1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种甘蔗组培脱毒方法。
背景技术：
2.甘蔗花叶病(sugarcane mosaic virus,scmv)和宿根矮化病(ratoon stunting disease, rsd)是重要的世界性甘蔗病害。在我国福建、广东、广西、四川和浙江等主要蔗区普遍发生。甘蔗在种植过程中感染甘蔗花叶病和宿根矮化病而引起品种种性退化，直接影响了甘蔗的品质及产量，严重阻碍了甘蔗的生产和利用。甘蔗组培脱毒技术是解决甘蔗种性退化的主要技术措施。因此，甘蔗脱毒种苗越来越受到广大甘蔗栽培者的欢迎。我国在甘蔗茎尖组培脱毒方面也取得了很多研究成果，建成了组培脱毒苗的繁育产业化技术体系。甘蔗茎尖组织培养脱毒技术是甘蔗脱毒苗产业化的基础，优质快速的茎尖组培脱毒技术为甘蔗新品种脱毒苗和脱毒苗的生产赢得了时间和效益。通过组织培养途径，建立脱毒种苗生产体系是目前非常有效的控制甘蔗花叶病和宿根矮化病的重要方法。
3.目前还少有抗病毒药剂在甘蔗组培脱毒方面的应用研究，而在甘蔗种苗脱毒方法上常用一次茎尖脱毒，但切取的茎尖小，成活率低，很难达到一次脱毒成功的效果。导致使用的种苗原材料量大，而脱毒效率低下，工作量大但脱毒效率低。同时茎尖脱毒过程中大多使用分化培养的方法，1-3mm的茎尖在分化培养基中，出苗的速度慢，成活率低。
4.因此本方法提出一方面甘蔗材料的前期加强营养管理，另一方面使用抗病毒药剂以减少材料的带毒量。同时在组培苗阶段进行多次茎尖脱毒处理，大大的提高了甘蔗组培苗的脱毒效率，大大减少了原种苗的使用量
技术实现要素：
5.本发明的目的在于提供一种甘蔗组培茎尖脱毒效率高、成苗率和脱毒效率均比较高的甘蔗茎尖脱毒方法。
6.为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：一种甘蔗组培脱毒方法，其特征在于：包括以下步骤：
7.(1)：用于脱毒的甘蔗种原材料种植于水肥条件较好的地块，加强水肥管理，甘蔗种原材料生长充分，从田间选择生长健壮的甘蔗植株，选取中段成熟茎节作为脱毒的材料；
8.(2)：选取步骤(1)中的茎节作为脱毒的材料，茎节的芽选择成熟饱满的芽，茎节切成三至五个芽一段，放于恒温水浴锅中；
9.(3)：步骤(2)温水处理过的甘蔗种茎，切成单芽后浸泡于抗病菌药液泡种10分钟， 38-42℃恒温催芽1周；
10.(4)：步骤(3)中恒温催芽得到10cm的芽，在无菌的超净工作台中切取1-3mm茎尖，接种于ms液体培养基中，培养出愈伤组织，分化出试管苗；
11.(5)：步骤(4)中的试管苗经过分化长出10-30个芽后，转入生根培养基中培养15天，可再次切取茎尖分生组织，接种于液体培养基中，培养出愈伤组织，分化出新的试管苗；
12.(6)：步骤(5)根据品种和pcr检测的结果，带毒的试管苗重复进行茎尖脱毒培养；步骤(4)和(5)中获得的试管苗取叶片进行病毒的检测；通过甘蔗花叶病和宿根矮化病的检测，分离出不带病毒的健康组培种苗单株，并通过组培快繁的方法大量繁育出甘蔗的健康种苗，推广应用于甘蔗种植区。
13.进一步的；所述步骤(2)中，放于恒温水浴锅中的温度为52-58℃，温水浸泡时间为 30-120min。
14.进一步的；所述骤(3)中，抗病菌药液由2.5％咯菌腈悬浮剂1200倍液、8％宁南霉素水剂 1200倍液、5％氨基寡糖素水剂2000倍液、30％盐酸吗啉胍1500倍液、螯合锌肥1000倍液组成。
15.进一步的；所述骤(5)中，切取茎尖分生组织的长度为1-3mm。
16.进一步的；所述骤(4)和(5)中，液体培养基中含有1-3mg/l 2,4-d的ms。
17.与现有技术相比，本发明的至少具有以下有益效果之一：
18.第一、可以在相对短的周期内获得甘蔗脱毒试管苗；具体地，本发明使用愈伤诱导的方法获得茎尖组织的分化试管苗，成活率高，多次脱毒而分化培养效率高，时间短。
19.第二、获得的种苗脱毒效率高；具体地，由于常用的茎尖脱毒方法是使用大量的甘蔗种茎，52℃温水处理2小时后，催芽后取一次茎尖组织，分化出芽后，通过pcr检测筛选出无毒种苗，再通过遗传鉴定后快繁，用于生产。而本发明通过提高植物的营养生长和使用抗病毒药剂，利用脱过毒的组培苗多次脱毒，减少了种苗的使用量，缩短了脱毒的周期，提高了脱毒的效率。
20.第三、本发明方法通过抗病毒药剂的浸泡降低了甘蔗原种苗带毒量，结合传统的温水脱毒，有效的降低了脱毒种苗中的带毒率，同时对组培苗多次茎尖脱毒，可大大的减少脱毒过程中原种茎的使用量，多次脱毒的效果也大大优于一次脱毒的效果，线条花叶病的脱毒效率可以达到20％，脱毒的周期缩短约50％，成苗时间为60天左右。改善了甘蔗茎尖脱毒成苗困难的情况，突破了甘蔗常规脱毒方法线条花叶病和宿根矮化病难以脱除的技术瓶颈。
具体实施方式
21.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
22.实施例1
23.一种甘蔗组培脱毒方法，包括以下步骤：
24.(1)：用于脱毒的甘蔗种原材料种植于水肥条件较好的地块，加强水肥管理，包括有机肥、复合肥等，甘蔗种原材料生长充分，从田间选择生长健壮的甘蔗植株，选取中段成熟茎节作为脱毒的材料；具体的，甘蔗在干旱和营养缺乏的情况下，带毒量会增加。增加甘蔗脱毒原材料的水肥条件，可以提高甘蔗的免疫能力，减少植株的带毒量。相同的生长条件下，健壮的植株带毒率要比长势弱的低，因此在栽种甘蔗材料的条件要好，并选择其中生长健壮的植株作为脱毒的材料。
25.(2)：选取步骤(1)中的茎节作为脱毒的材料，茎节的芽选择成熟饱满的芽，茎节切
成三至五个芽一段，放于恒温水浴锅中；茎节切成三至五个芽一段，在52℃温水浸泡时甘蔗两端会因为甘蔗切面组织在温水的作用下出现坏死，而导致两端的芽死亡率较高，因此，甘蔗茎节切成长段有利于后期芽的成活。
26.(3)：步骤(2)温水处理过的甘蔗种茎，切成单芽后浸泡于抗病菌药液泡种10分钟， 38℃恒温催芽1周；具体的，甘蔗在抗病菌药液的作用下，一方面具有较好的抗菌作用，可以减少组织的进一步坏死，提高温水处理后甘蔗的发芽率。另一方面，宁南霉素，氨基寡糖素，盐酸吗啉胍可以钝化病毒，降低病毒活力的作用，螯合锌肥则可以提高植物的免疫力。
27.(4)：步骤(3)中恒温催芽得到10cm的芽，在无菌的超净工作台中切取1mm茎尖，接种于ms液体培养基中，培养出愈伤组织，分化出试管苗；
28.(5)：步骤(4)中的试管苗经过分化长出10个芽后，转入生根培养基中培养15天，可再次切取茎尖分生组织，接种于液体培养基中，培养出愈伤组织，分化出新的试管苗；
29.(6)：步骤(5)根据品种和pcr检测的结果，带毒的试管苗重复进行茎尖脱毒培养；步骤(4)和(5)中获得的试管苗取叶片进行病毒的检测；通过甘蔗花叶病和宿根矮化病的检测，分离出不带病毒的健康组培种苗单株，并通过组培快繁的方法大量繁育出甘蔗的健康种苗，推广应用于甘蔗种植区；
30.所述步骤(2)中，放于恒温水浴锅中的温度为52℃，温水浸泡时间为120min；
31.所述骤(3)中，抗病菌药液由2.5％咯菌腈悬浮剂1200倍液、8％宁南霉素水剂1200倍液、5％氨基寡糖素水剂2000倍液、30％盐酸吗啉胍1500倍液、螯合锌肥1000倍液组成；
32.所述骤(5)中，切取茎尖分生组织的长度为1mm；
33.所述骤(4)和(5)中，液体培养基中含有1-3mg/l 2,4-d的ms。利用组培苗的茎尖脱毒获得新的脱毒试管苗，可以大大减少原种苗材料的使用量，减少了温水脱毒的步骤，同时经过一次茎尖脱毒的材料携带病毒的量相对比较少，加之试管苗在试管中生长速度快，带毒量相对会比较少。
34.实施例2
35.在实施例1的基础上，一种甘蔗组培脱毒方法，包括以下步骤：
36.(1)：用于脱毒的甘蔗种原材料种植于水肥条件较好的地块，加强水肥管理，包括有机肥、复合肥等，甘蔗种原材料生长充分，从田间选择生长健壮的甘蔗植株，选取中段成熟茎节作为脱毒的材料；具体的，甘蔗在干旱和营养缺乏的情况下，带毒量会增加。增加甘蔗脱毒原材料的水肥条件，可以提高甘蔗的免疫能力，减少植株的带毒量。相同的生长条件下，健壮的植株带毒率要比长势弱的低，因此在栽种甘蔗材料的条件要好，并选择其中生长健壮的植株作为脱毒的材料。
37.(2)：选取步骤(1)中的茎节作为脱毒的材料，茎节的芽选择成熟饱满的芽，茎节切成三至五个芽一段，放于恒温水浴锅中；茎节切成三至五个芽一段，在58℃温水浸泡时甘蔗两端会因为甘蔗切面组织在温水的作用下出现坏死，而导致两端的芽死亡率较高，因此，甘蔗茎节切成长段有利于后期芽的成活。
38.(3)：步骤(2)温水处理过的甘蔗种茎，切成单芽后浸泡于抗病菌药液泡种10分钟， 42℃恒温催芽1周；具体的，甘蔗在抗病菌药液的作用下，一方面具有较好的抗菌作用，可以减少组织的进一步坏死，提高温水处理后甘蔗的发芽率。另一方面，宁南霉素，氨基寡糖素，盐酸吗啉胍可以钝化病毒，降低病毒活力的作用，螯合锌肥则可以提高植物的免疫力。
39.(4))：步骤(3)中恒温催芽得到10cm的芽，在无菌的超净工作台中切取3mm茎尖，接种于ms液体培养基中，培养出愈伤组织，分化出试管苗；
40.(5)：步骤(4)中的试管苗经过分化长出30个芽后，转入生根培养基中培养15天，可再次切取茎尖分生组织，接种于液体培养基中，培养出愈伤组织，分化出新的试管苗；
41.(6)：步骤(5)根据品种和pcr检测的结果，带毒的试管苗重复进行茎尖脱毒培养；步骤(4)和(5)中获得的试管苗取叶片进行病毒的检测；通过甘蔗花叶病和宿根矮化病的检测，分离出不带病毒的健康组培种苗单株，并通过组培快繁的方法大量繁育出甘蔗的健康种苗，推广应用于甘蔗种植区；
42.所述步骤(2)中，放于恒温水浴锅中的温度为58℃，温水浸泡时间为30min；
43.所述骤(3)中，抗病菌药液由2.5％咯菌腈悬浮剂1200倍液、8％宁南霉素水剂1200倍液、5％氨基寡糖素水剂2000倍液、30％盐酸吗啉胍1500倍液、螯合锌肥1000倍液组成；
44.所述骤(5)中，切取茎尖分生组织的长度为3mm；
45.所述骤(4)和(5)中，液体培养基中含有3mg/l 2,4-d的ms；
46.利用组培苗的茎尖脱毒获得新的脱毒试管苗，可以大大减少原种苗材料的使用量，减少了温水脱毒的步骤，同时经过一次茎尖脱毒的材料携带病毒的量相对比较少，加之试管苗在试管中生长速度快，带毒量相对会比较少。
47.实施例3
48.在实施例1-2的基础上，在实施例1的基础上，一种甘蔗组培脱毒方法，包括以下步骤：
49.(1)：用于脱毒的甘蔗种原材料种植于水肥条件较好的地块，加强水肥管理，包括有机肥、复合肥等，甘蔗种原材料生长充分，从田间选择生长健壮的甘蔗植株，选取中段成熟茎节作为脱毒的材料；具体的，甘蔗在干旱和营养缺乏的情况下，带毒量会增加。增加甘蔗脱毒原材料的水肥条件，可以提高甘蔗的免疫能力，减少植株的带毒量。相同的生长条件下，健壮的植株带毒率要比长势弱的低，因此在栽种甘蔗材料的条件要好，并选择其中生长健壮的植株作为脱毒的材料。
50.(2)：选取步骤(1)中的茎节作为脱毒的材料，茎节的芽选择成熟饱满的芽，茎节切成三至五个芽一段，放于恒温水浴锅中；茎节切成三至五个芽一段，在55℃温水浸泡时甘蔗两端会因为甘蔗切面组织在温水的作用下出现坏死，而导致两端的芽死亡率较高，因此，甘蔗茎节切成长段有利于后期芽的成活。
51.(3)：步骤(2)温水处理过的甘蔗种茎，切成单芽后浸泡于抗病菌药液泡种10分钟， 40℃恒温催芽1周；具体的，甘蔗在抗病菌药液的作用下，一方面具有较好的抗菌作用，可以减少组织的进一步坏死，提高温水处理后甘蔗的发芽率。另一方面，宁南霉素，氨基寡糖素，盐酸吗啉胍可以钝化病毒，降低病毒活力的作用，螯合锌肥则可以提高植物的免疫力。
52.(4)：步骤(3)中恒温催芽得到10cm的芽，在无菌的超净工作台中切取2mm茎尖，接种于ms液体培养基中，培养出愈伤组织，分化出试管苗；
53.(5)：步骤(4)中的试管苗经过分化长出20个芽后，转入生根培养基中培养15天，可再次切取茎尖分生组织，接种于液体培养基中，培养出愈伤组织，分化出新的试管苗；
54.(6)：步骤(5)根据品种和pcr检测的结果，带毒的试管苗重复进行茎尖脱毒培养；步骤(4)和(5)中获得的试管苗取叶片进行病毒的检测；通过甘蔗花叶病和宿根矮化病的检
测，分离出不带病毒的健康组培种苗单株，并通过组培快繁的方法大量繁育出甘蔗的健康种苗，推广应用于甘蔗种植区；
55.所述步骤(2)中，放于恒温水浴锅中的温度为55℃，温水浸泡时间为75min；
56.所述骤(3)中，抗病菌药液由2.5％咯菌腈悬浮剂1200倍液、8％宁南霉素水剂1200倍液、5％氨基寡糖素水剂2000倍液、30％盐酸吗啉胍1500倍液、螯合锌肥1000倍液组成；
57.所述骤(5)中，切取茎尖分生组织的长度为1-3mm；
58.所述骤(4)和(5)中，液体培养基中含有1-3mg/l 2,4-d的ms；
59.利用组培苗的茎尖脱毒获得新的脱毒试管苗，可以大大减少原种苗材料的使用量，减少了温水脱毒的步骤，同时经过一次茎尖脱毒的材料携带病毒的量相对比较少，加之试管苗在试管中生长速度快，带毒量相对会比较少。
60.本发明方法简化了茎尖剥离的步骤，显著降低了茎尖剥离技术难度，使再生植株由弱苗变壮苗，变传统多步骤成苗为一步成苗，成苗时间为60天左右，缩短脱毒周期约61.2％
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70.6％，实现了从蔗茎到脱毒苗长周期变短周期的跨越；增加成苗率30.6％以上，改善了茎尖剥离成苗困难的现状；提高脱毒率65.5％以上，突破了甘蔗常规脱毒法甘蔗花叶病和宿根矮化病难以脱除的技术瓶颈。
61.本发明技术从缩短脱毒周期和保证甘蔗试管苗的脱毒效率两个环节入手，通过抗病菌药液浸泡，使甘蔗的种茎进行热处理结合化学处理，无菌环境下剥离茎尖，转入优化的愈伤诱导的液体培养基，对成苗的试管苗进行病毒检测，获得健康的脱毒试管苗，达到高效生产脱毒种苗的目的。
62.本方法经过多次茎尖培养脱毒，进而减少了繁琐的温水脱毒步骤。
63.综上，本发明从化学处理和多次茎尖脱毒两种处理手段结合起来，提高了甘蔗种苗花叶病和宿根矮化病的脱毒效率。
64.尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本技术公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本技术公开和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。