利用外源水杨酸缓解玉米瘤黑粉病的方法

1.本发明涉及农业应用技术领域，尤其涉及利用外源水杨酸缓解玉米瘤黑粉病的方法。


背景技术：

2.玉米瘤黑粉病又称灰包，是一种由真菌引起的局部性病害，发病极为普遍，是一种世界性病害，在我国，玉米瘤黑粉病在东北、华北春玉米区和黄准海夏玉米区普遍发生，是黄淮海区、东北区和西北区玉米的主要病害，近年来，由于玉米种植面积连年扩大，重茬地块增多，旱涝交替等气候异常，土壤中黑粉菌厚垣孢子逐年积累，玉米瘤黑粉病的发生呈逐年上升趋势，在某些地区不断加重并成为主要病害，个别地块甚至病株率超过30％，导致玉米严重减产。
3.对于玉米病害，加强田间栽培管理，调整播期及合理施肥，同时使用化学药剂防治，可有效控制病情发展。这种农业措施和药剂处理在一定程度上能够降低发病程度，但存在成本高、污染环境和防护作用不稳定等问题。
4.水杨酸(salicylic acid，sa)是植物界普遍存在的酚类化合物，是一种新型植物激素，目前，已经明确sa可作为植物抗逆反应所需的信号分子来激活植物防御保护机制，在植物的抗逆过程中起着关键作用，研究发现水杨酸等能有效控制烟草，番茄，黄瓜等双子叶植物上多种细菌，真菌和病毒性病害，对玉米等单子叶植物上的白粉病，叶斑病，霜霉病等也有很好的诱抗效果。因此，探讨外源sa对玉米幼苗瘤黑粉病抗性的影响，明确sa诱导玉米幼苗抗瘤黑粉病的可能生理机制是非常必要的，对提高玉米抗病性及保障粮食安全具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是解决现有技术存在的以下问题：研究发现水杨酸已经明确 sa可作为植物抗逆反应所需的信号分子来激活植物防御保护机制，在植物的抗逆过程中起着关键作用，因此探讨外源sa对玉米幼苗瘤黑粉病抗性的影响，明确sa诱导玉米幼苗抗瘤黑粉病的可能生理机制是非常必要的，对提高玉米抗病及保障粮食安全具有重要意义。
6.为解决现有技术存在的问题，本发明提供利用外源水杨酸缓解玉米瘤黑粉病的方法，包括水杨酸溶液，水杨酸溶液浓度为0.01-0.5mmol
·
l-1
，将所述水杨酸溶液施加在玉米幼苗叶片表面，至玉米幼苗叶片湿润。
7.优选的，所述水杨酸溶液浓度为0.5mmol
·
l-1
。
8.优选的，在所述玉米幼苗六叶一心期时施加所述水杨酸溶液。
9.与相关技术相比较，本发明提供的利用外源水杨酸缓解玉米瘤黑粉病的方法具有如下有益效果：
10.本发明主要通过设计多个水杨酸浓度，对玉米幼苗接种瘤黑粉菌后进行 pod、ppo、pal、mda、β-1,3-ga等指标的测定，探讨外源水杨酸对接种瘤黑粉菌后玉米幼苗病情指
数和生理生化特性的影响，明确水杨酸诱导玉米幼苗抗瘤黑粉病可能的生理机制，对缓解病害对植株的伤害，具有很高的应用价值，而且实施方法简单，应用潜力很大。
附图说明
11.图1为水杨酸处理对接种瘤黑粉菌后玉米幼苗mda含量的影响；
12.图2为水杨酸处理对接种瘤黑粉菌后玉米幼苗ppo活性的影响；
13.图3为水杨酸处理对接种瘤黑粉菌后玉米幼苗pal活性的影响；
14.图4为水杨酸处理对接种瘤黑粉菌后玉米幼苗pod活性的影响；
15.图5为水杨酸处理对接种瘤黑粉菌后玉米幼苗β-1,3-ga活性的影响。
具体实施方式
16.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
17.以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
18.实施例一
19.利用外源水杨酸缓解玉米瘤黑粉病的方法，采用水杨酸溶液喷洒在六叶一心期的玉米幼苗的叶片表面，至玉米幼苗叶片湿润；
20.缓解玉米幼苗瘤黑粉病的最适sa浓度的筛选方法，按以下步骤进行：
21.1、材料准备：玉米自交系“掖478”种子和“齐319”种子，水杨酸和玉米瘤黑粉菌溶液配置。
22.2、种子处理：选取色泽正常、籽粒饱满、整齐一致的玉米种子，玉米种子用0.5％的次氯酸钠消毒10min，用蒸馏水冲洗4次，用无菌滤纸吸干附着的水，得玉米消毒种子。
23.3、试材培育：水与营养土按1ml：5g比例混合均匀后，将处理后的玉米种子播种到垫有两层滤纸的直径为15cm的培养皿中，置于25℃培养箱中发芽，玉米出苗后，选取生长一致的三叶一心期的幼苗转移到直径为32cm塑料花盆中，每盆植苗4株，每个处理6次重复，在温室进行培养，温室的湿度调至80％，温度为27℃条件下培养24h，然后置于正常温湿度环境下继续培养培养，每天每盆定量浇800ml水；待长至六叶一心期时，对玉米幼苗接种瘤黑粉菌。
24.4、试验处理：
25.4.1试验首先是供试菌种与接种液的制备：玉米瘤黑粉菌，取自甘肃农业大学平凉玉米育种站，使用时将冬孢子充分碾碎，过40目筛后收集均一菌粉，每10g菌粉加水1l，充分搅拌后300目筛网过滤(现用现配)；
26.4.2接种方法采用注射法：在玉米植株六叶一心期，用注射器吸取制备好的菌液注射到玉米植株的中下部，每株注入菌液1-2ml，见心叶冒液即可，对照组玉米植株在相同部位注射等量的蒸馏水。
27.4.3以注射玉米瘤黑粉菌液作为胁迫条件，水杨酸溶液的浓度设定为sa 0.5mmol
·
l-1
，待步骤3所得的玉米幼苗长至六叶一心期时，接种玉米瘤黑粉菌，12h后，喷施配制的sa溶液至叶片湿润，然后进行病情指数和各种生理指标测定；
28.5、各项指标的测定：对该浓度sa处理时间为0、12、48、72、96h的玉米叶片进行取样，测定丙二醛(mda)含量、超氧化物歧化酶(pod)活性、多酚氧化酶(ppo)活性、苯丙氨酸解氨酶(pal)活性和β-1，3葡聚糖酶(β
ꢀ‑
1，3-ga)活性，处理7d后统计玉米植株发病情况并计算病情指数(di)和诱抗效果。
29.实施例二
30.缓解玉米幼苗瘤黑粉病的最适sa浓度的筛选方法，按以下步骤进行：
31.1、材料准备：玉米自交系“掖478”种子和“齐319”种子，水杨酸和玉米瘤黑粉菌溶液配置。
32.2、种子处理：选取色泽正常、籽粒饱满、整齐一致的玉米种子，玉米种子用0.5％的次氯酸钠消毒10min，用蒸馏水冲洗4次，用无菌滤纸吸干附着的水，得玉米消毒种子。
33.3、试材培育：水与营养土按1ml：5g比例混合均匀后，将处理后的玉米种子播种到垫有两层滤纸的直径为15cm的培养皿中，置于25℃培养箱中发芽，玉米出苗后，选取生长一致的三叶一心期的幼苗转移到直径为32cm塑料花盆中，每盆植苗4株，每个处理6次重复；在温室进行培养，温室的湿度调至80％，温度为27℃条件下培养24h，然后置于正常温湿度环境下继续培养培养，每天每盆定量浇800ml水；待长至六叶一心期时，对玉米幼苗接种瘤黑粉菌。
34.4、试验处理：
35.4.1试验首先是供试菌种与接种液的制备：玉米瘤黑粉菌，取自甘肃农业大学平凉玉米育种站，使用时将冬孢子充分碾碎，过40目筛后收集均一菌粉，每10g菌粉加水1l，充分搅拌后300目筛网过滤(现用现配)；
36.4.2接种方法采用注射法：在玉米植株六叶一心期，用注射器吸取制备好的菌液注射到玉米植株的中下部，每株注入菌液1-2ml，见心叶冒液即可，对照组玉米植株在相同部位注射等量的蒸馏水。
37.4.3以注射玉米瘤黑粉菌液作为胁迫条件，水杨酸溶液的浓度设定为sa 0.1mmol
·
l-1
，待步骤3所得的玉米幼苗长至六叶一心期时，接种玉米瘤黑粉菌，12h后，喷施配制的sa至叶片湿润，然后进行病情指数和各种生理指标测定；
38.5、各项指标的测定：对该浓度sa处理时间为0、12、48、72、96h的玉米叶片进行取样，测定丙二醛(mda)含量、超氧化物歧化酶(pod)活性、多酚氧化酶(ppo)活性、苯丙氨酸解氨酶(pal)活性和β-1，3葡聚糖酶(β
ꢀ‑
1，3-ga)活性，处理7d后统计玉米植株发病情况并计算病情指数(di)和诱抗效果。
39.实施例三
40.缓解玉米幼苗瘤黑粉病的最适sa浓度的筛选方法，按以下步骤进行：
41.1、材料准备：玉米自交系“掖478”种子和“齐319”种子，水杨酸和玉米瘤黑粉菌溶液配置。
42.2、种子处理：选取色泽正常、籽粒饱满、整齐一致的玉米种子，玉米种子用0.5％的次氯酸钠消毒10min，用蒸馏水冲洗4次，用无菌滤纸吸干附着的水，得玉米消毒种子。
43.3、试材培育：水与营养土按1ml：5g比例混合均匀后，将处理后的玉米种子播种到垫有两层滤纸的直径为15cm的培养皿中，置于25℃培养箱中发芽，玉米出苗后，选取生长一致的三叶一心期的幼苗转移到直径为32cm塑料花盆中，每盆植苗4株，每个处理6次重复；在
温室进行培养，温室的湿度调至80％，温度为27℃条件下培养24h，然后置于正常温湿度环境下继续培养培养，每天每盆定量浇800ml水；待长至六叶一心期时，对玉米幼苗接种瘤黑粉菌。
44.4、试验处理：
45.4.1试验首先是供试菌种与接种液的制备：玉米瘤黑粉菌，取自甘肃农业大学平凉玉米育种站，使用时将冬孢子充分碾碎，过40目筛后收集均一菌粉，每10g菌粉加水1l，充分搅拌后300目筛网过滤(现用现配)；
46.4.2接种方法采用注射法：在玉米植株六叶一心期，用注射器吸取制备好的菌液注射到玉米植株的中下部，每株注入菌液1-2ml，见心叶冒液即可，对照组玉米植株在相同部位注射等量的蒸馏水。
47.4.3以注射玉米瘤黑粉菌液作为胁迫条件，水杨酸溶液的浓度设定为sa 0.05mmol
·
l-1
，待步骤3所得的玉米幼苗长至六叶一心期时，接种玉米瘤黑粉菌，12h后，喷施配制的sa至叶片湿润，然后进行病情指数和各种生理指标测定；
48.5、各项指标的测定：对该浓度sa处理时间为0、12、48、72、96h的玉米叶片进行取样，测定丙二醛(mda)含量、超氧化物歧化酶(pod)活性、多酚氧化酶(ppo)活性、苯丙氨酸解氨酶(pal)活性和β-1，3葡聚糖酶(β
ꢀ‑
1，3-ga)活性，处理7d后统计玉米植株发病情况并计算病情指数(di)和诱抗效果。
49.实施例四
50.缓解玉米幼苗瘤黑粉病的最适sa浓度的筛选方法，按以下步骤进行：
51.1、材料准备：玉米自交系“掖478”种子和“齐319”种子，水杨酸和玉米瘤黑粉菌溶液配置。
52.2、种子处理：选取色泽正常、籽粒饱满、整齐一致的玉米种子，玉米种子用0.5％的次氯酸钠消毒10min，用蒸馏水冲洗4次，用无菌滤纸吸干附着的水，得玉米消毒种子。
53.3、试材培育：水与营养土按1ml：5g比例混合均匀后，将处理后的玉米种子播种到垫有两层滤纸的直径为15cm的培养皿中，置于25℃培养箱中发芽，玉米出苗后，选取生长一致的三叶一心期的幼苗转移到直径为32cm塑料花盆中，每盆植苗4株，每个处理6次重复；在温室进行培养，温室的湿度调至80％，温度为27℃条件下培养24h，然后置于正常温湿度环境下继续培养培养，每天每盆定量浇800ml水；待长至六叶一心期时，对玉米幼苗接种瘤黑粉菌。
54.4、试验处理：
55.4.1试验首先是供试菌种与接种液的制备：玉米瘤黑粉菌，取自甘肃农业大学平凉玉米育种站，使用时将冬孢子充分碾碎，过40目筛后收集均一菌粉，每10g菌粉加水1l，充分搅拌后300目筛网过滤(现用现配)；
56.4.2接种方法采用注射法：在玉米植株六叶一心期，用注射器吸取制备好的菌液注射到玉米植株的中下部，每株注入菌液1-2ml，见心叶冒液即可，对照组玉米植株在相同部位注射等量的蒸馏水。
57.4.3以注射玉米瘤黑粉菌液作为胁迫条件，水杨酸溶液的浓度设定为sa 0.01mmoll-1
，待步骤3所得的玉米幼苗长至六叶一心期时，接种玉米瘤黑粉菌，12h后，喷施配制的sa至叶片湿润，然后进行病情指数和各种生理指标测定；
58.5、各项指标的测定：对该浓度sa处理时间为0、12、48、72、96h的玉米叶片进行取样，测定丙二醛(mda)含量、超氧化物歧化酶(pod)活性、多酚氧化酶(ppo)活性、苯丙氨酸解氨酶(pal)活性和β-1，3葡聚糖酶(β
ꢀ‑
1，3-ga)活性，处理7d后统计玉米植株发病情况并计算病情指数(di)和诱抗效果。
59.实施例五
60.缓解玉米幼苗瘤黑粉病的最适sa浓度的筛选方法，按以下步骤进行：
61.1、材料准备：玉米自交系“掖478”种子和“齐319”种子，水杨酸和玉米瘤黑粉菌溶液配置。
62.2、种子处理：选取色泽正常、籽粒饱满、整齐一致的玉米种子，玉米种子用0.5％的次氯酸钠消毒10min，用蒸馏水冲洗4次，用无菌滤纸吸干附着的水，得玉米消毒种子。
63.3、试材培育：水与营养土按1ml：5g比例混合均匀后，将处理后的玉米种子播种到垫有两层滤纸的直径为15cm的培养皿中，置于25℃培养箱中发芽，玉米出苗后，选取生长一致的三叶一心期的幼苗转移到直径为32cm塑料花盆中，每盆植苗4株，每个处理6次重复；在温室进行培养，温室的湿度调至80％，温度为27℃条件下培养24h，然后置于正常温湿度环境下继续培养培养，每天每盆定量浇800ml水；待长至六叶一心期时，对玉米幼苗接种瘤黑粉菌。
64.4、试验处理：
65.4.1试验首先是供试菌种与接种液的制备：玉米瘤黑粉菌，取自甘肃农业大学平凉玉米育种站，使用时将冬孢子充分碾碎，过40目筛后收集均一菌粉，每10g菌粉加水1l，充分搅拌后300目筛网过滤(现用现配)；
66.4.2接种方法采用注射法：在玉米植株六叶一心期，用注射器吸取制备好的菌液注射到玉米植株的中下部，每株注入菌液1-2ml，见心叶冒液即可，对照组玉米植株在相同部位注射等量的蒸馏水。
67.4.3以注射玉米瘤黑粉菌液作为胁迫条件，使用ck(0.00mmol
·
l-1
，即双蒸水)替代水杨酸溶液，即水杨酸溶液的浓度设定为sa0mmoll-1
，待步骤 3所得的玉米幼苗长至六叶一心期时，接种玉米瘤黑粉菌，12h后，喷施ck 至叶片湿润，然后进行病情指数和各种生理指标测定；
68.5、各项指标的测定：对ck处理时间为0、12、48、72、96h的玉米叶片进行取样，测定丙二醛(mda)含量、超氧化物歧化酶(pod)活性、多酚氧化酶(ppo)活性、苯丙氨酸解氨酶(pal)活性和β-1，3葡聚糖酶(β-1， 3-ga)活性，处理7d后统计玉米植株发病情况并计算病情指数(di)和诱抗效果。
69.各实施例结果与分析
70.玉米瘤黑粉病发病等级
71.玉米瘤黑粉病发病等级参考严理等的调查方法，，结合玉米瘤黑粉病自身的发病程度与特征，分别对不同浓度水杨酸处理的玉米植株进行病情调查，每株按0、1、2、3、4等级分级统计，并计算病情指数(di)，筛选出水杨酸缓解玉米瘤黑粉病的最佳浓度。玉米瘤黑粉病的分级标准见表1，试验结果见表2。
72.病情指数(di)＝∑(各级病株数
×
发病级数)
×
100/(最高病级数
×
调查总株数)
73.表1玉米瘤黑粉病的调查分级标准
[0074][0075]
表2表示采用不同浓度的水杨酸处理(0、0.5、0.1、0.05和0.01mmol
·
l-1
) 玉米自交系掖478后，玉米瘤黑粉病病情指数发生明显的差异。接种玉米瘤黑粉菌12h后喷施水杨酸至叶片湿润，7d后对植株进行发病等级与病情指数统计，结果(表2)表明：喷施水杨酸7d后，4种浓度的水杨酸对玉米诱导处理后玉米瘤黑粉病的病情指数明显下降，其中以水杨酸浓度为0.05mmol
·
l-1
处理后诱导的诱导效果最好。与对照相比，当水杨酸浓度为0.01、0.05、0.1、 0.5mmol
·
l-1
时，病情指数均显著下降，分别下降了5.30％、57.60％、42.05％、 47.92％和21.02％。按发病等级与病情指数分析，0.1mmol
·
l-1
水杨酸喷施的玉米植株3、4级发病数量为0，所以病情指数并不是最高的；对照组和0.01 mmol
·
l-1
水杨酸喷施的玉米植株各等级发病数量居多，所以病情指数是最高的；发病程度较轻的是0.5mmol
·
l-1
水杨酸喷施的玉米植株；0.05mmol
·
l-1
水杨酸喷施的玉米植株病情指数最低，说明病情指数与发病等级呈正相关，发病等级越高，病情指数也偏高，这与玉米品种的抗性分析结果基本一致。说明水杨酸在一定浓度范围内，能够诱导玉米对瘤黑粉病产生抗性。
[0076]
表2不同浓度sa处理对玉米植株病情指数和诱抗效果的影响
[0077][0078]
注：不同小写字母代表不同处理间在0.05水平差异显著，下同。
[0079]
各项生理指标的测定：水杨酸诱导处理完成后0、12、48、72、96h取样，将齐319和掖478玉米幼苗用蒸馏水冲洗干净，取玉米幼苗叶进行各项指标测定，各项指标包括mda含量、pod、ppo、pal、β-1，3-ga活性，测定结果如下：
[0080]
(1)水杨酸处理对接种瘤黑粉菌后玉米幼苗生长的影响见表2；由表2 可以得出：与对照相比，添加不同浓度的sa后，各浓度sa处理均比对照处理的病情指数有所下降，表明sa可以缓解玉米瘤黑粉菌对玉米幼苗生长的影响，由不同处理显著性差异看来，0.051mmol
·
l-1
为sa缓解的最适浓度。
[0081]
(2)水杨酸处理对接种瘤黑粉菌后玉米幼苗生理特性的影响见图1、图2、图3、图4、图5；
[0082]
由图1可以看出：sa处理后玉米幼苗叶片mda含量呈逐渐下降的趋势，但是两个自交系之间、各种处理之间下降的幅度也不一样，48h时sa处理的玉米叶片mda含量明显降低达到最低值，与ck组相比均具有显著性差异(p ＜0.05)，抗感玉米比各自ck接种处理的玉米mda含量降低71.07％、46.91％。在玉米没有被病原菌胁迫时，sa处理的mda含量也始终低于对照组。以上结果说明sa能够减轻黑粉菌对玉米植株体内膜系统造成的伤害。
[0083]
由图2可以看出：经过sa处理的抗感玉米幼苗ppo活性在12-72h与对照组相比均具有显著性差异(p＜0.05)，未用sa处玉米ppo活性也呈波动上升的趋势，齐319sa接种处理的玉米ppo活性先缓慢升高随后逐渐降低，在48h达到最高点，与ck处理组的玉米ppo活性差异显著，分别高于ck 未接种和ck接种处理的40.3％和37.3％，齐319的ppo酶整体活性高于掖 478，再次证明齐319的抗逆性强于掖478，由此可见，经sa处理的玉米幼苗ppo活性均比未用sa处理的ppo活性高，说明sa处理玉米幼苗后ppo活性升高。
[0084]
由图3可以看出：所有处理的酶活性变化情况趋于一致，且活性均在48h 达到最大，齐319的活性整体还是高于掖478，符合它们的抗性，经sa处理的玉米幼苗pal活性比未用sa处理高，但与ck接种处理下的玉米幼苗pal 活性没有显著差异(p＜0.05)，各处理间显著性差异也不高。因此，sa诱导玉米幼苗ppo的活性的增加并不明显。
[0085]
由图4可以看出：接种玉米瘤黑粉菌后，在外源sa的诱导下，玉米幼苗叶片内pod活性被显著提升，未经sa处理的ck组叶片内pod活性随时间的推移逐渐上升，但是上升的幅度不大，在48hsa接种处理的玉米pod活性比各自ck接种处理的玉米pod活性高且有显著性差异(p＜0.05)；随着时间延长，sa接种、sa未接种两个处理在48-96h内保持在较高水平，以上结果说明，经sa外源处理后，玉米叶片pod活性会更高。
[0086]
由图5可以看出：sa处理后玉米幼苗叶片β-1,3-ga活性均有所升高，但升高的幅度不一样，48h时β-1,3-ga活性明显得到提高，与ck组相比均具有显著性差异(p＜0.05)。齐319的β-1,3-ga活性整体高于掖478，与它们自身抗性相符。未用sa处理的ck组幼苗叶片的β-1,3-ga活性先升高后降低，0h时sa处理叶片β-1,3-ga活性较之ck没有显著性差异(p＜0.05)， 48h时sa处理与其他处理之间有显著性差异(p＜0.05)；掖478sa接种处理下玉米的β-1,3-ga活性最高，比ck未接种和ck接种处理组分别提高了 26.44％和41.09％，齐319sa-接种处理下玉米幼苗的β-1,3-ga活性分别高于 ck未接种和ck接种处理26.6％和52.5％。由此说明适宜浓度的sa可以调控植物体内β-1,3-ga活性的提高。
[0087]
结果分析与最适sa浓度筛选：对步骤5测得的接种瘤黑粉菌幼苗的每个样品中的各项数据，采用microsoft excel2019软件进行数据处理，所有试验数据统计分析spss26.0进行处理，试验结果用平均值
±
标准偏差(sd)表示，采用duncan’s新复极差法进行多重比较，对各处理组进行显著性差异分析。
[0088]
从以上实例可以看出，外源水杨酸可有效提高玉米黑粉病胁迫下玉米叶片中的抗氧化酶活性，降低其体内活性氧含量，从而减轻玉米瘤黑粉病对植株的伤害。采用外源水杨酸处理在实践中易操作，有实效，有望成为实践中改善玉米瘤黑粉病的好方法，应用潜力很大。