一种能冻干保存的人ABO血型反定型红细胞及保存方法与流程

一种能冻干保存的人abo血型反定型红细胞及保存方法
技术领域
1.本发明属于人abo血型检测领域，具体涉及一种能冻干保存的人abo血型反定型红细胞及保存方法。


背景技术：

2.血型鉴定是临床输血前的首要工作，因为不同血型的血液相互输血时会因为抗原和抗体的凝聚作用而发生溶血现象，进而可能危及人的生命安全，因此正确的血型鉴定是保证输血安全的前提条件。目前血型鉴定的方法包括正定型法和反定型法。正定型法检测红细胞抗原，反定型法检测血清中的抗体，其中以人a、b、o血型抗原/抗体检测最为重要。根据人体血液中红细胞膜表面抗原的不同可分为不同的血型。a型血的红细胞上带有血型抗原a（以下简称“a抗原”），血清中有血型抗体b（以下简称“b抗体”）；b型血的红细胞上带有血型抗原b（以下简称“b抗原”），血清中有血型抗体a（以下简称“a抗体”），ab型血的红细胞上既有a抗原也有b抗原，血清中没有a抗体和b抗体；o型血的红细胞上a抗原和b抗原都没有，血清中同时存在a抗体和b抗体。
3.血型反定型检测常规的方法是用已知血型的红细胞试剂来检测未知样本中的红细胞抗体。但新鲜制备的红细胞不易保存，且红细胞膜表面上抗原的抗原性随着时间的延长而逐渐降低，目前新鲜的人abo血型红细胞在4℃条件下最多能保存3个月，因此大大增加了血型检测的成本。虽然有不少的研究机构公开了利用冻干的方法来延长红细胞的保存时间，但完整的人abo血型红细胞冻干以后很容易发生溶血，想要做到既不溶血又不影响使用很难。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能长期保存人abo血型红细胞的方法，以及应用。具体方案如下。
5.一种长期保存人abo血型红细胞的方法，包括以下步骤：步骤1）红细胞洗涤：使用生理盐水洗涤压积红细胞，然后低速离心，弃去上清液获得洗涤后的红细胞；步骤2）红细胞固定：将步骤1）洗涤好的红细胞按照体积比1:20的比例加入固定液中混匀，然后低速离心，弃去上清液然后加入20倍体积的生理盐水继续低速离心，重复两次，所述固定液由0.01-0.03 %wt 戊二醛、0.4-0.8 g/l 磷酸二氢钠、0.2-0.6 g/l 氯化钾、4-8 g/l 氯化钠、2-6 g/l葡萄糖和2-6 g/l 碳酸氢钠组成；步骤3）冻干前处理：将步骤2）固定好的红细胞按照体积比1:20的比例加入冻干保存液中混匀，然后低速离心，弃去上清液然后加入20倍体积的生理盐水继续低速离心，重复两次，弃去上清液后再按照体积比1:20的比例加入冻干保存液并混匀，所述冻干保存液由0.4-0.8 g/l 磷酸二氢钠、0.2-0.6 g/l 氯化钾、4-8 g/l 氯化钠、8-12 g/l 海藻糖和3-7 g/l 牛血清白蛋白组成；
步骤4）红细胞冻干：将步骤3）处理好的红细胞进行冻干，然后置于2-8℃下保存。
6.进一步，所述固定液由0.03 %wt 戊二醛、0.68 g/l 磷酸二氢钠、0.4 g/l 氯化钾、6 g/l 氯化钠、2 g/l葡萄糖和2 g/l 碳酸氢钠组成。
7.上述固定液中的戊二醛用于固定血红蛋白以及红细胞膜上的蛋白。固定红细胞的目的在于使红细胞冻干后不发生溶血。而在现有技术中，戊二醛更多是用于细胞形态的观察。如果红细胞冻干前不进行固定或固定不充分，那么红细胞会出现一定程度的溶血；但如果红细胞冻干前固定过于充分（例如固定液浓度过高或者固定的时间过长），则会影响红细胞膜上抗原的灵敏度，甚至导致抗原失活。
8.进一步，所述冻干保存液由0.68 g/l 磷酸二氢钠、0.4 g/l 氯化钾、6 g/l 氯化钠、10 g/l 海藻糖和5 g/l 牛血清白蛋白组成。
9.上述冻干保存液中的海藻糖和牛血清白蛋白主要用于保护红细胞表面的抗原，使其不容易脱落，因此可以使红细胞冻干后表面的抗原灵敏度不变。
10.进一步，所述步骤1）中使用生理盐水洗涤压积红细胞的体积比为10:1。
11.进一步，所述步骤1）中低速离心操作为600-800g离心3-6min，重复3次。
12.进一步，所述步骤2）和步骤3）中低速离心操作为600-800g离心3-6min。
13.上述多次离心洗涤，其作用是洗去血浆、固定液等残留成分，以免对红细胞冻干过程造成干扰。
14.进一步，所述步骤4）的冻干操作包括：1）冷冻：4℃、2h，-20℃、2h，-40℃、2h；2）升华干燥：设置真空度为5，干燥12h；3）解析干燥：设置真空度为10，干燥12h。
15.在上述冻干操作的冷冻步骤中，采用程序降温的方法，即通过设置4℃冷冻2h、-20℃冷冻2h、-40℃冷冻2h的梯度式降温方法，有别于传统冻干采用每分钟降温多少度的方式，直接降到预定温度，然后保持。实际上冻干过程对细胞伤害很大，如果冻干操作不当，则冻干细胞在复溶的瞬间就会发生溶血。本发明研究团队经过长期的摸索发现，采取本发明的程序降温方法，可以做到尽量少的溶血发生。
16.由上述方法制备得到的冻干人abo血型红细胞。
17.上述冻干人abo血型红细胞在血型反定型检测中的应用。
18.进一步，所述冻干人abo血型红细胞可直接用于检测血清中的抗体。
19.具体地，将上述冻干人abo血型红细胞用与冻干前冻干液等体积的纯化水复溶，无需洗涤，然后直接用于人abo血型反定型检测，检测未知血清中的抗体。
20.有益技术效果。
21.1.本发明创新的使用了将红细胞先固定再冻干的方法，冻干后的红细胞不容易发生溶血，且红细胞膜上的抗原灵敏度与新鲜制备的红细胞相当。此外，用该方法制得的红细胞性能上与市售反定型红细胞一致。
22.2.本发明在红细胞冻干的操作中，使用了程序降温的操作，可以有效的保护红细胞的活性，使后续冻干得到的红细胞不容易发生溶血。
23.3.采用本发明先固定再冻干方法制备得到的完整人abo血型红细胞，在2-8℃下可以保存至少一年的时间。
24.4.采用本发明方法制备得到的完整冻干人abo血型红细胞，可直接用于血型反定型检测，使用之前无需进行洗涤。一般的冻干红细胞在使用前需要进行洗涤，一是消除冻干
液的影响，二是洗去红细胞碎片及血红蛋白，而本发明方法制得的冻干红细胞由于形态完整，没有发生溶血，因此没有额外的红细胞碎片和游离出来的血红蛋白。此外本发明提供的冻干保护液不会对检测产生不良影响，因此本发明的冻干红细胞可以直接用于血型反定型检测。
具体实施方式
25.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
27.如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5%，更典型的是所述值的+/-4%，更典型的是所述值的+/-3 %，更典型的是所述值的+/-2 %，甚至更典型的是所述值的+/-1 %，甚至更典型的是所述值的+/-0.5%。
28.在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1
〜
6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
29.实施例一本实施例提供一种具体的长期保存人abo血型红细胞的方法。
30.步骤1）.红细胞洗涤：使用生理盐水洗涤压积红细胞，其体积比为生理盐水：红细胞=10:1，然后放入低速离心机600-800g离心3-6min，重复3次，弃去上清液获得洗涤后的红细胞；所述离心操作包括610g离心6min、716g离心5min或795g离心3min。
31.步骤2）.红细胞固定：使用固定液固定所述红细胞，将步骤1）中洗涤好的红细胞按照体积比1:20（红细胞：固定液=1:20）的比例加入固定液中混匀1min，然后然后放入低速离心机600-800g离心3-6min，弃去上清液然后加入20倍体积的生理盐水继续600-800g离心3-6min，重复两次，所述固定液由0.03 %wt 戊二醛、0.68 g/l 磷酸二氢钠、0.4 g/l 氯化钾、6 g/l 氯化钠、2 g/l葡萄糖和2 g/l 碳酸氢钠组成；所述离心操作包括610g离心6min、716g离心5min或795g离心3min。
32.步骤3）.冻干前处理：将250μl红细胞压积加入到5ml红细胞冻干液中混匀1min，然后600-800g离心3-6min，弃去上清液然后加入5ml的生理盐水继续600-800g离心3-6min，重复两次，弃去上清液后再加入5ml的冻干保存液混匀，所述冻干保存液由0.68 g/l 磷酸二氢钠、0.4 g/l 氯化钾、6 g/l 氯化钠、10 g/l 海藻糖和5 g/l 牛血清白蛋白组成；所述离
心操作包括610g离心6min、716g离心5min或795g离心3min。
33.步骤4）.红细胞冻干：将步骤3）处理好的红细胞：1）冷冻：4℃、2h，-20℃、2h，40℃、2h；2）升华干燥：设置真空度为5，干燥12h；3）解析干燥：设置真空度为10，干燥12h。
34.最后将冻干得到的人abo血型红细胞置于2-8℃下保存。
35.实施例二冻干红细胞溶血性检测一、检测原理红细胞主要由红细胞膜和大量的血红蛋白组成，当红细胞膜破裂时，膜表面抗原被破坏，血红蛋白释放出来，发生溶血现象。所以不同保存期的红细胞悬液中游离血红蛋白浓度可以作为红细胞体外保存效果（即是否发生溶血）的质量指标之一。
36.二、检测方法1）用30ml冰乙酸溶解邻甲联苯胺0.1g，加蒸馏水至50ml，配制为0.2%的邻甲联苯胺溶液，2-8℃保存；吸取3.67ml 3%的过氧化氢，加蒸馏水至100ml，配制为0.1%的过氧化氢溶液，每次实验都新鲜配制；吸取冰乙酸溶液50ml，加蒸馏水至500ml，配制为10%的冰乙酸溶液；称取0.01g牛血红蛋白溶于1ml生理盐水中，配制为10mg/ml的血红蛋白储备液，用时稀释为100mg/l的血红蛋白标准液。向测定管内加入待测上清液20μl，空白管加入双蒸水20μl，标准管加入100mg/l的血红蛋白标准液20μl。再向上述各管中加入0.2%邻甲联苯胺溶液1ml，然后加入0.1%过氧化氢溶液1ml，混匀放置10min后，各管加入10%冰乙酸溶液10ml，混匀放置10min后，于紫外可见分光光度计测定吸光度。测定时以空白管调零，检测波长为435nm。通过下式测定游离血红蛋白浓度：游离血红蛋白浓度(mg/l)= 测定管吸光度/标准管吸光度
ꢀ×ꢀ
100(mg/l)。
37.2）向检测管内加入20μl用本发明实施例一方法保存的冻干红细胞（本发明的冻干红细胞用纯化水复溶后取20μl，浓度与市售红细胞一致），对照管加入20μl市售反定型红细胞。检测结果如下表。市售的红细胞0天的数据测不到，因为很难获得当天生产的市售红细胞，所以下表中0天数据缺失。
38.表1 a型红细胞悬液的游离血红蛋白浓度变化(mg/l)表2 b型红细胞悬液的游离血红蛋白浓度变化(mg/l)备注：本发明的冻干红细胞与市售红细胞均于2-8℃下保存。
39.实验结果：按照国家标准gb18469-2012 《全血及成分血质量要求》，洗涤红细胞储存末期溶血率应小于红细胞总量的0.8%，即游离血红蛋白浓度小于880mg/l。
40.随着保存时间的延长，冻干红细胞2-8℃保存420天，各红细胞悬液的游离血红蛋
白浓度基本上没有变化；市售细胞从90天以后游离的血红蛋白迅速增多，提示溶血增加，达不到国家的gb标准。然而实验到了240天以后，由于细菌对血红蛋白的分解，反而出现了游离血红蛋白浓度反而下降的现象。
41.红细胞冻干后随着保存时间延长,细胞回收率呈下降趋势,不同保存时间段溶血率无统计学差异(p》0.05)。
42.实施例三冻干红细胞抗原效价检测测定效价的方法采用试管法，参考《临床输血检测操作规程》。测定用本发明实施例一制得的冻干红细胞的抗原效价，并与市售abo反定型试剂盒（人血红细胞）中的a型和b型作对比。
43.检测方法：从冰箱中拿出a型或b型冻干红细胞，用适量纯化水进行复溶，复溶后的红细胞转移到适当规格的离心管中，低速离心机3000r离心5min,取压积红细胞用生理盐水制成2%红细胞悬液，备用。市售红细胞也采用相同的方法制成2%红细胞悬液，备用。取12支试管，依次标记为：1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048、1:4096，然后每支试管中加入100μl氯化钠注射液，在第1支试管中加入抗a或抗b血型定型试剂100μl，混匀，移100μl至第2管，以此类推到第12管，最后弃去100μl，这样从第1管到第12管的抗a或抗b血型定型试剂的稀释度分别为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048、1:4096。然后向每个稀释度对应的试管中加入100μl之前准备好的对应血型的2%的红细胞悬液，混匀，室温孵育15min， 3000r离心10s，以出现肉眼观察呈1+凝集强度的稀释度的倒数为该抗原的效价（如32，而不是1/32或1:32）。如果稀释度最高的试管中仍有凝集，说明还未到反应终点，继续稀释并检测。
44.表3 凝集强度判读标准按照上述测定方案，测定用实施例一方法制得的冻干红细胞用纯化水复溶以后，与市售红细胞悬液的抗原效价对比。市售的红细胞0天的数据测不到，因为很难获得当天生产的市售红细胞，所以下表中0天数据缺失。
45.表4 a型红细胞悬液抗原效价
表5 b型红细胞悬液抗原效价实验结果：用本发明实施例一的方法制备的a型红细胞，其抗原效价在2-8℃下保存390天检测无变化，第420天检测到有下降。而市售的a型红细胞试剂抗原效价在2-8℃下保存仅能维持90天，从第120天检测到开始逐步下降。类似的结果在b型红细胞实验上也可以得到。
46.实施例四对比试验例1根据实施例二和实施例三冻干红细胞溶血性检测/抗原效价检测的原理和方法，用下列表格中不同试验组的固定液和冻干保护液对人a、b型红细胞进行固定和保护，然后按照实施例一的方法进行冻干，进行溶血性和抗原效价检测。
47.对比试验例2根据实施例二和实施例三冻干红细胞溶血性检测/抗原效价检测的原理和方法，用对比试验例1中2# 组的固定液和冻干保护液对人a、b型红细胞进行固定和保护，用下列
表格中不同的冻干方法进行冻干，进行溶血性检测。
48.实验结果表6 a型红细胞悬液的游离血红蛋白浓度变化(mg/l)表7 b型红细胞悬液的游离血红蛋白浓度变化(mg/l)从表6和表7的结果来看，1#组、2#组、3#组以及1-2#组的溶血率符合国标gb18469-2012的要求。而1-3#组和1-4#组使用传统的冻干方法，细胞溶血较严重，超出国标要求，没有达到保护效果。由此说明红细胞冻干前的固定环节以及冻干工艺是红细胞冻干后不容易发生溶血的关键环节。
49.表8 a型红细胞悬液抗原效价
表9 b型红细胞悬液抗原效价从表8和表9的结果来看，1#组、2#组、3#组以及1-1#组制得的冻干红细胞的表面a抗原、b抗原的抗原效价在2-8℃下至少能保存一年。因此可以证明红细胞冻干保存液以及冻干工艺是维持红细胞表面抗原灵敏度不变的关键环节。但1-2#的抗原效价从0天检测开始就显著低于其他对比组，这说明固定过于充分会影响红细胞膜上抗原的灵敏度；1-1#虽然经过有效的冻干工艺保护维持了较好的抗原灵敏度，但由于未经过固定，因此溶血严重。因此，想要做到冻干的人红细胞既不溶血又能维持表面抗原的灵敏度并不简单。
50.综合表6、表7、表8、表9的结果来看，1#组~3#组制得的冻干红细胞2-8℃下至少能保存1年。
51.上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。