一种诱导铁甲草茎段外植体不定芽再生的方法

1.本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种诱导铁甲草茎段外植体不定芽再生的方法。


背景技术：

2.铁甲草(cassia mimosoides linn.)，别名山扁豆，为豆科(leguminosae)决明属植物，是一种多年生亚灌木状披散草本植物。铁甲草现分布于全球的热带和亚热带，我国的东南部、南部以及西南部是其广泛分布的地区。铁甲草本种常生长于荒地，耐旱耐瘠，可做绿肥，更是良好的覆盖植物和改土植物。铁甲草始载于在明朝《救荒本草》，可以全草入药，有健脾利湿，清热解毒，通便等功效，幼嫩茎叶可以代茶，根可治痢疾。因其特有的药用价值，数百年来，民间广为流传。由于铁甲草具有重要的药用价值，目前市场上对其需求量与日俱增。然而，在自然环境下，铁甲草存在种子萌发率低，种植步骤繁琐，自然繁殖周期较长，母株优良品质难以保存等种种问题。
3.目前关于铁甲草组培再生的研究报道还比较少，一般都是关注不同类型的激素或者不同浓度的激素对铁甲草外植体组培再生效果的影响，并且已经报道的铁甲草外植体不定芽再生培养的周期较长，一般至少需要80天，而且需要增殖培养和伸长培养等繁琐的过程，严重制约了铁甲草大规模扩繁的效率。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对现有技术中铁甲草不定芽诱导和植株再生的过程中存在的诱导率低、质量较差和周期较长等问题，提供一种应用于高效诱导铁甲草茎段外植体产生再生不定芽的方法。
5.本发明的为了提高诱导铁甲草茎段外植体不定芽形成的质量和效率，开创性的采用不同浓度和不同类型的金属离子来诱导茎段外植体产生不定芽，优化的条件可显著提高愈伤组织诱导的效率和质量。再将所获得再生芽条接种到添加了不同类型添加物的生根培养基上培养一段时间，就可以获得完整的再生植株。
6.因此，本发明的目的是提供一种诱导铁甲草茎段外植体不定芽再生的方法，包括以下步骤：
7.a.取铁甲草种子，进行催芽处理和消毒处理，然后接种于ms固体培养基上进行种子无菌萌发培养；
8.b.取生长了15-25天的铁甲草无菌植株，将根部和叶部都去除，保留茎；将茎切成小段，作为茎段外植体；
9.c.将茎段外植体轴向水平接种至不定芽诱导培养基，诱导培养不定芽；
10.d.将长度大于1cm的不定芽接种至生根培养基，诱导生根，获得铁甲草再生植株。
11.优选，所述的步骤a的催芽处理为：用80℃的水对种子进行恒温浸泡处理10min。
12.优选，所述的步骤a的消毒处理为：用体积分数75％的乙醇水溶液消毒30-45s，然
后用质量分数2.5％的naclo水溶液消毒10-15min，期间不断振荡，灭菌水冲洗3-4次，每次1min。
13.优选，所述的ms固体培养基，含有：蔗糖30g/l和琼脂8g/l，余量为ms培养基，ph 5.8-6.0。
14.优选，所述的步骤b的将茎切成小段是将茎切成约0.5cm长小段。
15.优选，所述的不定芽诱导培养基，含有：tdz 0.5mg/l、kt 2mg/l、硝普纳1.2mg/l、agcl 0.3mg/l、蔗糖30g/l和琼脂8g/l，余量为ms培养基，ph 5.8-6.0。
16.优选，所述的不定芽诱导培养基，含有：tdz 0.5mg/l、kt 2mg/l、cucl
2 0.3mg/l、mgso4·
7h2o 0.5mg/l、蔗糖30g/l和琼脂8g/l，余量为ms培养基，ph 5.8-6.0。
17.优选，所述的不定芽诱导培养基，含有：tdz 0.5mg/l、kt 2mg/l、feso4·
7h2o 0.4mg/l、蔗糖30g/l和琼脂8g/l，余量为ms培养基，ph 5.8-6.0。
18.优选，所述的生根培养基，含有：iba 0.1mg/l、da-6 0.6mg/l、蔗糖30g/l和琼脂8g/l，余量为ms培养基，ph 5.8-6.0。
19.优选，所述的诱导铁甲草茎段外植体不定芽再生的方法，培养条件为：光照强度2000lx，光照时间12小时/天，温度25
±
1℃。
20.应用本发明优化的方法，可以显著提高诱导铁甲草茎段外植体形成再生不定芽的效率和质量，为铁甲草茎段外植体无性快繁和优良品种选育奠定了良好的工作基础。
21.本发明的有益效果：
22.本发明以广东地区常用护肝中草药铁甲草为对象，运用植物组织培养技术，开创性的发现铜离子、镁离子、银离子及硝普纳对铁甲草茎段外植体不定芽再生的促进效果，开发优化铁甲草人工培育最佳培养基和培养条件，建立了一种快速有效的铁甲草茎段外植体体外繁殖再生体系，简化了组培体系，缩短了组培周期，提高了再生苗质量。本发明方法为铁甲草的种质资源繁育和保存提供了方法，为进一步了解铁甲草药理活性分析及保肝应用等基础研究提供原材料支持；为实现铁甲草工厂化栽培提供了方法和依据，对于广东地区对铁甲草日益增长的市场需求具有一定的现实意义。
23.采用本发明方法可以显著缩短获得铁甲草完整再生植株的时间，不需要增殖培养和伸长培养等步骤，简化了组培体系。同时，由于采用本方法所获得再生不定芽质量较好，通过茎段外植体不定芽诱导后，就可以直接进行芽条生根培养，在60天内就可以获得完整的再生植株，显著提高了再生效率，缩短了组培周期。
附图说明
24.图1是铁甲草茎段外植体不定芽再生效果，其中，(a)对照，直接将铁甲草茎段外植体接种至无激素ms固体培养基上培养40天后的效果；直接将茎段外植体轴向水平接种至只添加了2mg/l kt(b)和0.5mg/l tdz(c)的ms固体培养基上进行不定芽诱导培养40天的效果；以含有0.5mg/l tdz和2mg/l kt的ms固体培养基作为基础培养基，将所获得茎段外植体分别轴向水平接种至含有0.3mg/l cucl2(d)、0.5mg/l mgso4·
7h2o(e)、0.4mg/l feso4·
7h2o(f)、1.2mg/l硝普纳(g)、0.3mg/l agcl(h)的基础培养基上进行不定芽诱导培养40天的效果；在基础培养基中添加了(i)1.2mg/l硝普纳和0.3mg/l cucl2时的不定芽再生效果；(j)在基础培养基中添加了0.3mg/l agcl和0.4mg/l feso4·
7h2o时的不定芽再生效果；以
含有0.5mg/l tdz和2mg/l kt的ms固体培养基作为基础培养基，将所获得茎段外植体轴向水平接种至含有1.2mg/l硝普纳的基础培养基上进行不定芽诱导培养40天，将长度大于1cm的再生芽条垂直(形态学下端朝下)接种至添加了0.6mg/l da-6(k)和0.4mg/l h3bo3(l)的生根基础培养基中(ms固体培养基+0.1mg/l iba)进行生根诱导培养20天的效果(bar＝1cm)。
具体实施方式
25.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
26.实施例1
27.一、试剂及方法
28.1.所需主要试剂
29.激动素(kt)、噻苯隆(tdz)、无水氯化铜(cucl2)、七水硫酸镁(mgso4·
7h2o)、硫酸亚铁(feso4·
7h2o)、硝普纳(snp)、氯化银(agcl)、胺鲜酯(da-6)、硼酸(h3bo3)和吲哚丁酸(iba)等都为分析纯试剂，由南京试剂(南京化学试剂股份有限公司)提供。ms大量粉末由索莱宝(北京)公司提供。
30.2.ms固体培养基的制备
31.本实施例中所用的ms固体培养基为ms培养基+蔗糖30g/l+琼脂8g/l。所述的ms培养基是本领域已知配方的通用培养基，其成份见murashige t,skoog f(1962)a revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.physiologia plantarum 15:473-497。
32.本实施中配制方法如下：
33.ms固体培养基：ms大量粉末4g/l+ms微量1ml(1000
×
母液)+ms有机10ml(100
×
母液)+fe盐10ml(100
×
母液)+肌醇100mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l。
34.按所需培养的用量，用电子天平分别称取ms大量粉末、肌醇、蔗糖，移液枪分别抽取ms微量、有机、fe盐，将称量好的药剂加入准备好的烧杯中，加入适量的蒸馏水，利用恒温磁力搅拌器，使药剂充分溶解。溶解好的溶液定容至1l，利用ph计、氢氧化钠(naoh)和盐酸(hcl)将溶液ph调至5.8。用电子天平称量琼脂粉8g，将溶液倒入锅中，加热至50-60℃，倒入称好的琼脂粉，期间不断搅拌使琼脂粉充分溶解，加热至沸腾，将其分装至备好的组培瓶中。将分装好的培养基和切割板放入高压蒸汽灭菌锅中(121℃，0.1mpa)灭菌20分钟后，取出，室温下冷却凝固。
35.3.铁甲草种子萌发
36.取一定数量的铁甲草种子，用80℃的水对种子进行恒温浸泡处理10min后，用75％的乙醇消毒30-45秒后，用2.5％的次氯酸钠(naclo)水溶液消毒10-15min，期间不断振荡，在超净工作台内用灭菌好的蒸馏水冲洗3-4次，每次1min，最后，接种于ms固体培养基上进行种子无菌萌发培养。
37.4.获取铁甲草茎段外植体
38.取生长了20天的铁甲草无菌植株，将根部和叶部都去除，保留茎，将其切成0.5cm左右小段(均不带芽点)，作为茎段外植体。
39.5.诱导铁甲草茎段外植体不定芽再生
40.5.1采用常规方法
41.(1)将所获得茎段外植体直接轴向水平接种至只添加了不同浓度kt(0、0.25、0.5、1和2mg/l)的ms固体培养基上进行不定芽诱导培养40天，比较不同条件下的培养结果。
42.(2)将所获得茎段外植体直接轴向水平接种至添加了不同浓度tdz(0、0.25、0.5、1和2mg/l)的ms固体培养基上进行不定芽诱导培养40天，比较不同条件下的培养结果。
43.5.2采用新方法
44.以含有0.5mg/l tdz和2mg/l kt的ms固体培养基作为基础培养基，将所获得茎段外植体分别轴向水平接种至含有不同浓度铜离子(cucl2为0、0.3、0.6、0.9和1.2mg/l)、镁离子(mgso4·
7h2o为0、0.25、0.5、0.75和1.5mg/l)、亚铁离子(feso4·
7h2o为0、0.2、0.4、0.8和1.6mg/l)、硝普纳(0、0.3、0.6、1.2和2.4mg/l)、银离子(agcl为0、0.15、0.3、0.6和1.2mg/l)的基础培养基上进行不定芽诱导培养40天，比较不同条件下的培养结果。
45.6.对再生芽条进行生根诱导
46.以含有0.5mg/l tdz和2mg/l kt的ms固体培养基作为基础培养基，将所获得茎段外植体轴向水平接种至含有1.2mg/l硝普纳的基础培养基上进行不定芽诱导培养40天，将长度大于1cm的再生芽条(不定芽)垂直(形态学下端朝下)接种至添加了不同浓度da-6(0、0.15、0.3、0.6和1.2mg/l)和硼离子(h3bo3为0、0.2、0.4、0.8和1.6mg/l)的生根基础培养基中(ms固体培养基+0.1mg/l iba)进行不定根诱导培养20天，比较不同条件下的培养结果。
47.7.培养条件与数据分析
48.所有实验都是在相同条件下进行的。培养基均使用1mol/l hcl溶液或1mg/lnaoh溶液调整培养基的ph至5.8，然后在121℃，0.1mpa的条件下高压灭菌15min。组织培养室培养条件为2000lx的光照强度，12小时/天的光照时间，25
±
1℃的培养温度。所有试验处理均重复三次，试验数据为3次重复试验的平均值
±
标准差表示，所有数据采用spss statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(p≦0.05)，数据后字母不同表示处理间差异显著。
49.二、结果及说明
50.铁甲草茎段外植体不定芽再生效果部分如图1所示。
51.1.不同浓度的kt对铁甲草的茎段外植体再生效果的影响
52.本次实验采用常规方法，将所获得茎段外植体直接轴向水平接种至只添加了不同浓度kt(0、0.25、0.5、1和2mg/l)的ms固体培养基上进行不定芽诱导培养40天，表1结果表明采用这样的方法所获得不定芽再生效率较低，再生不定芽的质量也不佳。当培养基中添加的kt浓度为2mg/l时，可以获得最佳的不定芽诱导效果，此时不定芽再生率达最大值为25.93％，平均芽数也达最大值为2.37颗，平均芽长也达最大值为0.76cm。继续增加kt的浓度，不定芽再生的效果将变得更差。
53.表1不同浓度的kt对铁甲草的茎段外植体再生效果的影响
54.[0055][0056]
注：数据采用spss statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(p≦0.05)，数据后字母不同表示处理间差异显著。
[0057]
2.不同浓度的tdz对铁甲草的茎段外植体再生效果的影响
[0058]
本次实验采用常规方法，将所获得茎段外植体直接轴向水平接种至添加了不同浓度tdz(0、0.25、0.5、1和2mg/l)的ms固体培养基上进行不定芽诱导培养40天，表2结果表明采用这样的方法所获得不定芽再生效率较低，再生不定芽的质量也不佳。当培养基中添加的tdz浓度为0.5mg/l时，可以获得最佳的不定芽诱导效果，此时不定芽再生率达最大值为18.91％，平均芽数也达最大值为1.67颗，平均芽长也达最大值为0.46cm。继续增加tdz的浓度，不定芽再生的效果将变得更差。
[0059]
表2不同浓度的tdz对铁甲草茎段外植体再生效果的影响
[0060]
tdz浓度(mg/l)再生率(％)平均芽数(个)平均芽长(cm)00
±
0e0
±
0d0
±
0d0.2511.47
±
1.13b1.23
±
0.15b0.23
±
0.04b0.518.91
±
0.57a1.67
±
0.28a0.46
±
0.05a18.49
±
1.15c0.85
±
0.12c0.19
±
0.02bc25.77
±
0.71d0.65
±
0.08c0.13
±
0.03c
[0061]
注：数据采用spss statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(p≦0.05)，数据后字母不同表示处理间差异显著。
[0062]
3.不同浓度的cu
2+
对铁甲草茎段外植体再生效果的影响
[0063]
本次实验采用新方法，以含有0.5mg/l tdz和2mg/l kt的ms固体培养基作为基础培养基，将所获得茎段外植体轴向水平接种至含有不同浓度铜离子(添加的cucl2为0、0.3、0.6、0.9和1.2mg/l)的基础培养基上进行不定芽再生诱导。
[0064]
表3结果表明，当基础培养基中添加的cucl2浓度为0.3mg/l时，可以获得最佳的不定芽诱导效果，此时不定芽再生率达最大值为55.56％，平均芽数也达最大值为4.97颗，平均芽长也达最大值为1.88cm。继续增加铜离子的浓度，不定芽再生的效果将变差。
[0065]
表3不同浓度的cu
2+
对铁甲草茎段外植体再生效果的影响
[0066]
cucl2浓度(mg/l)再生率(％)平均芽数(个)平均芽长(cm)028.22
±
1.35d2.55
±
0.08d0.93
±
0.04d0.355.56
±
1.06a4.97
±
0.23a1.88
±
0.07a0.645.84
±
1.71b4.13
±
0.15b1.49
±
0.06b0.934.56
±
0.93c2.98
±
0.18c1.32
±
0.06c
1.222.53
±
1.10e2.32
±
0.14d1.05
±
0.15d
[0067]
注：数据采用spss statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(p≦0.05)，数据后字母不同表示处理间差异显著。
[0068]
4.不同浓度的mg
2+
对铁甲草茎段外植体再生效果的影响
[0069]
本次实验采用新方法，以含有0.5mg/l tdz和2mg/l kt的ms固体培养基作为基础培养基，将所获得茎段外植体轴向水平接种至含有不同浓度镁离子(添加的mgso4·
7h2o为0、0.25、0.5、0.75和1.5mg/l)的基础培养基上进行不定芽再生诱导。
[0070]
表4结果表明，当基础培养基中添加的mgso4·
7h2o浓度为0.5mg/l时，可以获得最佳的不定芽诱导效果，此时不定芽再生率达最大值为52.68％，平均芽数也达最大值为4.18颗，平均芽长也达最大值为1.51cm。继续增加镁离子的浓度，不定芽再生的效果将变差。
[0071]
表4不同浓度的mg
2+
对铁甲草茎段外植体再生效果的影响
[0072]
mgso4·
7h2o浓度(mg/l)再生率(％)平均芽数(个)平均芽长(cm)027.91
±
1.36c2.54
±
0.06c0.91
±
0.08c0.2545.86
±
1.72b3.39
±
0.22b1.32
±
0.07b0.552.68
±
1.84a4.18
±
0.17a1.51
±
0.06a0.7543.00
±
2.14b3.44
±
0.23b1.25
±
0.07b1.529.20
±
1.43c2.55
±
0.12c1.03
±
0.11c
[0073]
注：数据采用spss statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(p≦0.05)，数据后字母不同表示处理间差异显著。
[0074]
5.不同浓度的fe
2+
对铁甲草茎段外植体再生效果的影响
[0075]
本次实验采用新方法，以含有0.5mg/l tdz和2mg/l kt的ms固体培养基作为基础培养基，将所获得茎段外植体轴向水平接种至含有不同浓度亚铁离子(添加的feso4·
7h2o为0、0.2、0.4、0.8和1.6mg/l)的基础培养基上进行不定芽再生诱导。
[0076]
表5结果表明，当基础培养基中添加的feso4·
7h2o浓度为0.4mg/l时，可以获得最佳的不定芽诱导效果，此时不定芽再生率达最大值为41.87％，平均芽数也达最大值为2.96颗，平均芽长也达最大值为1.38cm；同时此时所获得再生不定芽质量较差，叶片容易变黄萎缩。继续增加亚铁离子的浓度，不定芽再生的效果将会变得更差。
[0077]
表5不同浓度的fe
2+
对铁甲草茎段外植体再生效果的影响
[0078]
feso4·
7h2o浓度(mg/l)再生率(％)平均芽数(个)平均芽长(cm)028.17
±
1.88d2.57
±
0.07b0.96
±
0.08c0.236.17
±
2.21b2.85
±
0.1a1.19
±
0.10b0.441.87
±
3.65a2.96
±
0.16a1.38
±
0.07a0.834.18
±
2.25bc2.84
±
0.08a1.29
±
0.06ab1.630.50
±
2.16cd2.51
±
0.15b0.85
±
0.05c
[0079]
注：数据采用spss statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(p≦0.05)，数据后字母不同表示处理间差异显著。
[0080]
6.不同浓度的snp对铁甲草茎段外植体再生效果的影响
[0081]
本次实验采用新方法，以含有0.5mg/l tdz和2mg/l kt的ms固体培养基作为基础培养基，将所获得茎段外植体轴向水平接种至含有不同浓度snp(0、0.3、0.6、1.2和2.4mg/
feso4·
7h2o时，不定芽再生诱导效果最差，此时不定芽再生率为最小值(44.81％)，平均芽数也为最小值(2.99颗)，平均芽长也为最小值(1.41cm)，此时比只添加了feso4·
7h2o时所获得的再生不定芽质量要稍微好一些，叶片形态正常。
[0095]
表8不同成分组合对铁甲草茎段外植体不定芽再生效果的影响
[0096][0097][0098]
注1：数据采用spss statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(p≦0.05)，数据后字母不同表示处理间差异显著。
[0099]
注2：在不定芽再生诱导基础培养基(添加了0.5mg/l tdz和2mg/l kt的ms固体培养基)上分别添加组合1：0.3mg/l agcl和0.3mg/l cucl2；组合2：0.3mg/l agcl和0.5mg/l mgso4·
7h2o；组合3：0.3mg/l agcl和0.4mg/l feso4·
7h2o；组合4：1.2mg/l硝普纳和0.3mg/l cucl2；组合5：1.2mg/l硝普纳和0.5mg/l mgso4·
7h2o；组合6：1.2mg/l硝普纳和0.4mg/l feso4·
7h2o；组合7：1.2mg/l硝普纳和0.3mg/l agcl。
[0100]
9.不同浓度的da-6对铁甲草茎段外植体再生芽条生根效果的影响
[0101]
以含有0.5mg/l tdz和2mg/l kt的ms固体培养基作为基础培养基，将所获得茎段外植体轴向水平接种至含有1.2mg/l硝普纳的基础培养基上进行不定芽诱导培养40天，将长度大于1cm的再生芽条(不定芽)垂直(形态学下端朝下)接种至添加了不同浓度da-6(0、0.15、0.3、0.6和1.2mg/l)的生根基础培养基上(ms固体培养基+0.1mg/l iba)进行不定芽诱导培养20天，发现在生根基础培养基中添加0.6mg/l da-6可以获得最佳的生根效果。
[0102]
表9结果表明，当生根基础培养基中添加的da-6浓度为0.6mg/l时，可以获得最佳的生根效果，此时生根率达最大值为90.23％，平均根数也达最大值为6.08颗，平均根长也达最大值为4.26cm。继续增加da-6的浓度，再生芽条的生根效果将变差。
[0103]
表9不同浓度的da-6对铁甲草茎段外植体再生芽条生根效果的影响
[0104]
da-6浓度(mg/l)生根率(％)平均根数(条)平均根长(cm)046.79
±
2.11d2.64
±
0.14d2.78
±
0.12d0.1555.73
±
3.29c3.57
±
0.12c3.22
±
0.17c0.378.85
±
3.38b4.50
±
0.19b3.66
±
0.27b0.690.23
±
1.32a6.08
±
0.23a4.26
±
0.23a
1.273.36
±
4.50b4.28
±
0.32b3.34
±
0.19bc
[0105]
注：数据采用spss statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(p≦0.05)，数据后字母不同表示处理间差异显著。
[0106]
10.不同浓度的硼离子对铁甲草茎段外植体再生芽条生根效果的影响
[0107]
以含有0.5mg/l tdz和2mg/l kt的ms固体培养基作为基础培养基，将所获得茎段外植体轴向水平接种至含有1.2mg/l硝普纳的基础培养基上进行不定芽诱导培养40天，将长度大于1cm的再生芽条(不定芽)垂直(形态学下端朝下)接种至添加了不同浓度h3bo3(0、0.2、0.4、0.8和1.6mg/l)的生根培养基上(ms固体培养基+0.1mg/l iba)进行不定芽诱导培养20天，发现在生根基础培养基中添加0.4mg/l h3bo3可以获得最佳的生根效果。
[0108]
表10结果表明，当生根基础培养基中添加的h3bo3浓度为0.4mg/l时，可以获得最佳的生根效果，此时生根率达最大值为57.31％，平均根数也达最大值为3.67颗，平均根长也达最大值为3.55cm；但是所获得不定根容易发黑，并且芽条上的叶片容易发黄甚至脱落。继续增加硼离子的浓度，再生芽条的生根效果将变差。
[0109]
表10不同浓度的硼离子对铁甲草茎段外植体再生芽条生根效果的影响
[0110]
h3bo3浓度(mg/l)生根率(％)平均根数(条)平均根长(cm)046.06
±
3.59c2.62
±
0.14c2.75
±
0.14c0.251.78
±
1.62b3.24
±
0.22b3.15
±
0.19b0.457.31
±
2.75a3.67
±
0.15a3.55
±
0.15a0.847.39
±
2.76bc3.16
±
0.10b3.09
±
0.19b1.632.81
±
1.33d2.20
±
0.21d2.11
±
0.23d
[0111]
注：数据采用spss statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(p≦0.05)，数据后字母不同表示处理间差异显著。