利用玉米异源多倍体培育抗草地贪夜蛾玉米品种的方法

1.本发明属于玉米育种方法领域，具体涉及一种利用玉米异源多倍体培育抗草地贪夜蛾玉米品种的方法。


背景技术：

2.草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)又称秋行军虫、秋黏虫、草地夜蛾等，属于夜蛾科灰翅夜蛾属，是一种原产于美洲热带地区的害虫，它是一种多食性和迁徙性害虫，至少取食超过76个科，超过350种植物，主要为害玉米、水稻、大豆、甘蓝等农作物。被草地贪夜蛾侵害的叶片会出现半透明薄膜小孔和不规则的长形孔洞，它们能将整株玉米叶片吃掉，严重时会造成玉米死亡。不仅如此，草地贪夜蛾的食量极大，特别是到高龄期，其具有爆发性，其吃光一片地区后会成群迁移到其他农作物区继续危害，严重危害作物的生长。草地贪夜蛾具有适生区域广、迁飞能力、繁殖能力强、寄主范围广、取食量大、为害程度重和防控难度大等特点。
3.目前对草地贪夜蛾的防治主要采取化学农药、生物防治、灯光诱杀等手段，但是这些方法存在防治效果差、易产生抗药性或环境污染等不同问题。培育抗草地贪夜蛾的品种是防治草地贪夜蛾最经济有效的途径，但是由于长期片面追求高产优质的育种目标，致使玉米种质的遗传基础愈加狭窄，抵御虫害侵袭的能力越来越弱。在现有的玉米种质中尚未发现抗草地贪夜蛾的种质材料。
4.作物的野生种质资源长期生存在严酷的自然环境下，可抵御各种生物与非生物胁迫，野生种质资源的利用将进一步丰富抗性来源，有效提升栽培作物对害虫的抗性。摩擦禾和大刍草是玉米的近缘属种，它们由于长期生存在严酷的野生自然条件下，具有丰富的遗传多样性，包括含有对多种胁迫如虫害、不良生境等有较强的抗性特性，但是由于存在生殖隔离，玉米近缘野生种和栽培玉米杂交通常不能结实，致使玉米近缘野生种的抗性种质资源很难转育到栽培玉米中。
5.玉米异源六倍体mtf-1(tripsazea creammaize t.；2n＝76)是四川农业大学通过远缘杂交育成的含有玉米(zea mays l.)、四倍体多年生类玉米 (zea perennis)和摩擦禾(tripsacum dactyloides l.)的全套染色体的玉米异源六倍体材料(苏月贵.四川农业大学硕士论文，2009)。该玉米异源六倍体雌性可育，用摩擦禾、大刍草或玉米作为父本给其授粉，都可产生少量后代，因此，以该玉米异源六倍体作为桥梁材料，可将摩擦禾和大刍草中的优良基因转移到玉米中，丰富玉米的种质基础。
6.mtp(tripsazea creammaize t.2n＝74)是从mtf-1衍生出来的玉米异源多倍体材料(muhammad zafar lqbal等.planta.2019年3月20日在线发表于https://dpl.prg/10.1007//s00425-019＝03136-z)，其具有雌穗可育特性，用玉米、摩擦禾或四倍体多年生大刍草作为父本给其授粉，均能产生少量后代。因此，利用mtp的这种特性，可将玉米近缘野生种中的抗性特性转育到普通栽培玉米中。
7.经检索，没有发现利用玉米异源多倍体mtp培育抗草地贪夜蛾玉米品种的报道。


技术实现要素：

8.本发明人在四川温江进行草地贪夜蛾接虫鉴定试验时，意外发现本发明人创制的玉米异源多倍体mtp对草地贪夜蛾具有很高的抗性。本发明是在上述意外发现的基础上实现的。
9.为了解决草地贪夜蛾对玉米危害的问题，本发明目的在于提供玉米异源多倍体在培育抗草地贪夜蛾玉米品种上的用途。
10.本发明另一目的在于提供一种利用玉米异源多倍体培育抗草地贪夜蛾玉米品种的方法。
11.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
12.玉米异源多倍体在培育抗草地贪夜蛾玉米品种上的应用。
13.所述的玉米异源多倍体是指mtp(tripsazea creammaize t.2n＝74)。
14.所述的玉米异源多倍体mtp是在四川农业大学育成的含有玉米、摩擦禾和四倍体多年生类玉米全套染色体的玉米异源六倍体mtf-1(tripsazeacreammaize t.2n＝76)的基础上衍生出来的玉米异源多倍体(muhammad zafarlqbal等.planta.https://dpl.prg/10.1007//s00425-019＝03136-z，2019年 3月20日在线发表)，其具有雌穗可育特性，用玉米、摩擦禾或四倍体多年生大刍草作为父本给其授粉，均能产生少量后代。
15.本发明还提供了一种利用玉米异源多倍体培育抗草地贪夜蛾玉米品种的方法，包括如下步骤：
16.(1)、春季3月份，在地温升至10℃以上，将玉米异源多倍体mtp (tripsazea creammaize t.2n＝74)通过分蔸、扦插或其他无性繁殖方式获得种苗，并按株行距为1m
×
1m进行单株种植；同时，按株行距0.35m
×
0.45m 分10批播种玉米自交系a，每批20株，每批间隔3天；
17.(2)、在吐丝前将mtp雌穗套袋，吐丝后将花丝剪短至2～3cm，用玉米自交系a的花粉给mtp的雌穗授粉；第一次授粉后隔2天再授粉一次，共授粉3次，每次授粉后在纸袋上做标记，成熟时收获，获得f1代；
18.(3)、将f1代按株行距0.7m
×
0.7m单株种植；同时，和步骤(1)一样分期播种玉米自交系a；在开花散粉期，以f1代为母本，以玉米自交系a为父本进行回交，获得bc1f1代；
19.(4)、种植bc1f1代，同时，和步骤(1)一样分期播种玉米自交系a；在 6～8叶期，对bc1f1代进行田间自然条件下的抗草地贪夜蛾鉴定或进行田间接虫抗草地贪夜蛾鉴定，选择叶片损伤等级为1.0～4.0(依据cimmty制定的叶片损伤分级标准)，且农艺性状倾向于玉米自交系a的单株；用玉米自交系 a作为父本给所选单株授粉，进行回交，得bc2f1代；
20.(5)、重复步骤(4)2-4次，得bc4f1代～bc6f1代；
21.(6)、将步骤(5)所得bc4f1代～bc6f1回交后代自交；选择自交后代中抗草地贪夜蛾、且农艺性状表现一致的品系，即为育成的抗草地贪夜蛾的玉米自交系。
22.上述方法步骤(1)中所述的玉米异源多倍体mtp(tripsazea creammaizet.2n＝74)是在四川农业大学育成的含有玉米、摩擦禾和四倍体多年生类玉米全套染色体的玉米异源六倍体mtf-1(tripsazea creammaize t.2n＝76)的基础上衍生出来的玉米异源多倍体(muhammad zafar lqbal 等.planta.https://dpl.prg/10.1007//s00425-019＝03136-z，2019年3月 20日在线发表)，其具有雌穗可育特性，用玉米、摩擦禾或四倍体多年生大刍
草作为父本给其授粉，均能产生少量后代。
23.本技术人承诺自本发明申请日起二十年内向公众提供mtp的生物材料。公众可从四川农业大学获得mtp的生物材料。
24.上述方法步骤(1)～(4)中所述的玉米自交系a是指生产上常用的优良自交系；如b73、郑58、mo17或昌7-2等。
25.上述方法步骤(4)中所述的田间接虫抗草地贪夜蛾鉴定是指每个单株接种草地贪夜蛾初孵幼虫30条，接种于心叶位置，分别7d和14d后逐一调查单株叶片损伤程度以鉴定其抗性，鉴定标准为cimmyt制定的玉米叶片损伤 1～9分级标准。
26.一种抗草地贪夜蛾的玉米杂交种的育种方法，所述的育种方法是指以上述方法育成的抗草地贪夜蛾的自交系为亲本，组配杂交种。
27.本发明具有的优点和有益效果：(1)、本发明人在接虫鉴定时意外发现玉米异源多倍体mtp对草地贪夜蛾具有较高抗性，本发明为解决草地贪夜蛾对玉米的危害提供了一种新的玉米种质材料，同时丰富了玉米的抗虫资源，并为通过育种方法解决草地贪夜蛾的危害提供了一个最经济有效的新途径。(2) 本发明玉米异源多倍体mtp含有玉米、摩擦禾和四倍体多年生类玉米的接近整套染色体，mtp可和玉米、摩擦禾或四倍体多年生类玉米杂交，克服了玉米与近缘属种之间远缘杂交的困难，因而，mtp可作为桥梁材料将玉米近缘属种中含有的草地贪夜蛾抗性基因转移到玉米中，使得抗草地贪夜蛾的育种方法变得简单、成本低、效率高。(3)、利用本发明方法选出的玉米品种对草地贪夜蛾抗性强，可以显著降低草地贪夜蛾对玉米的危害，大大减少玉米产量损失，还能显著降低草地贪夜蛾的种群数量。
附图说明
28.图1为b73和mtpb73对草地贪夜蛾抗性鉴定的叶片损伤对比照片。
具体实施方式
29.以下以具体实施例对本发明作进一步的解释和说明，但是本发明不限于此。
30.实施例1玉米异源多倍体mtp和玉米近缘野生种对草地贪夜蛾抗性鉴定试验
31.(一)实验材料及来源
32.(1)玉米异源多倍体mtp；(2)四倍体指状摩擦禾tz07；(3)四倍体多年生类玉米9475。
33.上述mtp、tz07和9475均来源于四川农业大学。
34.(二)试验方法
35.(1)在春季3月份，四川温江地温升至100c以上时，将mtp进行分蔸、扦插等无性繁殖获得种苗，并按株行距70cm
×
70cm进行单株种植；同时将 tz07、9475进行播种，并按株行距70cm
×
70cm进行单株种植。
36.(2)供试材料在田间实验完成前的生育期不施用化学农药，播种后45 天，进行各材料单株接虫鉴定。
37.(3)每个单株接种草地贪夜蛾初孵幼虫30条，接种于心叶位置，分别于接虫后7d和14d逐一调查单株叶片损伤程度进行鉴定，鉴定标准为cimmyt 制定的玉米叶片损伤分级标准(见表1)；其中14d的鉴定数据，为主要的单株抗性鉴定依据。
38.4)鉴定完成后，使用化学农药对植株和田间扑杀两遍，确保草地贪夜蛾不外逃。
39.表1玉米叶片损伤分级标准(cimmyt制定)
[0040][0041][0042]
结果(见表2)四倍体指状摩擦禾tz07对草地贪夜蛾的抗性级别平均为 1.0，为高抗；四倍体多年生类玉米9475对草地贪夜蛾的抗性级别平均为 2.00-3.66，为抗到中抗；玉米异源多倍体mtp对草地贪夜蛾的抗性级别平均为1.66-3.33，为抗到中抗材料，其抗性级别介于tz07和9475中间。
[0043]
上述结果说明玉米异源多倍体mtp和2个玉米近缘野生种都对草地贪夜蛾具有较高的抗性，均可以作为抗性资源加以利用。其中玉米异源多倍体mtp 与摩擦禾、四倍体多年生类玉米、普通玉米均可杂交获得后代，适合作为桥梁材料将抗草地贪夜蛾基因从mtp转移到普通栽培玉米中。
[0044]
表2 mtp等对草地贪夜蛾抗性鉴定试验结果(平均数)
[0045]
试验材料名称7天叶片损伤等级14天叶片损伤等级mtp1.663.3394752.003.66tz071.001.00
[0046]
实施例2：利用玉米异源多倍体mtp培育抗草地贪夜蛾的玉米自交系试验
[0047]
按照如下方法进行：
[0048]
(1)、2017年春季，待地温升至10℃以上，不影响玉米出苗时，将mtp (tripsazea creammaize t.2n＝74；公众可从四川农业大学获得mtp的生物材料)通过分蔸、扦插或其他无性繁殖方式获得种苗，然后按株行距为1m
×
1m 进行单株种植；同时，分10批播种玉米自交系b73，株行距为0.35m
×
0.45m，每批20株，每批间隔3天。
[0049]
(2)、在吐丝前将mtp雌穗套袋，吐丝后将花丝剪短至2～3cm；用b73 花粉给mtp雌穗授粉，第一次授粉后隔2天再授粉一次，共授粉3次，每次授粉后在纸袋上做标记，成熟时
收获，获得f1代种子。
[0050]
(3)、2019年春天在四川温江，按株行距为0.35m
×
0.45m种植f1代(2017 年收获的杂交后于冰箱内保留的种子)；同时，和步骤(1)一样分期播种b73；在开花散粉期以f1代为母本，以b73为父本进行回交，获得bc1f1代。
[0051]
(4)、2019年秋季9月在云南西双版纳试验基地，将步骤(3)所得的 bc1f1代种子按株行距0.7m
×
0.7m在田间种植，以相应背景下的玉米自交系 b73做为对照，在6-8叶期在田间自然条件下(西双版纳田间自然条件下有草地贪夜蛾发生)进行草地贪夜蛾抗性鉴定，选择叶片损伤级别为1.0～4.0 (依据cimmyt制定的玉米叶片损伤分级标准，见实施例1表1)的单株，用 b73做父本给其授粉，得bc2f1代。
[0052]
(5)、2020年春季3月在四川温江试验基地，将步骤(4)所得的种子按株行距为0.7m
×
0.7m种植，以相应背景下的玉米自交系b73作为对照，进行田间接虫抗草地贪夜蛾鉴定，选择叶片损伤级别为1.0～4.0(依据cimmyt 制定的玉米叶片损伤分级标准，见实施例1表1)的单株，用b73做父本给其授粉，得bc3f1代。
[0053]
(6)、2020年秋季9月在云南西双版纳试验基地，将步骤(5)所得的 bc2f1代种子田间种植后，以相应背景下的玉米自交系b73作为对照，进行田间自然抗草地贪夜蛾抗性鉴定，选择叶片损伤级别为1.0～4.0(依据cimmyt 制定的玉米叶片损伤分级标准，见实施例1表1)的单株，用b73做父本给其授粉，得bc4f1代。
[0054]
(7)、2021年春季3月在四川宁南试验基地，将步骤(6)所得bc4f1代种植，在6-8叶期进行田间接虫抗草地贪夜蛾鉴定，选择叶片损伤等级为1.0～4.0级(依据cimmyt制定的玉米叶片损伤分级标准，见实施例1表1)、且农艺性状表现一致的单株进行自交，即得bc
4 f 2
代。
[0055]
(8)2021年秋季9月在云南西双版纳试验基地，将步骤(7)所得的bc
4 f 2
代按株行距0.7m
×
0.7m种植成穗行，在6～8叶期，在田间自然条件下进行玉米抗草地贪夜蛾鉴定，其中一个编号为018的品系(见图1)叶片损伤等级平均为2.0～3.0级(依据cimmyt制定的玉米叶片损伤分级标准，见实施例1表1)且抗性不再分离、另外，其农艺性状表现一致且不再分离、雌雄协调，将该新育成的抗草地贪夜蛾的玉米自交系，命名为mtpb73。
[0056]
实施例3：本发明育成的抗草地贪夜蛾品系mtpb73发田间抗性鉴定对比试验 (一)实验材料及来源
[0057]
(1)b73；
[0058]
(2)实施例1中育成的玉米自交系mtpb73。
[0059]
以上材料均来源于四川农业大学。
[0060]
(二)试验方法
[0061]
(1)2022年春季3月份，温江地温升至100c以上时，按照株行距为0.35m
ꢀ×
0.45m分别种植播种b73和mtpb73；
[0062]
(2)供试材料在田间实验完成前的生育期不施用化学农药，播种45天后，待玉米约8叶期，进行各材料单株接虫鉴定。
[0063]
(3)每个单株接种草地贪夜蛾初孵幼虫30条，接种于心叶位置，分别 7d和14d后逐一调查单株叶片损伤程度以鉴定其抗性，鉴定标准为cimmyt 制定的玉米叶片损伤1～9分级标准(见表1)；其中14d的鉴定数据，为主要的单株抗性鉴定依据。
[0064]
(4)鉴定完成后，使用化学农药对植株和田间扑杀两遍，确保草地贪夜蛾不外逃。
[0065]
结果从表3可以看出，b73叶片损伤级别表现为感或高感，mtpb73叶片损伤级别表现为抗。说明mtp具有抗草地贪夜蛾基因，且可作为桥梁材料通过回交育种育成抗草地贪夜蛾的自交系或品种。
[0066]
表3本发明育成自交系mtpb73和b73的田间抗虫鉴定对比试验结果(叶片损伤等级)
[0067]
试验材料名称7d14db737.669.00mtpb732.332.66
[0068]
实施例4饲喂mtpb73和b73对草地贪夜蛾生长发育影响的室内对比试验
[0069]
(一)实验材料及来源
[0070]
(1)b73；
[0071]
(2)实施例1中育成的玉米自交系mtpb73。
[0072]
以上材料均来源于四川农业大学。
[0073]
(3)试验用草地贪夜蛾幼虫及成虫于人工气候箱培养，饲养条件为：温度(27
±
1)℃，湿度65％
±
5％，光照l/d＝16h/8h。其中幼虫以人工配制的饲料统一培养；成虫以10％蜂蜜水培养。
[0074]
(二)试验方法
[0075]
以b73和mtpb73的心叶及功能叶分组饲养代初孵幼虫，选择1.5l塑料盒(长21cm，宽15cm，高8cm)，盒盖用昆虫针扎孔，底部垫吸水滤纸，每盒放玉米心叶及功能叶约5g，再接入代初孵幼虫，每组3个重复，每个重复40 头虫。当幼虫3龄时改用12孔板(孔径2.25cm，深度1.74cm)分头饲养。蛹羽化为成虫后选择15对成虫，放置于用保鲜膜包覆的养虫笼内，并以10％蜂蜜水补充营养。试验培养条件：温度(27
±
1)℃，湿度65％
±
5％，光照 l/d＝16h/8h。
[0076]
其中幼虫期，每天更换每个材料对应的新鲜玉米心叶及功能叶，记录虫重、虫长数据，并及时清理粪便，记录各发育阶段的死亡虫数及发育历期；蛹期，化蛹第二天称量蛹重；其中成虫期，待其交配后，每天定时观察其产卵情况，并收集卵块，统计各组产卵量及孵化率。
[0077]
结果从表4可以看出，与用轮回亲本b73饲喂草地贪夜蛾相比，用本发明育成的mtpb73饲喂草地贪夜蛾，能够显著降低草地贪夜蛾的成活率、羽化率；此外还影响成虫的雌雄比例，降低成虫的产卵量；延长草地贪夜蛾一个世代的发育周期，能够降低草地贪夜蛾的多世代危害。
[0078]
从表5可以看出，与不抗草地贪夜蛾的玉米自交系b73相比，本发明育成的抗草地贪夜蛾的自交系mtpb73能显著抑制草地贪夜蛾的生长发育，且能显著降低草地贪夜蛾幼虫重量。
[0079]
综上，mtpb73可从多方面对草地贪夜蛾的取食起到抵御作用，其对草地贪夜蛾抗性显著，可显著减少玉米产量损失。
[0080]
表4喂食b73和mtpb73对草地贪夜蛾生长发育影响的对比试验结果
[0081][0082]
表5喂食b73和mtpb73后草地贪夜蛾各龄期虫重对比试验结果
[0083]