一种新型斑马鱼T型迷宫、构建方法及应用

一种新型斑马鱼t型迷宫、构建方法及应用
技术领域
1.本发明属于动物模型技术领域，具体涉及一种新型斑马鱼t型迷宫、构建方法及应用。


背景技术：

2.啮齿类动物是神经科学研究中最受欢迎的动物模型，可以通过在实验室条件下进行的简化方法来代表复杂的神经疾病，如抑郁、焦虑和痴呆等。几种行为评估工具，如t迷宫、morris水迷宫、开放场和穿梭箱已经被开发用于空间记忆、运动和焦虑测试。然而，由于3rs(替代、减少和细化)和动物福利的要求，减少哺乳动物的牺牲，近年来更多的低等脊椎动物和无脊椎动物模型被引入行为研究界。例如，在行为神经科学研究中，利用果蝇和鱼类来研究大脑机制的研究近年来激增。鱼类的运动、视觉辨别、食物搜寻、社会和浅滩行为因其反映脊椎动物行为的性质而受到广泛关注。
3.斑马鱼，作为现代生命科学、健康科学和环境科学等研究领域的重要模式动物，这种原产于喜马拉雅山南麓的印度、巴基斯坦、孟加拉和尼泊尔等南亚国家的热带淡水鱼，已经在疾病模型、药物研发、保健与功能食品评价、基因编辑、化妆品评价与注册备案等多个领域展现出它巨大的应用潜力，被视为“水中小白鼠”。其所具备的高生产力、身体透明、胚胎发育迅速等优点，是遗传和生物医学研究的一种实用的模型生物。在过去的几十年里，斑马鱼被广泛应用于发育生物学、毒理学、药理学和神经行为实验等领域的研究。
4.t迷宫是一种用于评估啮齿动物和鱼类空间学习和记忆的仪器。t迷宫还被应用于评价化学污染的影响或药物对动物模型行为的药理作用。在现有的斑马鱼t迷宫训练中，多数实验方法是基于食物奖励或厌恶刺激进行的。然而，普通的食物奖励训练通常需持续8到10天，漫长的训练周期成为斑马鱼进行空间学习记忆测试的挑战之一；厌恶刺激则多使用惊吓、电击等伤害或惩罚斑马鱼的方法，不符合科研动物福利的要求。
5.在癫痫共病认知障碍疾病中，常规的t迷宫训练得到的斑马鱼动物模型并不能有效筛选出具有癫痫共病认知障碍疾病的动物，不利于进一步研究癫痫共病认知障碍疾病。


技术实现要素：

6.本发明为了解决上述技术问题提供一种新型斑马鱼t型迷宫。
7.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种新型斑马鱼t型迷宫，第一迷宫臂、第二迷宫臂和第三迷宫臂，所述第一迷宫臂、所述第二迷宫臂和所述第三迷宫臂通过t迷宫连接件连接形成t型迷宫，所述第一迷宫臂远离所述t迷宫连接件一端设置有迷宫入口，所述第二迷宫臂远离所述t迷宫连接件一端外固体套设有红色生态模拟区，所述第三迷宫臂远离所述t迷宫连接件一端外固体套设有绿色生态模拟区。
8.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
9.进一步，所述第一迷宫臂、所述第二迷宫臂和所述第三迷宫臂内沿长度方向上均间隔设置有用于放置隔板的卡槽。
10.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
11.进一步，所述第一迷宫臂的长x宽x高为28x7x10cm，所述第二迷宫臂和所述第三迷宫臂的长x宽x高为14x7x10cm，所述t迷宫连接件的长x宽x高为7x7x10cm。
12.本发明的目的之二，是提供一种癫痫共病认知障碍疾病筛选斑马鱼动物模型的构建方法。
13.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
14.s1、准备阶段：
15.第一天，将10-30只健康成年且分别标记的斑马鱼单独放置在t型迷宫中，不喂食，自由探索1h，探索结束后放置在对应的鱼缸休息；
16.s2、训练阶段：
17.第二天，将s1中的探索后的10-30只斑马鱼单独放入预先插好隔板的第一迷宫臂(1)最远端内第三迷宫臂(3)内适应0-1min，打开隔板，当斑马鱼进入第二迷宫臂2内的目标区域，立即给予食物奖励；当斑马鱼超过4-6min未进入第二迷宫臂2内的目标区域，则引导其进入后给予食物奖励，训练结束后放回在对应的鱼缸休息；
18.s3、重复训练阶段：
19.将步骤s2训练结束的48只斑马鱼重复步骤s2训练阶段1-3次，得到所需斑马鱼。
20.本发明的目的之三，癫痫共病认知障碍疾病筛选斑马鱼动物模型的构建方法在癫痫共病认知障碍疾病的应用。
21.有益效果：癫痫共病认知障碍疾病筛选斑马鱼动物模型的构建方法在癫痫共病认知障碍疾病的应用。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1是本发明t型迷宫的结构示意图。
24.附图中，各标号所代表的部件列表如下：
25.1、第一迷宫臂；2、第二迷宫臂；3、第三迷宫臂；4、红色生态模拟区；5、绿色生态模拟区；6、t迷宫连接件；7、卡槽。
具体实施方式
26.以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
27.一种新型斑马鱼t型迷宫，包括第一迷宫臂1、第二迷宫臂2和第三迷宫臂3，所述第一迷宫臂1、所述第二迷宫臂2和所述第三迷宫臂3通过t迷宫连接件6连接形成t型迷宫，t型迷宫的材质为透明的有机玻璃，所述第一迷宫臂1远离所述t迷宫连接件6一端设置有迷宫入口，所述第二迷宫臂2远离所述t迷宫连接件6一端外固体套设有红色生态模拟区4，红色生态模拟区4具体为在有机玻璃的盒体，盒体内设置红色人工绿植高10cm，使用白色砂石覆
盖，覆盖高度为3cm，所述第三迷宫臂3远离所述t迷宫连接件6一端外固体套设有绿色生态模拟区5，绿色生态模拟区5具体为有机玻璃的盒体，盒体内设置绿色人工绿植高10cm，底部使用白色砂石覆盖，覆盖高度为3cm。
28.优选的，所述第一迷宫臂1、所述第二迷宫臂2和所述第三迷宫臂3内沿长度方向上均间隔设置有用于放置隔板的卡槽7，每个卡槽7等距离设置，相隔7cm，可放置透明的可拆卸隔板与迷宫的其余部分隔开。
29.优选的，所述第一迷宫臂1的长x宽x高为28x7x10cm，所述第二迷宫臂2和所述第三迷宫臂3的长x宽x高为14x7x10cm。所述t迷宫连接件6的长x宽x高为7x7x10cm。
30.实施例1
31.本实施例提供一种癫痫共病认知障碍疾病筛选斑马鱼动物模型的构建方法，包括以下步骤：
32.s1、准备阶段：
33.第一天，将10只健康成年且分别标记的斑马鱼单独放置在t型迷宫中，不喂食，自由探索1h，探索结束后放置在对应的鱼缸休息；
34.s2、训练阶段：
35.第二天，将s1中的探索后的10只斑马鱼放入预先插好隔板的所述第一迷宫臂1最远端内第三迷宫臂3内适应15s，打开隔板，当斑马鱼进入第二迷宫臂2内的目标区域，立即给予新鲜丰年虾10ul；当斑马鱼超过4min未进入第二迷宫臂2内的目标区域，则引导其进入后给予新鲜丰年虾10ul，训练结束后放回在对应的鱼缸休息；
36.s3、重复训练阶段：
37.将步骤s2训练结束的10只斑马鱼重复步骤s2训练阶段1次，得到所需斑马鱼。
38.实施例2
39.s1、准备阶段：
40.第一天，将20只健康成年且分别标记的斑马鱼单独放置在t型迷宫中，不喂食，自由探索1h，探索结束后放置在对应的鱼缸休息；
41.s2、训练阶段：
42.第二天，将s1中的探索后的20只斑马鱼放入预先插好隔板的所述第一迷宫臂1最远端内第三迷宫臂3内适应30s，打开隔板，当斑马鱼进入第二迷宫臂2内的目标区域，立即给予新鲜丰年虾15ul；当斑马鱼超过5min未进入第二迷宫臂2内的目标区域，则引导其进入后给予新鲜丰年虾15ul，训练结束后放回在对应的鱼缸休息；
43.s3、重复训练阶段：
44.将步骤s2训练结束的20只斑马鱼重复步骤s2训练阶段2次，得到所需斑马鱼。
45.实施例3
46.s1、准备阶段：
47.第一天，将30只健康成年且分别标记的斑马鱼单独放置在t型迷宫中，不喂食，自由探索1h，探索结束后放置在对应的鱼缸休息；
48.s2、训练阶段：
49.第二天，将s1中的探索后的30只斑马鱼放入预先插好隔板的所述第一迷宫臂1最远端内第三迷宫臂3内适应60s，打开隔板，当斑马鱼进入第二迷宫臂2内的目标区域，立即
给予新鲜丰年虾20ul；当斑马鱼超过6min未进入第二迷宫臂2内的目标区域，则引导其进入后给予新鲜丰年虾20ul，训练结束后放回在对应的鱼缸休息；
50.s3、重复训练阶段：
51.将步骤s2训练结束的30只斑马鱼重复步骤s2训练阶段3次，得到所需斑马鱼。
52.实施例1-3训练数据如表1所示：
[0053][0054]
对照例
[0055]
实验对象：ab品系野生型斑马鱼48只，6月龄，体长约2.5-3.5cm，雌雄比例为1：1。随机抽样分组为改良t迷宫组和传统t迷宫组，每组24只。研究方案为传统t迷宫组使用传统t迷宫对斑马鱼进行训练及正式实验；改良t迷宫组使用“一种新型斑马鱼t型迷宫”对斑马鱼进行训练及实验。所有斑马鱼经训练后使用诺达思斑马鱼行为轨迹分析系统(noldus daniovision system)分析斑马鱼到达ec区潜伏期(即：斑马鱼从进入t迷宫到第1次成功找到并停留在ec区≥20s的时间定义为ec区潜伏期)和斑马鱼总ec区停留时间(斑马鱼从进入t迷宫后所有进入ec区的时间总和定义为斑马鱼总ec区停留时间)。试验结果如表2所示：
[0056]
表2改良组与传统组斑马鱼训练成功率及到达目标区域时间比较
[0057][0058]
从表2得知，改良组与传统组相比，在传统t迷宫基础上进行的改良新型斑马鱼t型迷宫，具有明显改善斑马鱼联想学习记忆成功率、缩短其到达指定目标区域的时间(ec区潜伏期)及增加其对目标区域的学习兴趣时间(总ec区停留时间)。
[0059]
癫痫共病认知障碍疾病筛选斑马鱼动物模型的构建方法在癫痫共病认知障碍疾病的应用。
[0060]
癫痫共病认知障碍斑马鱼模型的建立
[0061]
1、随机抽取改良组、传统组训练成功的16只健康ab品系野生型斑马鱼，诱导癫痫发作并筛选癫痫共病认知障碍的斑马鱼。为诱导斑马鱼癫痫发作，每组16只动物分别单独暴露于戊四氮水溶液诱发癫痫状态，戊四氮水溶液浓度为10mm，容量为2l。暴露时间为30分钟，休息时间为60分钟，反复暴露3次。浓度和暴露时间均基于已知试验基础[1，2，3，4，5]，成功诱导阵挛样发作反应。
[0062]
2、戊四氮诱发的癫痫样行为
[0063]
根据标准方案[6]，通过评估癫痫斑马鱼的游泳模式(表3)来确定戊四氮引起的癫痫发作的癫痫样行为。当斑马鱼癫痫得分大于等于4分时，计入诱发癫痫发作成功。
[0064]
3、癫痫共病认知障碍斑马鱼筛选
[0065]
将反复3次成功诱发癫痫后的改良组及传统组斑马鱼分别使用改良t迷宫及传统t迷宫测试学习记忆能力。所有斑马鱼经均使用诺达思斑马鱼行为轨迹分析系统(noldus daniovision system)分析6分钟内斑马鱼到达ec区潜伏期和斑马鱼总ec区停留时间。
[0066]
4、实验结果
[0067]
4.1癫痫斑马鱼模型的建立
[0068][0069]
4.2癫痫共病认知障碍斑马鱼筛选(*p＜0.001，**p＜0.01，***p＜0.05)
[0070]
[0071][0072]
5、实验结论：
[0073]
5.1：改良组斑马鱼使用“一种新型改良t迷宫”进行学习训练之后，在正式测试时，改良组斑马鱼找到ec区的成功率较传统组提高了29.16％，训练成功率达到95.83％；训练时间由传统t迷宫的5天缩短至3天，效率提高了40％；因此，“一种新型斑马鱼改良t迷宫”在斑马鱼认知行为学实验中，较传统t迷宫有更好的训练成功率及更高的实验效率。
[0074]
5.2：t迷宫实验的基础是基于食物奖励机制，经过训练的斑马鱼能否找到ec区代表了其学习的成果。因此，越快找到ec区，且在ec区中停留的时间越长，表示斑马鱼学习的效率越高、记忆得越好。相比于传统组，改良组斑马鱼在经过训练之后，ec区潜伏期明显缩短，且ec区潜伏期的数据分布更整齐，表明改良t迷宫能有效提升斑马鱼学习记忆能力，并能更好的评估斑马鱼学习记忆能力。另一方面，相比于传统组，改良组总ec停留时间的显著提升，也提示了斑马鱼对改良t迷宫更具有探索和学习的兴趣。相比于其他通过使用“惊吓、恐惧、电击”等伤害斑马鱼的手段进行其记忆功能评估的方法，我们通过构建人工模拟斑马鱼生态环境装置，使斑马鱼在愉悦舒适的环境下进行学习和探索，有助于提升实验动物福利。
[0075]
5.3：在使用改良t迷宫进行癫痫共病认知障碍斑马鱼筛选的过程中，改良t迷宫筛选成功率达43.75％，接近目前文献报道的疾病发病率[7，8]，相比与传统t迷宫，改良t迷宫的认知障碍检出率高、数据稳定，有助于未来进行各种认知障碍疾病模型构建的实验要求。
[0076]
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以上仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。