
94.本技术实施例提供一种心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法，其包括：
95.随机选择10只体重为200
±
20g的雄性sd大鼠，每只每天灌胃1次，大鼠每100g每次给药左甲状腺素钠片40μg和铝碳酸镁片3mg，持续给药14周。
96.实施例4
97.本技术实施例提供一种心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法，其包括：
98.随机选择10只体重为200
±
20g的雄性sd大鼠，每只每天灌胃1次，大鼠每100g每次给药左甲状腺素钠片80μg和铝碳酸镁片6mg，持续给药10周。
99.实施例5
100.本技术实施例提供一种心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法，其包括：
101.随机选择10只体重为200
±
20g的雄性sd大鼠，每只每天腹腔注射1次，大鼠每100g每次给药碘-131 10mci，持续给药8周。
102.对比例1
103.本技术对比例提供一种心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法，其包括：
104.随机选择10只体重为200
±
20g的雄性sd大鼠，每只每两天灌胃1次，大鼠每100g每次给药左甲状腺素钠片120μg，持续给药12周。
105.对比例2
106.本技术对比例提供一种心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法，其包括：
107.随机选择10只体重为200
±
20g的雄性sd大鼠，每只每天灌胃2次，大鼠每100g每次给药左甲状腺素钠片30μg，持续给药12周。
108.对比例3
109.本技术对比例提供一种心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法，其包括：
110.随机选择10只体重为200
±
20g的雄性sd大鼠，每只每天灌胃1次，大鼠每100g每次
给药左甲状腺素钠片20μg，持续给药12周。
111.对比例4
112.本技术对比例提供一种心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法，其包括：
113.随机选择10只体重为200
±
20g的雄性sd大鼠，每只每天灌胃1次，大鼠每100g每次给药左甲状腺素钠片100μg，持续给药12周。
114.对比例5
115.本技术对比例提供一种心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法，其包括：
116.随机选择10只体重为200
±
20g的雄性sd大鼠，每只每天灌胃1次，大鼠每100g每次给药左甲状腺素钠片60μg，持续给药8周。
117.对比例6
118.本技术对比例提供一种心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法，其包括：
119.随机选择10只体重为200
±
20g的雄性sd大鼠，每只每天灌胃1次，大鼠每100g每次给药左甲状腺素钠片60μg，持续给药16周。
120.对照组
121.取10只对体重为200
±
20g的雄性sd大鼠作为对照组，对照组不给药。
122.实施例和对比例中的左甲状腺素钠片购自merck kgaa，规格：50μg/片，100片/盒。铝碳酸镁片购自拜耳医药保健有限公司，规格：0.5g*20s。
123.试验例1
124.实施例1～5、对比例1～6和对照组的大鼠的平均体重如表1所示。
125.表1
126.127.由表1可知，临床甲状腺功能亢进后由于代谢增快，体重增长速度明显减慢。实施例1～5经优甲乐灌胃或碘-131腹腔注射后，出现好动，烦躁不安，进食增多，饮水增多，汗液增多，体重增长缓慢，甚至减轻和临床上甲亢病人三多一少症状完全吻合一致。
128.而对比例1～6无法实现成功造模。其中，对比例1、4单次给药剂量过高，动物无法承受过高激素变化，消瘦加剧，甚至无法维持生存需要的体重，62％动物死亡；对比例2、3由于单次给药剂量过低，无法造成动物甲亢，故动物未出现好动、烦躁、代谢增快和体重增长速度减慢等情况；对比例5由于造模给药周期过短，动物还未形成稳定的甲亢，停止给药后，体重反弹过快；对比例6在0～14w体重观察中，符合甲亢症状，14～16w动物死亡率急剧增加，达到43％，无法成为良好的动物模型。
129.试验例2
130.采用放射免疫法测量甲状腺功能，包括测定：游离三碘甲腺原氨酸(ft3)、游离甲状腺素(ft4)、促甲状腺素(tsh)，该三项指标是临床诊断甲状腺功能亢进症的指标。
131.采用放射免疫法测量甲状腺功能：使对照组、实施例1～5和对比例1～6所有大鼠空腹称重，麻醉后，离心管收集全血，每只动物至少2ml，离心，分离血清，使用放射免疫法测定血清ft3、ft4、tsh含量，如表2所示。
132.表2
[0133][0134][0135]
由表2可知，实施例1～5经优甲乐灌胃或碘-131腹腔注射后，ft3、ft4、tsh明显增高，与正常组动物有显著统计学差异，说明优甲乐灌胃导致大鼠甲状腺功能亢进。
[0136]
而对比例1～6无法实现成功造模。其中，对比例1、4单次给药剂量过高，各项激素水平过高，62％动物死亡；对比例2、3由于单次给药剂量过低，无法造成动物甲亢，激素水平
与正常动物差异非常小；对比例5由于造模给药周期过短，动物还未形成稳定的甲亢，停止给药后，激素快速恢复正常；对比例6给药时间过长，死亡率达到43％，且激素水平过高，无法成为良好的动物模型。
[0137]
试验例3
[0138]
借助影像处理软件，可在micro ct的扫描成像图上选择感兴趣区域(region of interest，roi)做阈值分割等操作，如图1所示。将对照组、实施例1～5和对比例1～6所有大鼠皮质骨和松质骨进行分割，分别提取到不同组织区域，从而对皮质骨和松质骨(骨小梁)的各种形态学特性进行研究和分析，测得相对骨体积和骨小梁厚度。其中，相对骨体积是对roi区域骨体积进行分析，骨小梁厚度指骨小梁的平均厚度，如表3所示。
[0139]
表3
[0140][0141][0142]
由图1和表3可知，实施例1～5经优甲乐灌胃或碘-131腹腔注射后，大鼠相对骨体积和骨小梁厚度显著降低，说明骨质疏松模型成功建立。
[0143]
试验例4
[0144]
测定对照组、实施例1～5和对比例1～6所有大鼠的心脏/体重指数以及左室后壁厚度，结果如表4所示。
[0145]
表4
[0146]
项目心脏/体重指数(％)左室后壁厚度(mm)对照组0.271.30实施例10.442.21实施例20.462.32
实施例30.412.51实施例40.482.20实施例50.482.21对比例10.180.89对比例20.281.27对比例30.271.32对比例40.180.92对比例50.291.31对比例60.191.07
[0147]
心脏/体重指数，是心脏重量与体重重量比值的数据，能够直观的体现心脏的变化，当心肌肥厚发生时，心脏内心肌细胞肥大，数量增多，造成心脏体积增大，重量增加。当模型过于严重，心肌肥厚超过机体自身修复，代偿的极限后，转变为心力衰竭，肥厚的心肌坏死崩解，造成心脏指数反而减小,心室壁厚度降低，从而造成动物死亡。
[0148]
由表4可知，实施例1～5经优甲乐灌胃或碘-131腹腔注射后，大鼠心脏/体重指数显著性增加，说明优甲乐灌胃或碘-131腹腔注射可造成心脏质量增加。
[0149]
超声是临床上检测诊断心肌肥厚的主要依据，肥厚型心肌病的心脏彩超主要表现有：心室不对称肥厚而无心室腔扩大，这是肥厚型心肌病的特征性表现。
[0150]
由表4和图2知，实施例1～5经优甲乐灌胃或碘-131腹腔注射后，大鼠舒张期室间隔的厚度达到15mm以上或者室间隔与后壁比大于1.3，伴有流出道梗阻，可以见到室间隔流出道部分向左室腔内突出，二尖瓣前叶收缩期前移，即sam征，左心室顺应性降低导致左心室舒张功能障碍。
[0151]
试验例5
[0152]
测得对照组、实施例1和5的大鼠的心肌肥厚病理检测图(40x10倍)，如图3～5所示。
[0153]
由图3～5可知，经优甲乐灌胃或碘-131腹腔注射的大鼠心肌细胞增厚，增多，肿胀，心肌间隙缩窄，呈现明显的心肌肥厚病例特征。
[0154]
综上所述，本技术通过药物同时诱导心肌肥厚和骨质疏松两种疾病类型的动物模型，药物诱导的方式无需手术、无需麻醉，不会对动物造成其他损伤，基本不会引发除疾病本身其他的疾病，制得的模型一致性较高。同时，通过本技术的心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法得到的动物模型与临床上甲状腺素功能亢进性心脏病和骨质疏松病症特点、疾病进程完全一致。
[0155]
以上所述仅为本技术的具体实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。