一种白及种子培养基组合及利用该培养基组合培养白及种子的方法

1.本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种白及种子培养基组合及利用该培养基组合培养白及种子的方法。


背景技术：

2.白及(bletilla striata(thunb.exa.murray)rchb.f.)为兰科白及属多年生草本植物，假鳞茎扁球形，茎粗壮，叶狭长圆形或披针形，喜温暖、阴凉的丘陵、低山地区或零下湿地，主要分布贵州、四川、湖北、安徽等地区。白及以干燥块茎入药，具有收敛止血、消肿生肌等功效，常用于皮肤皲裂、外伤出血等症状的治疗，其块茎含有的多糖成分温和、刺激小，广泛应用于医药、美容行业。
3.白及种子量大，细小无胚乳，其种胚的薄壁细胞中储存有大量的碳水化合物、油脂和蛋白质类物质，在湿润的条件下极易萌发，萌发后需要加强保水保湿、通风透气等精细管理，故自然条件下难以依靠种子进行大量繁殖。近年来，通过白及种子直接播种已取得一定的进展，但在部分条件下，依然难以通过种子直播获得大量种苗。白及种子无菌萌发、快繁育苗技术也日渐成熟，但培养过程中需要频繁进行继代培养，周期长，工作量大，成苗慢，严重限制了白及规模化育苗产业的发展。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种白及种子培养基组合及利用该培养基组合培养白及种子的方法。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种白及种子培养基质组合，包括培养基质、白及种子萌发阶段的营养液或白及种子生长阶段的营养液；所述培养基质包括如下质量比的组分：
7.泥炭土：椰砖：蛭石为1～3:0.5～1.5:0.5～1.5。
8.作为优选，所述白及种子萌发阶段的营养液以1/2ms培养基为基础，还包括以下浓度的组分：1.8～2.2mg/l的6-苄基腺嘌呤6-ba，0.8～1.2mg/l的萘乙酸naa和28～32mg/l蔗糖；所述白及种子萌发阶段的营养液的ph为5.7～5.9。
9.作为优选，所述白及种子生长阶段的营养液以ms培养基为基础，还包括以下浓度的组分：0.8～1.2mg/l的6-苄基腺嘌呤6-ba、0.08～0.12mg/l萘乙酸naa和28～32mg/l的蔗糖；白及种子生长阶段的营养液的ph为5.7～5.9。
10.作为优选，所述白及种子萌发阶段的营养液在白及种子萌发阶段添加至所述培养基质中，所述白及种子生长阶段的营养液在白及种子生长阶段添加至所述培养基质中。
11.本发明还提供了所述的白及种子培养基组合培养白及种子的方法，包括如下步骤：
12.(1)依次用70～80vt％的酒精和聚维酮碘对白及果荚进行消毒，得到无菌白及果
荚；
13.(2)将步骤(1)所述无菌白及果荚中的种子接种于添加了白及种子萌发阶段的营养液的培养基质中，萌发培养，得到株高为3～4cm的白及幼苗；
14.(3)向所述培养基质中添加白及种子生长阶段的营养液，对所述白及幼苗进行生长培养，得到待移栽白及幼苗。
15.作为优选，步骤(1)所述酒精消毒的时间为30～60s。
16.作为优选，步骤(1)所述聚维酮碘的使用浓度为250～500mg/l；
17.所述聚维酮碘消毒的时间为5～6min。
18.作为优选，步骤(2)所述接种前还包括对无菌白及果荚清洗的步骤；
19.所述清洗采用水进行，所述清洗的次数为4～5次。
20.作为优选，所述白及种子培养基质的厚度为2.5～3.5cm；
21.步骤(2)所述白及种子萌发阶段的营养液的添加量以浇透所述培养基质并且不积水为宜；
22.步骤(3)所述白及种子生长阶段的营养液的添加量以浇透所述培养基质并且不积水为宜。
23.作为优选，步骤(2)所述萌发培养和步骤(3)所述生长培养的温度独立为23～27℃；
24.步骤(2)所述萌发培养和步骤(3)所述生长培养的光照时间独立为11～13h/天；
25.步骤(2)所述萌发培养和步骤(3)所述生长培养的光照强度独立为2000～2500lux。
26.本发明提供了一种白及种子培养基组合及利用该培养基组合培养白及种子的方法。本发明的培养基质与传统的固体培养基培养相比，复配的基质具有大量空隙结构，能够吸收自身重量9倍的水分及养分，同时保持良好的通气性，有益于白及根系生长，不需要单独进行生根培养。萌发培养过程中也不需要频繁进行转接继代，只要在进入下一阶段的培养时加入新的营养液即可。以可重复利用的培养基质代替琼脂、卡拉胶等固化剂，降低了成本，成苗快且操作简单便捷。解决了现有技术对白及组织培养时频繁继代分苗，培养周期长的现状。
27.本发明在培养白及种子时，使用聚维酮碘进行消毒，由于聚维酮碘为广谱的强力杀菌消毒剂，消毒过程中不产生任何有害代谢产物，皮肤刺激性小，毒性低，安全有效，且对环境友好，操作得当可将污染率控制为零，种子萌发率高，优于次氯酸钠和升汞。
附图说明
28.图1为按照实施例1的方法萌发培养60d后白及种子萌发的情况。
29.图2为按照实施例1的方法萌发培养90d后白及幼苗的生长状况。
30.图3为按照实施例1的方法移栽至育苗盒中30d后白及幼苗的生长状况。
31.图4为按照实施例1的方法分苗后继续培养30d的白及幼苗的生长情况。
32.图5为按照对比例1的方法萌发培养60d后白及种子的萌发情况。
33.图6为按照对比例1的方法萌发培养90d后白及幼苗的生长状况。
34.图7为按照对比例2的方法萌发培养60d后白及种子的萌发情况。
35.图8为按照对比例2的方法萌发培养90d后白及幼苗的生长状况。
36.图9为按照对比例3的方法萌发培养60d后白及种子的萌发情况。
37.图10为按照对比例3的方法萌发培养90d后白及幼苗的生长状况。
具体实施方式
38.本发明提供了一种白及种子培养基质组合，包括培养基质、白及种子萌发阶段的营养液或白及种子生长阶段的营养液；所述培养基质包括如下质量比的组分：泥炭土：椰砖：蛭石为1～3:0.5～1.5:0.5～1.5。
39.在本发明中，所述白及种子萌发阶段的营养液以1/2ms培养基为基础，还包括以下浓度的组分：1.8～2.2mg/l的6-苄基腺嘌呤6-ba，优选为2mg/l；0.8～1.2mg/l的萘乙酸naa，优选为1mg/l；28～32mg/l蔗糖，优选为30mg/l；所述白及种子萌发阶段的营养液的ph为5.7～5.9，优选为5.8。
40.在本发明中，所述白及种子生长阶段的营养液以ms培养基为基础，还包括以下浓度的组分：0.8～1.2mg/l的6-苄基腺嘌呤6-ba，优选为1mg/l；0.08～0.12mg/l萘乙酸naa，优选为0.1mg/l；28～32mg/l的蔗糖，优选为30mg/l；白及种子生长阶段的营养液的ph为5.7～5.9，优选为5.8。
41.本发明还提供了利用所述的白及种子培养基组合培养白及种子的方法，包括如下步骤：
42.(1)依次用70～80vt％的酒精和聚维酮碘对白及果荚进行消毒，得到无菌白及果荚；
43.(2)将步骤(1)所述无菌白及果荚中的种子接种于添加了白及种子萌发阶段的营养液的培养基质中，萌发培养，得到株高为3～4cm的白及幼苗；
44.(3)向所述培养基质中添加白及种子生长阶段的营养液，对所述白及幼苗进行生长培养，得到待移栽白及幼苗。
45.在本发明中，所述白及果荚为成熟未开裂的白及果荚。
46.在本发明中，步骤(1)所述酒精的浓度优选为75vt％；酒精消毒的时间为30～60s，优选为45s；所述酒精消毒的方式为浸泡消毒。
47.在本发明中，步骤(1)所述聚维酮碘的使用浓度为250～500mg/l，优选为300～450mg/l，进一步优选为375mg/l；在本发明中，所述250～500mg/l的聚维酮碘的配置方法优选为：将聚维酮碘复方组合试剂中的a片和b片一起直接溶解于500～1000ml水中，待完全溶解后呈明黄色时即可使用；所述聚维酮碘优选的现配现用；所述聚维酮碘消毒的时间为5～6min，优选为5.5min；所述聚维酮碘消毒的方法为浸泡摇晃消毒。
48.在本发明中，步骤(2)所述接种前还包括对无菌白及果荚清洗的步骤；所述清洗采用水进行，所述清洗的次数为4～5次；本发明中，所述水为无菌水；在本发明中，所述清洗后的无菌白及果荚放在无菌滤纸上吸干水分备用。
49.在本发明中，所述白及种子培养基质的厚度为2.5～3.5cm，优选为3cm；步骤(2)所述白及种子萌发阶段的营养液的添加量以浇透所述培养基质并且不积水为宜；步骤(3)所述白及种子生长阶段的营养液的添加量以浇透所述培养基质并且不积水为宜；在本发明中，所述白及种子培养基质分装至组培瓶或透明打包盒内。
50.在本发明中，步骤(2)所述无菌白及果荚中的种子的接种方法为：用剪刀将无菌白及果荚顶端剪开小口，用镊子夹住果荚悬在组培瓶口或打包盒边缘处，轻轻敲打，同时转动组培瓶或打包盒一圈，使种子均匀散落在白及种子培养基质表面；撒播时控制白及种子的密度。
51.在本发明中，若在消毒过程中白及果荚吸水导致种子不能散开，无法进行撒播，优选的先将种子放在少量的无菌水中，使其散开，再将混有种子的无菌水旋转摇晃后顺势倒在组培瓶或打包盒内，避免种子堆积。
52.在本发明中，步骤(2)所述萌发培养的温度为23～27℃，优选为24～26℃，进一步优选为25℃；步骤(2)所述萌发培养的光照时间为11～13h/天，优选为12h/天；步骤(2)所述萌发培养的光照强度为2000～2500lux，优选为2250lux。在本发明中，萌发培养过程中组培瓶或打包盒内水汽减少，基质变干，或者培养至44～46d时，向组培瓶或打包盒的种子培养基质中加入1/2ms营养液，营养液的加入量以浇透种子培养基质并且无积水为宜。
53.在本发明中，步骤(3)所述生长培养的温度独立为23～27℃，优选为24～26℃，进一步优选为25℃；步骤(3)所述生长培养的光照时间为11～13h/天，优选为12h/天；步骤(3)所述生长培养的光照强度为2000～2500lux，优选为2250lux。在本发明中，在进行生长培养时，可根据播种密度选择继续培养或者分苗继代培养。播种密度在≤每平方厘米3株时，可在原来组培瓶或打包盒中所含种子培养基质的基础上添加种子生长阶段的改良ms营养液；播种密度》每平方厘米3株时，需进行分苗继代；所述分苗继代时，将白及幼苗≥5cm，鳞茎的直径≥0.3cm的白及幼苗移栽入育苗盒中进行炼苗处理；将白及幼苗《5cm，鳞茎直径《0.3cm的白及幼苗分成单株，转接至含有改良ms营养液的白及种子培养基质的组培瓶或透明打包盒内，每瓶或每盒接种15株继续培养60d，幼苗株高达到≥5cm时，可进行移栽炼苗。
54.在本发明中，对继续培养或者分苗继代培养后白及幼苗的株高≥5cm的幼苗进行炼苗处理后得到待移栽白及幼苗。
55.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
56.在本发明实施例和对比例中所述的ms营养液为按照常规的方法进行配置的；所述1/2ms营养液的配置方法也是按照常规的方法进行配置。
57.实施例1
58.将泥炭土、椰砖、蛭石按质量比为2：1：1混合配制白及种子培养基质，均匀分装至兰花组培瓶中，厚度为3cm。将白及种子萌发阶段的营养液浇入白及种子培养基质中，以浇透白及种子培养基质并且无积水为宜。设置3个重复，分装完成后在121℃条件下高压灭菌30min后得到适宜白及种子萌发的培养基组合，备用。
59.所述白及种子萌发阶段的营养液以1/2ms培养基为基础，还包括2.0mg/l的6-ba、0.8mg/l的naa和30mg/l的蔗糖。
60.选择成熟未开裂的白及果荚，用75％的酒精浸泡消毒30s，用镊子将果荚转至无菌瓶中，倒入现配置的聚维酮碘的消毒剂消毒5min，期间不停摇晃，消毒完成后用无菌水清洗4次，将果荚放在无菌滤纸上吸干水分备用。
61.用剪刀将白及果荚顶端剪开小口，用镊子夹住果荚悬在组培瓶口，轻轻敲打，同时转动组培瓶一圈，使白及种子均匀散落在白及种子萌发的培养基组合表面，随后置于温度
为25℃，每天光照时间为12h，光照强度为2500lux的组培室内进行萌发培养。萌发培养至45d时，向组培瓶中再次加入白及种子萌发阶段的营养液，营养液的加量以浇透白及种子培养基质并且不积水为宜。培养过程中观察白及种子的萌发情况以及幼苗的生长情况。培养60d后白及种子幼苗的生长情况如图1所示，培养至90d后白及幼苗的生长情况如图2所示。
62.培养至91d时，在播种密度≤每平方厘米3株的组培瓶中加入白及种子生长阶段的营养液，营养液的加入量以浇透白及种子培养基质并且不积水为宜，继续培养白及种子幼苗60d至白及种子幼苗株高≥5cm，有明显鳞茎时，将白及幼苗移栽至育苗盒内炼苗。移栽至育苗盒中30d的白及幼苗的生长情况如图3所示。
63.培养至91d后，播种密度》每平方厘米3株时，对组培瓶中的白及幼苗进行分苗继代培养，将组培瓶中株高≥5cm，且鳞茎≥0.3cm的白及幼苗移栽入培育盒中进行炼苗处理。将组培瓶中株高《5cm，且鳞茎《0.3cm的白及幼苗分成单株转接至含有白及种子生长阶段的营养液的白及种子培养基质的组培瓶中，每瓶15株，继续培养60d，白及幼苗≥5cm时可进行移栽炼苗。分苗后继续培养30d的白及幼苗的生长情况如图4所示。
64.培养结果为：白及种子在萌发培养25～30d时，逐渐长出真叶，培养至45d时出现两片真叶及细小毛状根，60d后出现实生根系。图1显示萌发培养60d后白及幼苗真叶叶长且宽，基部已可见细小的毛状根。图2显示萌发培养90d，白及幼苗可长至3～4cm，根系和鳞茎生长较好。
65.图3显示，移栽至育苗盒30d的白及幼苗株高适宜，生长健壮，有明显的鳞茎。经过计算该幼苗的移栽成活率为88％。图4显示经过分苗继代培养的幼苗由于之后的接种密度适宜，生长健壮鳞茎生长状态更好。经计算该幼苗的移栽成活率为96％。
66.对比例1
67.按照实施例1的方法设置对比例1的方案，与实施例1不同的是，在萌发培养阶段和生长培养阶段的营养液与实施例1不同，对比例1的营养液为无菌水。萌发培养60d后白及种子幼苗的生长情况，如图5所示。
68.图5显示，白及幼苗也可见两片真叶，但真叶短小，幼苗瘦弱偏黄。
69.萌发培养90d后，白及幼苗矮小瘦弱偏黄，呈现出缺素现象，如图6所示。
70.对比例2
71.按照实施例1的方法设置对比例1的方案，与实施例1不同的是，在萌发培养阶段和生长培养阶段的营养液与实施例1不同，对比例2的营养液在萌发培养阶段和生长阶段的均为1/2ms营养液。
72.萌发培养60d后的结果为，白及种子幼苗真叶细长嫩绿，且生长速度较快，基部已可见膨大，如图7所示。
73.萌发培养90d后，白及幼苗细长，无明显鳞茎，如图8所示。
74.对比例3
75.按照实施例1的方法设置对比例3的方案，与实施例1不同的是，在萌发培养阶段和生长培养阶段的营养液与实施例1不同，对比例3的营养液在萌发培养阶段和生长阶段的均为ms营养液。
76.萌发培养60d后的结果为，幼苗真叶细小生长较慢，基部无可见膨大的部分，如图9所示。
77.萌发培养90d后，白及幼苗矮小，基部鳞茎膨大不明显，如图10所示。
78.由以上实施例可知，本发明提供了一种白及种子培养基组合及利用该培养基组合培养白及种子的方法。按照本发明的方法可以得到生长健壮，移栽成活率高的白及幼苗。
79.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。