一种建立小鼠原位膀胱癌模型的新方法与流程

1.本发明涉及基础医学研究动物实验技术领域，具体地说，是一种小鼠膀胱原位肿瘤模型的构建方法。


背景技术：

2.膀胱癌是泌尿生殖系统常见恶性肿瘤之一，其90％以上的病理类型为移行细胞癌，术后肿瘤易复发。随着科学研究技术的进步，研究膀胱癌的生物学行为、发病进展的机制及临床治疗方案一直是医学界的研究重点。因此，一种接近人类发病情况的动物模型是膀胱肿瘤科学研究的重要工具。其中，小鼠原位膀胱肿瘤模型是膀胱肿瘤最合适的动物模型之一。
3.因小鼠原位膀胱肿瘤模型具有于临床膀胱肿瘤相似的病理过程具有更强的实用性。目前常用的小鼠原位膀胱肿瘤模型有以下几类：(1)、小鼠同种非自发原位膀胱肿瘤模型；(2)、小鼠异种非自发原位膀胱肿瘤模型；(3)、小鼠自发原位膀胱肿瘤模型；目前后两种动物模型对造模的小鼠品系、实验环境较高，且造模周期较长，步骤复杂，造模成本较高，小鼠同种非自发原位膀胱肿瘤模型造模周期短，对小鼠品系要求较低，造模成本低，可尽快批量制造大量小鼠原位膀胱肿瘤模型。目前常用的小鼠同种非自发原位膀胱肿瘤模型有以下几种：(1)、硝酸银化学侵蚀或蛋白酶消化处理小鼠膀胱黏膜，随后腔内接种小鼠膀胱肿瘤细胞，该方法对要求小鼠为雌性，造模周期久，动物损伤较大。(2)、机械损伤膀胱黏膜后再接种膀胱肿瘤细胞，该方法操作难度大，手术时间长，难以大量复制。
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、小鼠膀胱肌壁内注射膀胱肿瘤细胞，传统的方法操作容易造成腹腔播散转移，使肿瘤研究增加多种不可控因素，可能直接导致实验结果不可靠。目前使用最多的小鼠同种非自发原位膀胱肿瘤模型为机械损伤膀胱黏膜法，对于上述方法的各种不足，亟待一种新方法综合以上优点，为膀胱肿瘤研究提供一种成瘤率高、成瘤效果稳定、低成本、可大量复制的小鼠同种原位膀胱肿瘤模型。
4.中国专利文献：cn201910249471.9，申请日2019.03.29，专利名称为：一种新型小鼠膀胱肿瘤原位模型的建立方法。公开了一种新型小鼠膀胱肿瘤原位模型的建立方法，包括以下操作步骤：步骤s1、固定小鼠；步骤s2、预处理；步骤s3、对小鼠进行消毒；步骤s4、排空小鼠膀胱；步骤s5、清洗装置；步骤s6、对装置进行烘干；步骤s7、注射药物；步骤s8、对其进行观察。
5.上述专利文献cn201910249471.9中的一种新型小鼠膀胱肿瘤原位模型的建立方法，通过对实现小鼠内的膀胱癌建模进行观察实验，做到降低人体膀胱癌的发病率，以及提高人体膀胱癌的治理效果。但是关于一种改进和优化现有的小鼠膀胱原位肿瘤构建的操作复杂、耗时久、激素干扰等不足，本发明提供了一种操作简化、更符合膀胱肿瘤人体环境的小鼠膀胱原位肿瘤模型构建方法目前则没有相关的报道。
6.综上所述，亟需一种改进和优化现有的小鼠膀胱原位肿瘤构建的操作复杂、耗时久、激素干扰等不足，本发明提供了一种操作简化、更符合膀胱肿瘤人体环境的小鼠膀胱原
位肿瘤模型构建方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种改进和优化现有的小鼠膀胱原位肿瘤构建的操作复杂、耗时久、激素干扰等不足，本发明提供了一种操作简化、更符合膀胱肿瘤人体环境的小鼠膀胱原位肿瘤模型构建方法。
8.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
9.一种建立小鼠原位膀胱癌模型的新方法，其包括小鼠性别、手术微量注射用微量注射器。
10.作为一种优选的技术方案，小鼠性别为雄性。
11.作为一种优选的技术方案，手术过程中进行细胞接种的设备为微量注射器。
12.作为一种优选的技术方案，所述新方法，包括以下步骤：
13.s1.提前准备扩增好人源或鼠源膀胱肿瘤细胞，保证细胞活力良好，预处理后使用细胞重悬液充分重悬，调整合适的细胞浓度为5x106左右，置于冰上备用；
14.s2.将雄性常规野生型小鼠或免疫缺陷小鼠抓起后轻抚小鼠下腹部膀胱区，帮助其尽量排出尿液，随即麻醉并固定，随即使用脱毛膏将小鼠下腹部脱毛；
15.s3.动物可用消毒剂喷洒脱毛区消毒，随即于小鼠腹部行1cm切口找到膀胱，轻柔挤压出体外；
16.s4.使用移液器充分重悬冰上的细胞，随即使用微量注射器吸取10ul细胞液，于小鼠膀胱血管旁进行进针，保持微量注射器针头在膀胱肌壁内，缓慢进针3-5mm，然后通过微量注射器针头挑起小鼠膀胱，将微量注射器内的细胞液全部注入，观察到有白色皮丘，无菌酒精棉球按压下拔出针头，持续按压；
17.s5.随后将膀胱送回小鼠腹腔，间断缝合关腹，送回原饲养环境观察；
18.s6.定期观察小鼠尿液颜色变化，观察时轻轻按摩小鼠下腹部膀胱区，出现血尿随即停止观察。
19.本发明优点在于：
20.1、本发明的一种建立小鼠原位膀胱癌模型的新方法，所用的雄性小鼠可避免其他类似动物模型的雌鼠，避免雌激素对肿瘤发生发展的影响，同时通过微量注射器进行细胞的膀胱璧接种，可显著降低甚至避免造模过程中出现的腹腔播散转移不良后果，因此对膀胱肿瘤的科学研究提供了重要的小鼠原位膀胱癌模型。
21.2、改进和优化了现有的小鼠膀胱原位肿瘤构建的操作复杂、耗时久、激素干扰等不足，本发明提供了一种操作简化、更符合膀胱肿瘤人体环境。
附图说明
22.附图1是本发明的手术操作过程。
23.附图2是本发明观察终点小鼠血尿现象、腹腔脏器情况、病理he染色结果及b超影像结果。
具体实施方式
24.下面结合实施例并参照附图对本发明作进一步描述。
25.实施例1
26.为了更好地理解本发明内容，下面结合附图对本发明作进一步阐述；请参看附图1-2，图1是是本发明的手术操作过程，其具体包括：
27.1、提前准备扩增好mb49鼠源膀胱肿瘤细胞，保证细胞活力良好，预处理后使用1wbs充分重悬，调整细胞浓度为5x106左右，置于冰上备用；
28.2、将6只雄性常规c57bl/6j野生型小鼠抓起后轻抚小鼠下腹部膀胱区，帮助其尽量排出尿液，随即使用1％戊巴比妥麻醉并固定，随即使用脱毛膏将小鼠下腹部脱毛；
29.3、75％乙醇喷洒脱毛区消毒，随即于小鼠腹部行1cm切口找到膀胱，轻柔挤压出体外；
30.4、使用1ml移液器充分重悬冰上的细胞，随即使用10ul汉密尔顿微量注射器吸取10ul细胞液，于小鼠膀胱血管旁进行进针，保持微量注射器针头在膀胱肌壁内，缓慢进针3-5mm,然后通过微量注射器针头挑起小鼠膀胱，将微量注射器内的细胞液全部注入，观察到有白色皮丘，无菌酒精棉球按压下拔出针头，持续按压30s；
31.5、将膀胱送回小鼠腹腔，使用6-0丝线间断缝合3针关腹，送回原饲养环境观察；
32.6、每隔三天观察小鼠尿液颜色变化，观察时轻轻按摩小鼠下腹部膀胱区，出现血尿随即停止观察。
33.观察到第三周，小鼠出现血尿(图2),随即进行膀胱b超检查，然后解剖小鼠观察腹腔脏器情况，取出小鼠膀胱进行he染色观察病理结果(图2)
34.由图2结果可以，造模三周后小鼠出现肉眼血尿(a),腹腔脏器未见明显转移(b),病理结果为肌层浸润型尿路上皮癌(c),6只小鼠b超全部出现膀胱占位(d)。
35.需要说明的是：本发明要求的鼠源膀胱肿瘤细胞或人源膀胱肿瘤细胞要求自身具有成瘤性；本发明提供了三种制剂，包括重悬细胞液，小鼠麻醉剂、动物可用消毒剂；本发明实验细胞和动物的配对关系为：鼠源细胞配对常规野生型小鼠或免疫缺陷鼠，人源细胞配对免疫缺陷鼠；以上为本领域技术人员熟知的，不在发明范围内，对此不进行特别的限制。本发明申请的细胞浓度为5x106/ml，过高可缩短成瘤时间，也可能导致实验失败，过低可能延长成瘤时间，也可能导致实验失败，其具体包括：
36.1、提前准备扩增好人源或鼠源膀胱肿瘤细胞，保证细胞活力良好，预处理后使用细胞重悬液充分重悬，调整合适的细胞浓度为5x106左右，置于冰上备用；
37.2、将雄性常规野生型小鼠或免疫缺陷小鼠抓起后轻抚小鼠下腹部膀胱区，帮助其尽量排出尿液，随即麻醉并固定，随即使用脱毛膏将小鼠下腹部脱毛；
38.3、动物可用消毒剂喷洒脱毛区消毒，随即于小鼠腹部行1cm切口找到膀胱，轻柔挤压出体外；
39.4、使用移液器充分重悬冰上的细胞，随即使用微量注射器吸取10ul细胞液，于小鼠膀胱血管旁进行进针，保持微量注射器针头在膀胱肌壁内，缓慢进针3-5mm,然后通过微量注射器针头挑起小鼠膀胱，将微量注射器内的细胞液全部注入，观察到有白色皮丘，无菌酒精棉球按压下拔出针头，持续按压；
40.5、随后将膀胱送回小鼠腹腔，间断缝合关腹，送回原饲养环境观察；
41.6、定期观察小鼠尿液颜色变化，观察时轻轻按摩小鼠下腹部膀胱区，出现血尿随即停止观察。
42.本发明的一种建立小鼠原位膀胱癌模型的新方法，所用的雄性小鼠可避免其他类似动物模型的雌鼠，避免雌激素对肿瘤发生发展的影响，同时通过微量注射器进行细胞的膀胱璧接种，可显著降低甚至避免造模过程中出现的腹腔播散转移不良后果，因此对膀胱肿瘤的科学研究提供了重要的小鼠原位膀胱癌模型；改进和优化了现有的小鼠膀胱原位肿瘤构建的操作复杂、耗时久、激素干扰等不足，本发明提供了一种操作简化、更符合膀胱肿瘤人体环境。
43.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。