一种春石斛兰拟原球茎诱导方法

1.本发明涉及外植体诱导技术领域，更具体的说是涉及一种春石斛兰拟原球茎诱导方法。。


背景技术：

2.春石斛兰为兰科石斛属植物，兼具观赏和药用价值，为“四大观赏兰”之一，深受我国人民喜爱。由于春石斛兰种苗克隆困难，利用组培方式芽繁时芽生长周期长，损耗原材料多等问题，严重阻碍国内春石斛兰的产业发展。
3.现有观赏春石斛栽培品种无性系的组织培养快速繁殖方法大都是以丛生芽的增殖为出发点，其增殖速度约为1.5～2倍/月，增殖效率较低。部分春石斛栽培品种采用播种无菌种子进行繁殖，种子的幼胚吸水膨胀，中部的胚细胞分裂增殖，突破合点端种皮形成球形或椭圆形的原球茎，原球茎的增殖速度约为4～5倍/月，但播种繁殖得到的后代，其基因型和栽培性状分离很大。
4.因此，提供一种春石斛兰拟原球茎诱导方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种春石斛兰拟原球茎诱导方法。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种春石斛兰拟原球茎诱导方法，具体包括以下步骤：
8.(1)种子处理：选择成熟饱满的春石斛兰种子，去除外种皮，消毒；
9.(2)育苗：将消毒后的春石斛兰种子接种在1/2ms液体培养基中培养30-40天，至种子类原球茎发育成球形，转移至分化壮苗培养基上继续培养60-90天，直至春石斛兰成苗；
10.(3)外植体培养：在无菌条件下切取春石斛兰苗顶叶，超声波处理，接种于诱导培养基中进行诱导培养，得春石斛兰拟原球茎。
11.进一步的，步骤(1)所述消毒方法为：将春石斛兰种子浸泡于2.5％次氯酸钠溶液中消毒30min，最后用无菌水漂洗3次。
12.进一步的，步骤(2)所述分化壮苗培养基为：1/2ms固体培养基+naa(萘乙酸)0.5-1mg/l、ad(腺嘌呤)0.5-2mg/l。
13.进一步的，步骤(2)所述转移至分化壮苗培养基培养条件为：温度25℃，光周期12h/天，光强度3200lx。
14.进一步的，步骤(3)所述超声波处理的强度为30khz，时间为20min。
15.进一步的，步骤(3)所述诱导培养基为：1/2ms固体培养基+naa0.5-1mg/l、6-ba(6-苄基嘌呤)1-3mg/l、ad 0.5-2mg/l、苯基噻二唑基脲0.05-0.1mg/l。
16.进一步的，步骤(3)所述诱导培养的条件为：温度25-28℃，光照强度6000-8000lx，培养时间为1-2个月。
17.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
18.本发明完善了春石斛兰拟原球茎繁苗的种苗生产技术，加速了春石斛兰克隆苗的快速繁殖和规模化生产，通过拟原球茎诱导可以大量繁殖种苗，提高生产效率，缩短育种时间；
19.本发明在拟原球茎诱导过程中采用改良的1/2ms培养基通过提高n等元素含量的浓度进一步提高诱导率；
20.本发明对缩短春石斛兰杂交种后代的育种时间具有重要的借鉴价值，可以在组培瓶中直接大量诱导拟原球茎而快速扩繁种苗，满足育种需要的杂交后代克隆苗；拟原球茎还可作为春石斛转基因育种的受体材料，从而通过拟原球茎可以获得更多春石斛的转基因品种。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
22.图1附图为本发明实施例1步骤(2)种子诱导发芽。
23.图2附图为本发明实施例1步骤(2)春石斛兰成苗。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.实施例1
26.一种春石斛兰拟原球茎诱导方法，具体包括以下步骤：
27.(1)种子处理：选择成熟饱满的春石斛兰种子，去除外种皮，将春石斛兰种子浸泡于2.5％次氯酸钠溶液中消毒30min，最后用无菌水漂洗3次；
28.(2)育苗：将消毒后的春石斛兰种子接种在1/2ms液体培养基中培养30天，至种子类原球茎发育成球形，转移至分化壮苗培养基(1/2ms固体培养基+naa 0.5mg/l、ad 0.5mg/l。)上继续培养90天，温度25℃，光周期12h/天，光强度3200lx，直至春石斛兰成苗；
29.(3)外植体培养：在无菌条件下切取春石斛兰苗顶叶，超声波处理，30khz，时间为20min，接种于诱导培养基(1/2ms固体培养基+naa 0.5mg/l、6-ba 1mg/l、ad 0.5mg/l、苯基噻二唑基脲0.05mg/l)中进行诱导培养，温度25℃，光照强度6000lx，培养时间为2个月，得春石斛兰拟原球茎。
30.实施例2
31.一种春石斛兰拟原球茎诱导方法，具体包括以下步骤：
32.(1)种子处理：选择成熟饱满的春石斛兰种子，去除外种皮，将春石斛兰种子浸泡于2.5％次氯酸钠溶液中消毒30min，最后用无菌水漂洗3次；
33.(2)育苗：将消毒后的春石斛兰种子接种在1/2ms液体培养基中培养40天，至种子
类原球茎发育成球形，转移至分化壮苗培养基(1/2ms固体培养基+naa 1mg/l、ad 2mg/l。)上继续培养60天，温度25℃，光周期12h/天，光强度3200lx，直至春石斛兰成苗；
34.(3)外植体培养：在无菌条件下切取春石斛兰苗顶叶，超声波处理，30khz，时间为20min，接种于诱导培养基(1/2ms固体培养基+naa 1mg/l、6-ba 3mg/l、ad 2mg/l、苯基噻二唑基脲0.1mg/l)中进行诱导培养，温度28℃，光照强度8000lx，培养时间为1个月，得春石斛兰拟原球茎。
35.对比例1
36.步骤(2)中分化壮苗培养基不包括naa、ad；步骤(3)中诱导培养基不包括naa、ad；其余同实施例1；
37.在实验过程中分别统计实施例1、实施例2、对比例1的春石斛兰拟原球茎诱导率与春石斛兰拟原球茎增殖倍数，得以下结果：
38.表1春石斛兰拟原球茎诱导效果比较
[0039][0040]
表1结果表明，本发明可以有效提高春石斛兰拟原球茎诱导率，拟原球茎诱导效果高达26.7％与43.3％；
[0041]
表2春石斛兰拟原球茎增殖培养
[0042][0043]
表2结果表明，本发明可以有效提高春石斛兰拟原球茎增殖效率，最高增值倍数为7.2倍；
[0044]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。