大白菜抗TuMV近等基因系及其构建方法和应用

大白菜抗tumv近等基因系及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于蔬菜遗传学技术领域，具体涉及大白菜抗tumv近等基因系及其构建方法和应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.病毒病是危害我国大白菜生产的重要病害。我国大白菜病毒病主要是由三种病毒单独或复合浸染所致，即芜菁花叶病毒病(turnip mosaic virus,简称tumv)、黄瓜花叶病毒病(cucumber mosaic virus,简称cmv)和烟草花叶病毒病(tobacco mosaicvirus,简称tmv)。其中，tumv是主要病原。因此，建立高效大白菜tumv抗性基因转育和鉴定技术体系，对大白菜种质创新和抗病育种具有重要意义。
4.‘
冠291’是珍贵的大白菜育种材料，广义配合力好、杂交优势强、制种纯度高，利用它先后育成了鲁白一号、山东四号、山东六号、鲁白六号和丰抗70等多个在全国各地大面积推广的优良品种，其中有些品种目前仍在大面积种植。但是，该材料易感病毒病，使其应用受到了很大的限制。因此，通过遗传改良，提高抗病毒病能力，是
‘
冠291’继续在大白菜育种中发挥核心种质作用的必然选择。常规的改良方法是将
‘
冠291’与抗源材料进行杂交，然后在自交分离后代中筛选抗病毒病材料。这种方法不仅周期长、效率低，而且由于基因间的互作以及外界环境条件等因素的影响选择准确性差，入选单株无论生物学性状还是遗产背景均与“冠291”存在较大差异，有无真正的利用价值需重新评估。分子标记辅助选择(marker-assisted selection，mas)，可在植物发育的任何时期从dna分子水平上进行，具有快速、准确且不受环境条件的限制等优点。以抗源材料为供体亲本，
‘
冠291’为轮回亲本，借助分子标记逐代筛选抗tumv且遗传背景最接近
‘
冠291’的个体，能大大提高选择效率。因此，开展该研究对迅速获得抗tumv的
‘
冠291’近等基因系，继续发挥其在大白菜育种中的核心种质作用具有重要意义。
5.分子标记辅助选择是在dna标记基础上的育种策略，利用与目标性状紧密连锁的dna标记对研究对象进行选择，包括对目标基因跟踪的前景选择(foreground selection)和对非目标基因的遗传背景选择(background selection)。前景选择是标记辅助选择的主要方面，可靠性取决于标记与目标基因间连锁的紧密程度。若只用一个标记对目标基因进行选择，则标记与目标基因间的连锁必须非常紧密，而利用位于目标基因两侧的标记，更容易获得较高的准确率。根据扩增产物的带型差异，用于前景选择的标记有显性和共显性之分。显性标记只能区分目标性状的有无，而共显性标记则能判别性状的杂合与否，因而具有更高的应用价值。本研究室前期的研究，以
‘
8407’(抗tumv，开黄花)和
‘
冠291’(感tumv，开白花)为亲本，利用其bc1(f1ב
冠291’)代分离群体157个单株，采用bsa法，将大白菜tumv抗性基因turbcs01定位在两个共显性标记brid10723(1.3cm)和mbr4055(0.6cm)之间，为开
展大白菜抗tumv前景选择提供了可靠的标记支持。
6.背景选择是利用覆盖全基因组的分子标记对分离群体的单株进行全基因组扫描，构建每个单株在所有标记位点上图示基因型，利用数学统计方法，选择尽量多的标记位点上与优良受体亲本同型且纯合的单株。进行背景选择离不开遗传图谱，在过去二十年的时间里，白菜类遗传图谱的构建在国内外都取得了一定的进展，已有三十多张图谱被陆续报道。现有技术中构建的芸薹属a基因组的参照图谱，曾作为多国白菜基因组测序计划锚定序列的骨架。2011年，由我国科学家主导的白菜全基因组测序结果发表(http://brassicadb.org/brad/)，同时也发表了一张目前最有参考价值的白菜物理图谱。近十年来报道的白菜遗传图谱多以aflp、ssr等通用标记为主，尤其是ssr标记，因其操作简单、成本低，更适于用于背景选择。在网站http://brassicadb.org/brad/上发表的白菜物理图谱中的分子标记，可提供充足的背景标记。
7.关于大白菜分子标记用于辅助选择成功的例子已有报道。现有技术中有以含不育基因ms的大白菜细胞核复等位基因型雄性不育两用系“ab01”的可育株(msfms)为供体亲本，以高代自交系
‘
a20’(msms)为轮回亲本，采用杂交和连续回交转育方法，利用与不育基因ms连锁的scar标记syau_scr01(0.8cm)辅助不育基因ms选择，成功地将不育基因转育到可育品系
‘
a20’中，育成了不育度和不育株率均为100％，植物学性状与自交系
‘
a20’相近的新核不育系gms4。现有技术中以具有抗根肿病基因crb的大白菜
‘
cr shinkii dh’系为抗源，通过crb基因侧翼标记tcr01(1.97cm)和tcr09(0.43cm)的前景选择，以及51个ssr标记的基因组背景选择，选育出大白菜优良自交系
‘
bjn3’的9份抗根肿病近等基因系。这些近等基因系的结球相关性状与
‘
bjn3’无显著差异。关于大白菜抗tumv近等基因系的构建，目前尚未见报道。


技术实现要素：

8.为了解决现有技术中没有大白菜抗tumv近等基因系的问题，本发明提出大白菜抗tumv近等基因系及其构建方法和应用，可以快速获得大白菜tumv抗性基因turbcs01的种质改良，为更好地利用相关种质提供途径。
9.具体地，本发明通过以下技术方案实现：
10.本发明第一方面，提供一种用于构建大白菜抗tumv近等基因系的方法，包括如下步骤：
11.(1)分别以大白菜tumv抗病材料和感病材料为亲本，杂交构建f1代；
12.(2)利用感病亲本材料作为轮回亲本，首先与f1回交构建bc1代分离群体；
13.(3)利用大白菜tumv抗性基因两侧紧密连锁的分子标记为前景标记，筛选两侧分子标记均扩增为杂合条带且开白花的单株，利用感病亲本与上述单株进行回交构建bc2代分离群体；
14.(4)对bc2群体进行前景选择，同时从白菜基因组上挑选均匀分布在10条染色体上的若干个标记，选择在两亲本中有多态性的n个标记作为背景标记，用于背景选择；
15.(5)筛选开白花、前景选择为杂合条带且感病亲本背景基因组含量高的bc2单株，利用感病亲本与上述单株进行回交构建bc3代分离群体；
16.(6)再对bc3群体进行前景和背景选择，筛选开白花、前景选择为杂合条带且感病
亲本背景基因组含量高的几株，自交构建bc3f2群体；
17.(7)利用前景选择标记筛选在两标记位点均扩增为纯合抗病条带的单株，再对这些单株进行背景选择，选择开白花、在少数位点上表现杂合的单株自交构建bc3f3群体，
18.(8)利用杂合位点标记进行背景检测，获得全部恢复感病亲本基因组的纯合抗病近等基因系。
19.本发明第二方面，提供上述的方法获得的大白菜抗tumv近等基因系。
20.本发明第三方面，提供上述的方法在大白菜抗病毒病研究方面的应用。
21.本发明一个或多个实施例具有以下有益效果：
22.(1)本发明利用分子标记辅助选择的方法选育近等基因系，具有快速、准确的优点；
23.(2)运用本发明的方法，可快速获得大白菜tumv抗性基因turbcs01的种质改良，为更好地利用相关种质提供途径。
附图说明
24.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
25.图1为本发明实施例1中部分bc1单株的mbr4055(图1中a)和brid10723(图1中b)前景选择图，m：marker，p1：8407，p2：冠291，1-15：bc1群体的不同单株。
26.图2为本发明实施例1中引物brid10321的背景选择图，m：marker，p1：8407，p2：冠291，1-28：bc2群体的不同单株。
27.图3为冠291及其近等基因系接种tumv后的抗性表现图，图3中a为冠291接种tumv后，图3中b为抗tumv冠291近等基因系接种后。
具体实施方式
28.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
29.除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
30.为了解决这些问题，本发明构建了大白菜核心种质
‘
冠291’的抗tumv近等基因系，并公开了其构建方法。具有重要的理论和实用价值。
31.本发明所采用的技术方案如下：
32.本发明第一方面，提供一种用于构建大白菜抗tumv近等基因系的方法，包括如下步骤：
33.(1)分别以大白菜tumv抗病材料和感病材料为亲本，杂交构建f1代；
34.(2)利用感病亲本材料作为轮回亲本，首先与f1回交构建bc1代分离群体；
35.(3)利用大白菜tumv抗性基因两侧紧密连锁的分子标记为前景标记，筛选两侧分子标记均扩增为杂合条带且开白花的单株，利用感病亲本与上述单株进行回交构建bc2代
分离群体；
36.(4)对bc2群体进行前景选择，同时从白菜基因组网站http://brassicadb.org/brad/上挑选均匀分布在10条染色体上的若干个标记，选择在两亲本中有多态性的n个标记作为背景标记，用于背景选择；
37.(5)筛选开白花、前景选择为杂合条带且感病亲本背景基因组含量高的bc2单株，利用感病亲本与上述单株进行回交构建bc3代分离群体；
38.(6)再对bc3群体进行前景和背景选择，筛选开白花、前景选择为杂合条带且感病亲本背景基因组含量高的几株，自交构建bc3f2群体；
39.(7)利用前景选择标记筛选在两标记位点均扩增为纯合抗病条带的单株，再对这些单株进行背景选择，选择开白花且在少数位点上表现杂合的单株自交构建bc3f3群体；
40.(8)利用杂合位点标记进行背景检测，获得全部恢复感病亲本基因组的纯合抗病近等基因系。
41.在一些实施例中，所述构建方法包括：
42.(1)利用大白菜tumv抗病材料及感病的核心种质材料为亲本，构建f1代；
43.(2)利用感病材料作为轮回亲本，首先与f1回交构建bc1代分离群体；
44.(3)利用大白菜tumv抗性基因turbcs01两侧紧密连锁的分子标记标记brid10723和mbr4055为前景标记，筛选两侧分子标记均扩增为杂合条带且开白花的单株，利用感病亲本与上述单株进行回交构建bc2代分离群体；
45.(4)对bc2群体进行前景选择，同时从白菜基因组网站http://brassicadb.org/brad/上挑选均匀分布在10条染色体上的200个ssr标记，选择在两亲本中有多态性的49个标记作为背景标记用于背景选择；
46.(5)筛选开白花、前景选择为杂合条带且感病亲本背景基因组含量高的bc2单株，利用感病亲本与上述单株进行回交构建bc3代分离群体；
47.(6)再对bc3群体进行前景和背景选择，筛选开白花、前景选择为杂合条带且感病亲本背景基因组含量高的几株，自交构建bc3f2群体；
48.(7)利用前景选择标记筛选在两标记位点均扩增为纯合抗病条带的单株，再对这些单株进行背景选择，选择开白花、在少数位点上表现杂合的单株自交构建bc3f3群体；
49.(8)利用杂合位点标记进行背景检测，获得全部恢复感病亲本基因组的纯合抗病近等基因系。
50.本发明利用分子标记辅助选择的方法进行种质改良，与常规改良方法相比，具有快速、准确且不受环境条件的限制等优点。
51.在一些实施例中，所述tumv抗性基因为显性单基因。
52.在一些实施例中，背景标记为ssr或indel标记。
53.在一些实施例中，前景标记与目标基因的遗传距离为2cm左右。
54.在一些实施例中，所述回交及自交5-7代。
55.在一些实施例中，利用标记brid10723和mbr4055进行前景选择。
56.在一些实施例中，步骤(1)中感病材料为
‘
冠291’。本发明可以提供一种大白菜核心种质冠291的抗tumv近等基因系及其构建方法。
57.在一些实施例中，所述近等基因系为大白菜核心种质冠291的抗tumv近等基因系。
58.本发明第二方面，提供上述的方法获得的大白菜抗tumv近等基因系。
59.本发明第三方面，提供上述的方法在大白菜抗病毒病研究方面的应用。
具体实施方式
[0060][0061]
实施例1:
[0062]
抗tumv的冠291近等基因系的选育。
[0063]
⑴
分别以大白菜tumv国家级抗源材料
‘
8407’和感病的核心种质材料
‘
冠291’为亲本，杂交构建f1代；
[0064]
⑵
利用感病亲本材料
‘
冠291’作为轮回亲本，首先与f1回交构建bc1代分离群体，以含有157个单株的bc1群体为研究对象，继续开展下一步的研究；
[0065]
⑶
利用大白菜tumv抗性基因两侧紧密连锁的分子标记brid10723和mbr4055为前景标记，筛选两侧分子标记均扩增为杂合条带且开白花的单株10株，与轮回亲本
‘
冠291’回交构建bc2群体；
[0066]
⑷
从白菜基因组网站上均匀选择10条染色体上的ssr或i ndel标记204个，以两亲本基因组dna为模板进行扩增，有49个标记在两亲本间扩增多态性，用于背景分析；
[0067]
⑸
选取bc2群体311个单株，利用标记brid10723和mbr4055进行前景选择，从上述49个多态性标记中，均匀选择29个进行背景选择，结合抗病性鉴定和白花性状选择，选取一株在两标记位点均扩增为杂合抗病条带且开白花的
‘
冠291’基因组含量最高的抗病单株，回交构建bc3群体；
[0068]
⑹
对bc3群体103个单株进行前景选择，利用bc2扩增为杂合条带的标记及剩余的20个标记进行背景选择，结合tumv抗性鉴定和白花性状的选择，筛选2株前景选择为杂合抗病条带
‘
冠291’基因组含量最高的开白花抗病单株，分别自交构建bc3f2群体；
[0069]
⑺
对两个bc3f2群体各56株和68株进行tumv抗性鉴定、前景选择及杂合标记的背景选择，筛选
‘
冠291’基因组含量最高的纯合抗病单株8株自交构建bc3f3群体；
[0070]
⑻
利用杂合位点标记对167株bc3f3群体进行背景分析，筛选获得3个全部恢复
‘
冠291’基因组的纯合抗病近等基因系，编号为tr
‘
冠291-1
’‑
tr
‘
冠291-3’。
[0071]
本发明大白菜抗tumv近等基因系的创制，是将原来感病的核心种质材料冠291通过分子标记辅助选择结合白花性状的选择，获得了抗tumv的冠291育种材料，有利于更好地发挥该材料的育种价值。
[0072]
本发明获得了骨干系大白菜育种材料
‘
冠291’的3个抗tumv近等基因系，分别编号为tr
‘
冠291-1’、tr
‘
冠291-2’和tr
‘
冠291-3’，为该材料更好地发挥在大白菜育种中的核心种质作用奠定了基础。
[0073]
表1：49对多态性引物序列信息
[0074]
[0075]
[0076][0077]
mbr4055引物序列为：gggttctcggctactggact(seq id no.99)、tcatcatgagacacatcctctcc(seq id no.100)；
[0078]
brid10723引物序列为：gctttcctcgtgtcattaga(seq id no.101)、ctttccgagtttccatagtg(seq id no.102)；
[0079]
brid10321引物序列为：tgtgtttcctagtgtgttgg(seq id no.103)、atcagtctgagggttcatca(seq id no.104)。
[0080]
实施例2冠291及其近等基因系结球性状对比
[0081]
试验在2020年秋季开展，冠291及其近等基因系tr
‘
冠291-1’、tr
‘
冠291-2’和tr
‘
冠291-3’各播种25株，分别选取6株，调查其毛重、球重、外叶数、内叶数、球高、球粗、短缩茎长和短缩茎宽，以冠291为对照，利用wps软件分析其差异显著性，结果表明，三个近等基因系的各项性状指标与对照冠291之间均无显著差异。表明近等基因系tr
‘
冠291-1’、tr
‘
冠291-2’和tr
‘
冠291-3’恢复了冠291的主要农艺性状。
[0082]
表2：
‘
冠291’及其近等基因系结球性状对比
[0083][0084]
以上所揭露的仅为本发明的优选实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明申请专利范围所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。