提高夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的广金钱草种植方法

1.本发明属于植物种植技术领域，更具体地说，本发明涉及一种提高夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的广金钱草种植方法。


背景技术：

2.广金钱草作为一种传统的岭南药材，又名金钱草、铜钱草等，是豆科山蚂蝗属多年生草本植物，始载于《岭南草药志》，记载曰：“本品系蝶形花科山绿豆属中的一种直立亚灌木”，并附文献考证，“现代缪永祺谓金钱草(两广地区称广金钱草为金钱草)治疗膀胱结石甚为奇效”。《中国药典》1977年版才正式将其干燥的地上部分收载并定名为广金钱草，并将夏佛塔苷作为广金钱草质量检测的指标性成分，且规定其含量不得少于0.13％(即1.3mg/g)。
3.已有研究报道表明，黄酮类化合物是广金钱草消除或预防肾结石的主要活性成分，更准确的说是夏佛塔苷在广金钱草治疗结石的过程中发挥着重要作用。提高广金钱草夏佛塔苷含量，可以对切实保障广金钱草的临床结石治疗效果具有实践意义。
4.与此同时，作为一种黄酮碳苷类化合物，夏佛塔苷还具有抗呼吸道合胞病毒、抗糖尿病、抗高血压、抗氧化、抗炎和保肝等功效。异夏佛塔苷作为夏佛塔苷的同分异构体，同样具有以上功能，除此之外，异夏佛塔苷还具有抑制菟丝子等寄生类植物生长的作用，具有极高的开发价值。
5.目前广金钱草的种植方法一般是大田种植。通过调整氮磷钾施肥配比，采收时间等方式，能在一定程度上提高广金钱草中夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量，然而，这种方法受制于时间、空间、外界环境以及种植技术等因素，夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量波动幅度较大，此外，广金钱草的自然种植周期也很长，通常为一年一茬或一年两茬。
6.因此，开发一种可以稳定地、高效地提高夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的广金钱草种植方法非常有意义。


技术实现要素：

7.基于此，本发明的目的之一在于提供一种提高夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的广金钱草种植方法，该种植方法可以稳定地、显著地提高广金钱草中夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量。
8.实现上述发明目的的具体技术方案如下：
9.一种提高夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的广金钱草种植方法，包括以下步骤：将种植在营养土中的广金钱草种子苗，置于22000lux～28000lux的光照条件下培养不少于7d。
10.在其中一些实施例中，所述光照条件为24000lux～26000lux。
11.在其中一些实施例中，所述光照条件为24500lux～25500lux。
12.在其中一些实施例中，所述培养时间为7d～28d。
13.在其中一些实施例中，所述培养时间为7d～14d。
14.在其中一些实施例中，所述广金钱草种子苗的苗龄不小于14d。
15.在其中一些实施例中，所述广金钱草种子苗的苗龄为14d～18d。
16.在其中一些实施例中，培养时，每天14h～18h光照，6h～10h黑暗。
17.在其中一些实施例中，所述培养温度为23℃～25℃。
18.在其中一些实施例中，所述营养土为体积比2～4：1：1的基质土、蛭石和珍珠岩。
19.在其中一些实施例中，所述广金钱草种植方法，在培养不少于7d后还包括提取夏佛塔苷和异夏佛塔苷的步骤，包括以下步骤：收集广金钱草地上部，用液氮速冻，超低温研磨并冻干，加入70％～80％乙醇，超声提取，离心后取上清液，蒸干浓缩，再用70％～80％乙醇重悬后过滤，收集滤液，即得。
20.在其中一些实施例中，所述超声提取为35khz～45khz超声25min～35min。
21.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
22.1、广金钱草种子苗在室外生长时，夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量波动比较大，且相对较低，本发明的发明人经过大量实验后发现，大幅度提高广金钱草种子苗的光照处理强度，并结合精准调控光照处理的时长，能够显著地、并且稳定地提高广金钱草地上部中夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量。
23.2、本发明的方法操作简单，广金钱草种植周期大大缩短，可以做到一个月采收，甚至半个月采收，可以作为切实保障广金钱草药材的临床治疗效果的有效手段，应用于广金钱草夏佛塔苷和异夏佛塔苷的生产。
附图说明
24.图1为本发明实施例1和对比例1中14d苗龄的广金钱草种子苗在3000lux(对照)和25000lux(强光)光照处理14d后的表型。
25.图2为本发明实施例2和对比例2中14d苗龄的广金钱草种子苗在3000lux(对照)和25000lux(强光)光照处理7d后的表型。
26.图3为本发明实施例3和对比例3中14d苗龄的广金钱草种子苗在3000lux(对照)和25000lux(强光)光照处理28d后的表型。
27.图4为本发明试验例2中在7月份采集的广金钱草野生型样品中不同组织的表型。
28.图5为本发明试验例2中在8月份采集的广金钱草野生型样品中不同组织的表型。
29.图6为本发明试验例2中在9月份采集的广金钱草野生型样品中不同组织的表型。
具体实施方式
30.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
31.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
32.光合作用是绿色植物固定有机物及时有效的途径，而光是一切绿色植物生命活动
的基础，不同的光照强度对于绿色植物的产能具有明显的差异性。因此本发明的发明人通过对广金钱草采用不同光照强度的辐照，来探究光照强度对广金钱草夏佛塔苷和异夏佛塔苷积累的影响，解析广金钱草夏佛塔苷和异夏佛塔苷在不同光照强度辐照条件下的积累模式，为更好的开发和利用广金钱草夏佛塔苷和异夏佛塔苷的科学应用奠定基础。
33.本发明提供的一种提高夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的广金钱草种植方法，包括以下步骤：
34.将种植在营养土中的广金钱草种子苗，置于22000lux～28000lux的光照条件下培养不少于7d。
35.其中，在该步骤中，营养土为体积比2～4：1：1的基质土、蛭石和珍珠岩，优选体积比为3:1:1。广金钱草种子苗的苗龄不小于14d，优选为14d～18d，苗龄太小，种子苗比较脆弱，生物量较小，不利于后续的培养。所述光照条件优选为24000lux～26000lux，更优选为24500lux～25500lux，最优选为25000lux。所述培养时间为7d～28d，随着培养时间的延长，夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量积累会更多，综合时间成本和生产效率，培养时间优选为7d～14d，最优选为7d。
36.在本发明中，经上述种植方法种植后，收集广金钱草的地上部，对其中的广金钱草中夏佛塔苷和异夏佛塔苷进行了提取，提取方法包括以下步骤：
37.(1)、将广金钱草的地上部用液氮速冻，超低温研磨并冻干，获取样品；
38.(2)、每10mg样品加入1.0ml～1.2ml 70％～80％乙醇，35khz～45khz超声25min～35min，13000rpm～15000rpm离心4min～6min，吸取上清液；重复1次～2次，合并上清液；
39.(3)、蒸干浓缩上清液，用180μl～220μl 70％～80％乙醇溶液重悬，0.22μm过滤，收集滤液，即得夏佛塔苷和异夏佛塔苷。
40.本发明下列实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
41.以下结合具体实施例来详细说明本发明。
42.实施例1一种提高夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的广金钱草种植方法
43.本实施例的一种提高夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的广金钱草种植方法，包括以下步骤：
44.(1)、种植广金钱草种子苗
45.取500粒广金钱草种子，置于50ml离心管中，加入10ml浓硫酸，浸泡15min，吸出浓硫酸，纯水迅速冲洗5～6次，直至没有浓硫酸残留。添加30ml纯水，28℃、200rpm振荡培养2h，再次用纯水冲洗3～5次，而后28℃、200rpm振荡培养过夜，将种子平铺在载有湿润滤纸的玻璃皿内，23～25℃培养2d，即获得刚萌发的广金钱草种子苗。
46.将广金钱草种子苗点种在装有营养土(体积比2～4：1：1的基质土、蛭石和珍珠岩)的穴盘上，1穴4棵，23～25℃，3000lux，16h光照8h黑暗，培养14d。
47.(2)、光照处理
48.将上述培养14d后的广金钱草种子苗转移至高光(25000lux，high light，hl)光照条件下培养14d，其他条件不变。
49.(3)、提取广金钱草中的夏佛塔苷和异夏佛塔苷
50.培养14d，收集广金钱草的地上部，用液氮速冻，超低温研磨并冻干，获取样品；每
10mg样品加入1.0ml 75％乙醇，40khz超声30min，14000rpm离心5min，吸取上清液；重复2次，合并上清液；蒸干浓缩上清液，用200μl 75％乙醇溶液重悬，0.22μm过滤，收集滤液。
51.(4)、广金钱草中的夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量测定
52.a、色谱系统
53.采用c18柱(150mm
×
4.6mm,5μm,shimadzu,kyoto,japan)，柱温40℃，流速1ml/min，进样量10μl；流动相a：乙腈，流动相b：0.1％甲酸水；梯度洗脱：t＝0min，15％a；t＝20min，15％a；t＝21min，95％a；t＝25min，95％a，t＝26min，15％a；t＝29min，15％a。夏佛塔苷和异夏佛塔苷的检测波长均为335nm。
54.b、夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量计算
55.通过用不同浓度的夏佛塔苷和异夏佛塔苷标准品，在hplc上检测的积峰面积，构建浓度与峰面积的标准曲线。根据标准曲线计算广金钱草中的夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量。
56.实施例2一种提高夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的广金钱草种植方法
57.本实施例的一种提高夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的广金钱草种植方法，除了步骤(2)中培养时间为7d外，其他步骤均与实施例1相同。
58.实施例3一种提高夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的广金钱草种植方法
59.本实施例的一种提高夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的广金钱草种植方法，除了步骤(2)中培养时间为28d外，其他步骤均与实施例1相同。
60.实施例4一种提高夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的广金钱草种植方法
61.本实施例的一种提高夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的广金钱草种植方法，除了步骤(2)中光照强度为22000lux外，其他步骤均与实施例1相同。
62.实施例5一种提高夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的广金钱草种植方法
63.本实施例的一种提高夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的广金钱草种植方法，除了步骤(2)中光照强度为28000lux外，其他步骤均与实施例1相同。
64.对比例1
65.本对比例的一种广金钱草种植方法，除了步骤(2)中光照强度为3000lux外，其他步骤均与实施例1相同。
66.对比例2
67.本对比例的一种广金钱草种植方法，除了步骤(2)中光照强度为3000lux，培养时间为7d外，其他步骤均与实施例1相同。
68.对比例3
69.本对比例的一种广金钱草种植方法，除了步骤(2)中光照强度为3000lux，培养时间为28d外，其他步骤均与实施例1相同。
70.试验例1不同的光照强度、培养时间对夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的影响
71.本试验例比较了种植方法中不同的光照强度、培养时间对夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的影响。具体地说，分别比较了实施例1(高光，25000lux，14d)和对比例1(对照，3000lux，14d)的夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量；实施例2(高光，25000lux，7d)和对比例2(对照，3000lux，7d)的夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量；实施例3(高光，25000lux，28d)和对比例3(对照，3000lux，28d)的夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量。结果(每个处理3次重复后的
平均结果)分别如图1～3所示。
72.从图1～3可知，以广金钱草14d的种子苗为处理材料，3000lux和25000lux处理7d，与3000lux相比，25000lux光照强度处理能够显著提高广金钱草地上部夏佛塔苷和异夏佛塔苷的总含量(对比例2中总含量为13.17mg/g，实施例2中总含量为18.49mg/g，提升了40％)，并且随着处理时间的增加(处理时间延长到14d)，25000lux光照强度处理组的夏佛塔苷和异夏佛塔苷干重总含量提升得更加显著(对比例1中总含量为14.39mg/g，实施例1中总含量为22.80mg/g，提高了58％)，当处理时间延长到28d时，25000lux光照强度处理组的夏佛塔苷和异夏佛塔苷干重总含量进一步提升(对比例3中总含量为14.38mg/g，实施例3中总含量为27.61mg/g，提高了92％)。
73.试验例1的结果表明，采用强光(光照强度25000lux～28000lux)培养广金钱草种子苗7d～28d，可以显著地、且稳定地提升广金钱草中夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量，考虑到采收周期和生产效率，培养7d～14d最为经济有效，最理想的培养时间为7d。
74.试验例2本发明的种植方法与广金钱草野生型的夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量比较
75.本试验例比较了本发明的种植方法种植的广金钱草的地上部夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量，与2020年7、8、9月底采收的野生型广金钱草(4月初种植)的夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量(图4～6)。
76.相较于野生型广金钱草而言，本发明的种植方法种植的广金钱草的地上部夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量都有显著性的提升。
77.本发明光照处理7d的广金钱草地上部组织材料中夏佛塔苷含量为8.92mg/g，以处理周期估算为一个月计，即本发明种植方法有6个月(一年两茬，3m*2)的含量可以积累(8.92*6mg/g)，是药典标准(夏佛塔苷的含量为1.3*2mg/g)的20.58倍(8.92*6/1.3*2mg/g)，一年一茬(6m*1)的41.17倍；
78.本发明光照处理14d的广金钱草地上部组织材料中的夏佛塔苷含量为10.64mg/g，以处理周期估算为一个月计，即本发明种植方法有6个月(一年两茬，3m*2)的含量可以积累(10.64*6mg/g)，是药典标准(夏佛塔苷的含量为1.3*2mg/g)的24.54倍(10.64*6/1.3*2mg/g)，一年一茬(6m*1)的49.08倍。
79.相较于生长周期为6个月(即9月底采收)的野生型广金钱草而言，本发明光照处理14d的广金钱草地上部组织材料(以处理周期估算为一个月计)中的夏佛塔苷含量(10.64*6mg/g)分别是野生型茎(0.63mg/g)、叶(5.78mg/g)中的101.13倍和11.05倍，异夏佛塔苷含量(12.17*6mg/g)则是野生型茎(0.78mg/g)、叶(6.44mg/g)的93.76倍和11.33倍。
80.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
81.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。