一种含有赤霉病抗性基因的改良小麦的培育方法与流程

1.本技术涉及农业科学技术领域，具体而言，涉及一种含有赤霉病抗性基因的改良小麦的培育方法。


背景技术：

2.小麦赤霉病(fusarium head blight，fhb)，又名红头瘴、烂麦头、麦穗枯、红麦头，是全球性小麦主要病害之一，由亚洲镰刀菌(fusarium asiaticum)和禾谷镰刀菌(f.graminearium)引发的，主要发生于温暖湿润地区。中国长江中下游麦区和东北东部春麦区为该病的主要流行区，致病菌以禾谷镰刀菌为主，占小麦赤霉病病原菌的94.5％。20世纪60年代以后陕西关中灌区赤霉病逐年加重。80年代以后，由于扩大灌溉、气候变暖、秸秆还田等原因，小麦赤霉病逐渐向黄淮麦区、北方麦区等地区扩展。1985年全国赤霉病大流行，仅河南省发病面积就达到3.0
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106hm2。2000年以来，赤霉病在中国大流行频率不断增加，发病面积呈明显扩大趋势，有9个年份赤霉病的发生面积超过3.3
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106hm2，目前中国小麦受害面积约为7.00
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106hm2，其中长江中下游冬麦区是小麦赤霉病的多发区和重发区。中国黄淮麦区、关中麦区以及西南冬麦区近年来小麦赤霉病发生也日趋严重。
3.赤霉病严重威胁小麦安全生产，一般流行年份可引起5％～10％的产量损失，大流行年份可导致相当田块绝收，从而严重影响着国内小麦主产区的粮食安全和食品安全。赤霉病不仅造成小麦产量巨大损失，使小麦的产量和品质下降，该病菌为害小麦后，可产生多种真菌毒素，其中以脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)毒性最强。这些毒素会污染面粉，并可在食物链中长期存留，产生致癌物质，严重影响籽粒的食用、饲用和种用价值。因此，小麦赤霉病已成为世界高度关注的一类病害。
4.目前，小麦赤霉病的防治主要依赖于化学防治，但防治药剂较少，抗性产生严重。20世纪80年代发现灰霉病菌、甜菜霜霉病菌等对多菌灵产生了抗药性，给化学防治带来严峻的考验。另外，采用栽培措施和化学防治方法虽然取得了一定的防治效果，但均不能从根本上解决赤霉病的为害。


技术实现要素：

5.本技术的目的在于提供一种含有赤霉病抗性基因的改良小麦的培育方法，此培育方法培育得到的小麦具有赤霉病抗性，从根本上解决赤霉病害的问题。
6.本技术解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
7.本技术实施例提供一种含有赤霉病抗性基因的改良小麦的培育方法，包括以下步骤：
8.将待改良小麦植株做母本，含有已知抗赤霉病基因(fhb1、fhb2、fhb3、fhb4、fhb5、fhb6或fhb7)的抗病亲本做父本进行种植并杂交，获得f1杂交种；
9.将所述f1杂交种作为母本与待改良小麦植株进行种植并回交，获得bc1杂交种；
10.将所述bc1杂交种与待改良小麦植株进行种植，利用上述抗赤霉病基因对应的分
子标记检测bc1植株的dna，筛选阳性后代作为母本与待改良小麦植株回交，获得bc2杂交种；
11.将所述bc2杂交种与待改良小麦植株进行种植，利用上述抗赤霉病基因对应的分子标记检测bc2植株的dna，筛选阳性后代植株作为母本，待改良小麦植株作为父本进行回交，获得bc3杂交种；
12.将所述bc3杂交种与待改良小麦植株进行种植，利用上述抗赤霉病基因对应的分子标记检测bc3植株的dna，筛选阳性后代植株作为母本，待改良小麦植株作为父本进行回交，获得bc4杂交种；
13.将所述bc4杂交种进行种植，利用上述抗赤霉病基因对应的分子标记检测bc4植株的dna，筛选阳性后代进行自交，得到自交后代，该自交后代植株为含有赤霉病抗性基因且农艺性状稳定的改良小麦。
14.相对于现有技术，本技术的实施例至少具有如下优点或有益效果：
15.1、本技术采用普通小麦品种作为改良亲本与赤霉病高抗资源作为供体亲本进行杂交，再将杂交种与改良亲本进行回交，回交后的杂交后代筛选阳性植株继续回交和自交，培育得到具有含有赤霉病抗性基因的改良小麦。该方法相比于传统赤霉素防治方法不会带来抗药性，可大量减少农药的使用，安全环保、抗病性好，从小麦本身达到解决赤霉病病害的效果。
16.2、本技术的改良时间与现有的改良方法相比可以明显缩短时间，小麦一年可回交4代，自交1代，因此采用本技术工艺一年就可以完成改良，且改良后的小麦农艺性状稳定。
17.3、本技术采用抗赤霉病基因对应的分子标记检测植株的dna来筛选阳性后代植株进行回交和自交，稳定抗性基因完成改良后统一进行大田赤霉病抗性鉴定，相比于其他改良方法，本技术方法具有目标性明确、准确率高、群体小易于操作以及节省人工等优点。
附图说明
18.为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
19.图1为本技术实施例小麦播种后覆膜发芽实物图；
20.图2为本技术实施例小麦出苗后实物图；
21.图3为本技术实施例小麦苗期实物图；
22.图4为本技术实施例小麦杂交成长期实物图；
23.图5为本技术实施例小麦成熟期实物图；
24.图6为本技术实施例小麦杂交结实实物图；
25.图7为本技术实施例抗赤霉病基因kasp分子标记检测结果图；
26.图8为本技术实施例小麦改良材料阳性植株麦赤霉病抗性基因分子标记的琼脂糖电泳检测验证图。
具体实施方式
27.为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
28.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本技术。
29.一种含有赤霉病抗性基因的改良小麦的培育方法，包括以下步骤：
30.将待改良小麦植株做母本，含有已知抗赤霉病基因(fhb1、fhb2、fhb3、fhb4、fhb5、fhb6或fhb7)的抗病亲本做父本进行种植并杂交，获得f1杂交种；
31.将所述f1杂交种作为母本与待改良小麦植株进行种植并回交，获得bc1杂交种；
32.将所述bc1杂交种与待改良小麦植株进行种植，利用上述抗赤霉病基因对应的分子标记检测bc1植株的dna，筛选阳性后代作为母本与待改良小麦植株回交，获得bc2杂交种；
33.将所述bc2杂交种与待改良小麦植株进行种植，利用上述抗赤霉病基因对应的分子标记检测bc2植株的dna，筛选阳性后代植株作为母本，待改良小麦植株作为父本进行回交，获得bc3杂交种；
34.将所述bc3杂交种与待改良小麦植株进行种植，利用上述抗赤霉病基因对应的分子标记检测bc3植株的dna，筛选阳性后代植株作为母本，待改良小麦植株作为父本进行回交，获得bc4杂交种；
35.将所述bc4杂交种进行种植，利用上述抗赤霉病基因对应的分子标记检测bc4植株的dna，筛选阳性后代进行自交，得到自交后代，该自交后代植株为含有赤霉病抗性基因且农艺性状稳定的改良小麦。
36.在本技术的一些实施例中，所有上述种植步骤均为：
37.将泥炭土与大田红土按照3：1的质量比进行混合并装入直径为25-35cm的盆中，厚度为25cm，浇透水，静置20-40min；
38.将小麦种子播种到盆中，播种深度为0.8-1.2cm，覆土，覆膜，进行种植培养。
39.在本技术的一些实施例中，上述种植培养期间的水肥管理包括：苗期每天每盆浇水450-550ml；拔节、灌浆期每天每盆浇水900-1200ml。
40.在本技术的一些实施例中，上述种植培养期间的光温管理具体为：每天光照16h，黑暗8h；光照是温度为25-28℃，黑暗时16-18℃。在本技术中，光照、温度等环境需要人工精确控制，所以本技术的整个过程均在人工气候室中进行。
41.在本技术的一些实施例中，上述杂交步骤具体为：在小苗开花期，母本选择已出穗、雄蕊未成熟的穗子，去雄，套袋，待2-5天后，雌蕊完全成熟后，收集父本的新鲜花粉刷到母本雌蕊上，套袋，标记。
42.在本技术的一些实施例中，上述自交步骤具体为：在小麦出穗后对其进行套袋并标记。
43.在本技术的一些实施例中，上述小麦的dna检测方法具体为：
44.将长度为5-8cm的植株叶片放入离心管，置于液氮中进行离心打样，然后加入加热
后的ctab溶液，进行水浴；
45.水浴结束后加入氯仿，乳化后采用低温离心机进行离心；离心后取上清液加入氯仿二次乳化和二次离心；
46.取二次离心后的上清液，加入冰冻的异丙醇，混匀后出现絮状物，依次采用75％乙醇和无水乙醇清洗絮状物，挥发后进行dna的pcr扩增；采用扩增后的dna进行检测。
47.在本技术的一些实施例中，上述水浴前加入ctab的量为800μl，水浴的温度为55-60℃，水浴时间为38-45min，每次加入氯仿的量为800μl，离心的转速为10000-12000rpm，离心时间为8-12min，加入冰冻异丙醇的量为500μl。
48.在本技术的一些实施例中，上述pcr扩增的体系为10μl，具体包括10
×
buffer，25μmol/l dntps 1μl，0.5μmol/l前引物和后引物，1u taq酶，10pmoldutp 1μl，5ng dna，ddh2o补齐至10μl。
49.在本技术的一些实施例中，上述pcr扩增的程序为：94℃预变性4min，然后经过94℃变性30s、59℃退火30s、72℃延伸2min20s共35个循环，再在72℃终延伸10min，最后4℃保存。
50.以下结合实施例对本技术的特征和性能作进一步的详细描述。
51.实施例1
52.一种含有赤霉病抗性基因的改良小麦的培育方法，包括以下步骤：
53.1、待改良小麦植株(绵麦902)作为改良母本，与含有抗赤霉病基因的抗病亲本做父本进行种植并杂交，获得f1杂交种，获得f1杂交种：
54.将泥炭土与大田红土按照3：1的质量比进行混合并装入35cm的圆盆中，浇透水，静置30min，选取籽粒饱满、无虫咬、无病害的待改良小麦植株与含有抗赤霉病基因的抗病亲本播种到盆中，播种深度为1cm，覆土，用透明塑料膜遮盖，如图1所示，出苗后如图2所示，苗期如图3所示，苗期每天每盆浇500ml水，拔节、灌浆期每天每盆浇1000ml水，全生育期温度设置为光照16h，黑暗8h。温度设置为光照时26℃，黑暗时温度18℃，在小麦播后至成熟期间，每天观察小麦生长情况，如发现有病虫害，根据病虫害害种类，选取专用药进行喷洒防治；在小麦开花期，选取母本已抽穗但雄蕊未成熟的穗子，去雄，套袋；待2天后，雌蕊完全成熟(完全散开)后，收集父本新鲜花粉到玻璃纸上，用毛刷将花粉轻轻刷到母本雌蕊上，套袋，标记，如图4所示，成熟期如图5所示，成熟后得到f1杂交种41粒，结实如图6所示；
55.2、f1杂交种与待改良小麦植株进行种植并回交，获得bc1杂交种：
56.将杂交种和待改良小麦植株继续分开种植，种植条件同上，在小麦开花期，选取母本(f1杂交种)已抽穗但雄蕊未成熟的穗子，去雄，套袋；待2天后，雌蕊完全成熟(完全散开)后，收集父本(待改良小麦植株)新鲜花粉到玻璃纸上，用毛刷将花粉轻轻刷到母本雌蕊上，套袋，标记，成熟后得到bc1代杂交种50粒。
57.3、bc1杂交种与待改良小麦植株进行种植，利用上述抗赤霉病基因对应的分子标记检测bc1植株的dna，筛选阳性后代与待改良小麦植株回交，获得bc2杂交种：
58.将bc1杂交种与待改良小麦植株分别进行种植，种植方法同上，出苗后，分单株采集每个bc1杂交种的叶片(3-5cm)，分别利用上述抗赤霉病基因对应的分子标记检测：1.5ml离心管中放3个大钢珠，再放入叶片，置于液氮中，然后上机打样，然后往离心管中加入经加热后的ctab溶液800ul，置于58℃的水浴锅，水浴40min，水浴结束后，加入800ul氯仿，轻柔
的上下颠倒至乳化状后，静置3min，置于低温离心机中，10000rpm、离心10min；吸出上清液至对应的空的离心管中，加入800ul氯仿，轻柔的上下颠倒至乳化状后，静止3min，置于低温离心机中，10000rpm、离心10min；吸出上清液至对应的空的离心管中，加入500ul冰冻的异丙醇，立即轻柔的上下颠倒混匀至有白色絮状出现；将异丙醇倒掉，用75％的乙醇清洗两遍，无水乙醇清洗两遍，放至无酒精味后，进行dna扩增，pcr扩增体系为10μl，包括：10
×
buffer，25μmol/l dntps 1μl，0.5μmol/l前引物和后引物，1u taq酶，10pmoldutp 1μl，5ng dna，ddh2o补齐至10μl。引物如表1所示。然后进行dna电泳检测(1％的琼脂糖凝胶电泳)和dna光度法检测(nd-1000微量紫外分光光度计)。测得阳性植株22株。
59.表1
[0060][0061]
将阳性植株(母本)与待改良小麦(父本)进行回交，回交方法同上，获得bc2杂交种43粒。
[0062]
4、bc2杂交种与待改良小麦植株进行种植，分子标记检测bc2植株的dna，筛选阳性后代(母本)与待改良小麦植株(父本)回交，获得bc3杂交种：其种植方法、分子标记检测方法和回交方法均同上，测得阳性植株19株，最终获得bc3杂交种43粒。
[0063]
5、bc3杂交种与待改良小麦植株进行种植，分子标记检测bc3植株的dna，筛选阳性后代(母本)与待改良小麦植株(父本)回交，获得bc4杂交种：其种植方法、分子标记检测方法和回交方法均同上，测得阳性植株17株，最终获得bc4杂交种38粒。
[0064]
6、将bc4杂交种进行种植，分子标记检测bc4植株的dna，筛选阳性后代进行自交，自交方法为：在小麦出穗后，套袋，标记。得到自交后代种子352粒。
[0065]
本实施例抗赤霉病基因kasp分子标记检测结果如图7所示，图7中黄色为阳性植株，红色为隐形植株；
[0066]
本实施例小麦改良材料阳性植株赤霉病抗性基因分子标记的琼脂糖电泳检测验证如图8所示，图8中fhb1标记的目标带为1200bp，fhb1sts标记的目标带为800bp。
[0067]
实施例2
[0068]
本实施例采用另外一个小麦品种(绵麦903)进行抗赤霉病改良。
[0069]
一种含有赤霉病抗性基因的改良小麦的培育方法，包括以下步骤：
[0070]
1、待改良小麦植株与赤霉病高抗资源杂交，获得f1杂交种：
[0071]
将泥炭土与大田红土按照3：1的质量比进行混合并装入35cm的圆盆中，浇透水，静置40min，选取籽粒饱满、无虫咬、无病害的待改良小麦植株与含有抗赤霉病基因的抗病亲本播种到盆中，播种深度为1.2cm，覆土，用透明塑料膜遮盖，苗期每天每盆浇550ml水，拔节、灌浆期每天每盆浇1200ml水，全生育期温度设置为光照16h，黑暗8h。温度设置为光照时28℃，黑暗时温度16℃，在小麦播后至成熟期间，每天观察小麦生长情况，如发现有病虫害，
根据病虫害害种类，选取专用药进行喷洒防治；在小麦开花期，选取母本已抽穗但雄蕊未成熟的穗子，去雄，套袋；待2天后，雌蕊完全成熟(完全散开)后，收集父本新鲜花粉到玻璃纸上，用毛刷将花粉轻轻刷到母本雌蕊上，套袋，标记，成熟后得到f1杂交种39粒，；
[0072]
2、f1杂交种与待改良小麦植株进行种植并回交，获得bc1杂交种：
[0073]
将杂交种和待改良小麦植株继续分开种植，种植条件同上，在小麦开花期，选取母本(f1杂交种)已抽穗但雄蕊未成熟的穗子，去雄，套袋；待2天后，雌蕊完全成熟(完全散开)后，收集父本(待改良小麦植株)新鲜花粉到玻璃纸上，用毛刷将花粉轻轻刷到母本雌蕊上，套袋，标记，成熟后得到bc1代杂交种44粒。
[0074]
3、bc1杂交种与待改良小麦植株进行种植，利用上述抗赤霉病基因对应的分子标记检测bc1植株的dna，筛选阳性后代与待改良小麦植株回交，获得bc2杂交种：
[0075]
将bc1杂交种与待改良小麦植株分别进行种植，种植方法同上，出苗后，分单株采集每个bc1杂交种的叶片(3-5cm)，分别利用上述抗赤霉病基因对应的分子标记检测：1.5ml离心管中放3个大钢珠，再放入叶片，置于液氮中，然后上机打样，然后往离心管中加入经加热后的ctab溶液800ul，置于58℃的水浴锅，水浴40min，水浴结束后，加入800ul氯仿，轻柔的上下颠倒至乳化状后，静置3min，置于低温离心机中，12000rpm、离心10min；吸出上清液至对应的空的离心管中，加入800ul氯仿，轻柔的上下颠倒至乳化状后，静止3min，置于低温离心机中，11000rpm、离心10min；吸出上清液至对应的空的离心管中，加入500ul冰冻的异丙醇，立即轻柔的上下颠倒混匀至有白色絮状出现；将异丙醇倒掉，用75％的乙醇清洗两遍，无水乙醇清洗两遍，放至无酒精味后，进行dna扩增，pcr扩增体系为10μl，包括：10
×
buffer，25μmol/l dntps 1μl，0.5μmol/l前引物和后引物，1u taq酶，10pmoldutp 1μl，5ng dna，ddh2o补齐至10μl。引物如表1所示。然后进行dna电泳检测(1％的琼脂糖凝胶电泳)和dna光度法检测(nd-1000微量紫外分光光度计)。测得阳性植株20株。
[0076]
将阳性植株(母本)与待改良小麦(父本)进行回交，回交方法同上，获得bc2杂交种52粒。
[0077]
4、bc2杂交种与待改良小麦植株进行种植，分子标记检测bc2植株的dna，筛选阳性后代(母本)与待改良小麦植株(父本)回交，获得bc3杂交种：其种植方法、分子标记检测方法和回交方法均同上，测得阳性植株28株，最终获得bc3杂交种52粒。
[0078]
5、bc3杂交种与待改良小麦植株进行种植，分子标记检测bc3植株的dna，筛选阳性后代(母本)与待改良小麦植株(父本)回交，获得bc4杂交种：其种植方法、分子标记检测方法和回交方法均同上，测得阳性植株17株，最终获得bc4杂交种45粒。
[0079]
6、将bc4杂交种进行种植，分子标记检测bc4植株的dna，筛选阳性后代进行自交，自交方法为：在小麦出穗后，套袋，标记。得到自交后代种子498粒。
[0080]
实施例3
[0081]
本实施例采用另外一个小麦品种(绵麦367)进行抗赤霉病改良。
[0082]
将待改良小麦植株(母本)与含有抗赤霉病基因的抗病亲本(父本)进行种植并杂交，获得f1杂交种，35粒；
[0083]
将f1杂交种(母本)与待改良小麦植株(父本)进行种植并回交，获得bc1杂交种，60粒；
[0084]
将bc1杂交种(母本)与待改良小麦植株(父本)进行种植，利用抗赤霉病基因对应
的分子标记检测bc1植株的dna，筛选阳性后代(35株)与待改良小麦植株回交，获得bc2杂交种，40粒；
[0085]
将bc2杂交种(母本)与待改良小麦植株(父本)进行种植，利用抗赤霉病基因对应的分子标记检测bc2植株的dna，筛选阳性后代(18株)与待改良小麦植株回交，获得bc3杂交种，40粒；
[0086]
将bc3杂交种(母本)与待改良小麦植株(父本)进行种植，利用抗赤霉病基因对应的分子标记检测bc3植株的dna，筛选阳性后代(21株)与待改良小麦植株回交，获得bc4杂交种，46粒；
[0087]
将所述bc4杂交种进行种植，利用抗赤霉病基因对应的分子标记检测bc4植株的dna，筛选阳性后代进行自交，得到自交后代415粒。
[0088]
以上所描述的实施例是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。本技术的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本技术的范围，而是仅仅表示本技术的选定实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。