一种海藻粗提物、制备方法和应用与流程

1.本发明涉及一种海藻粗提物、制备方法和应用，属于松材线虫防治技术领域。


背景技术：

2.海藻(sargassum)，海产藻类的统称，其形态结构简单，种类多样，据估计，海洋中海藻的种类超过15000种，是海洋生态系统的重要组成部分。海藻因长期生存于高压、高盐、低温的海洋环境中，特殊的生长环境促使海藻进化出了不同的内源抗逆因子，可产生许多具有特定功能的天然活性物质，帮助其抵抗环境胁迫。随着人们对海藻研究的深入，越来越多的优质海藻原料被人们所认识，并加以开发和利用。最初人们主要从海藻中提取矿物质和微量元素，后来人们逐渐认识到海藻中所含的活性物质的重要性，纷纷采用不同的生产工艺进行加工，并不断改进生产工艺，让生产变得更加便捷和高效。目前，人们主要采用化学法、物理法、生物法和复合法从海藻中提取活性物质，如何有效保留和充分获取海藻中的活性物质一直是人们研究的重点。另外，海藻提取物在农业、工业、医疗等领域取得了广泛的应用，如海藻提取物可作为农作物生长增效剂、提高作物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力等，但目前关于其防治线虫的研究还鲜有报道。
3.松材线虫(bursaphelenchus xylophilus)对我国林业造成了十分严重的危害，严重制约了林业的发展。松材线虫是松树松材线虫病的病原生物之一，每年导致上千万棵松属植物病死，并呈现逐年递增的趋势，对我国9亿亩松林安全造成了严重威胁。目前对松材线虫的防治方式主要以化学方式为主，大量化学农药的使用给环境造成了严重的负担，也对人体健康产生了一定的威胁，而且长期使用化学杀线虫剂，松材线虫也会产生抗药性，使得治理难度加大。
4.现如今，生物防治方法引起了人们的广泛关注，人们从天然物质中提取对松材线虫有灭杀作用的天然活性物质，取得了一定的成效，研究发现海藻中也存在一些对线虫具有灭杀效果的活性物质，但目前研究较少，也缺少一种环境友好、成本低廉、操作简单的海藻提取物制备方法。如cn115058480a公开了一种杀线虫海藻发酵产物及其应用，通过将高产海藻酸裂解酶的菌株接种于海藻发酵培养基中培养，然后接入生防菌株发酵培养得到，其制备的杀线虫海藻发酵产物有效结合了海藻活性物质的促生功能与生防功能，除了有效缓解土壤线虫等病害，对作物生长有一定的促进作用，但是制备方法较为复杂。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明提供了一种海藻粗提物、制备方法和应用，本发明首先对17种海藻类植物的甲醇和正己烷溶剂粗提物的松材线虫杀灭活性检测发现，马尾藻的杀线虫活性最佳，然后对马尾藻不同溶剂粗提取的松材线虫杀灭活性检测发现，马尾藻丙酮粗提物杀线虫效果优于其它溶剂和组合物，且林间防治松材线虫效果显著。本发明采用马尾藻作为主要原料，价格低廉，且制备方法简单，适合推广使用。
6.本发明的技术方案是：一种海藻粗提物，其特征是，所述海藻粗提物为马尾藻的有
机溶剂粗提物，所述有机溶剂可以为丙酮、乙酸乙酯、甲醇、石油醚和正己烷中的一种或者多种，本发明优选马尾藻的丙酮粗提物。
7.上述马尾藻粗提物的制备方法为：将马尾藻粉碎后与提取溶剂混合，然后加热回流提取，再经浓缩获得粗提物。具体为：将洗净烘干后的马尾藻粉碎后与提取溶剂混合，然后加热回流提取，加热回流5～8h；提取完成后冷却降温，35～40℃条件下进行旋转蒸发，直至粗提液呈粘稠状，即为粗提物。
8.本发明还公开了上述马尾藻粗提物在松材线虫防治方面的应用。
9.本发明还公开了一种防治松材线虫的植物源杀虫剂，其特征是，其活性成分为马尾藻丙酮提取物，还可以加入常用的农药助剂，如表面活性剂吐温-80。
10.本发明还公开了一种采用马尾藻粗提物防治松材线虫的方法，其特征是，将马尾藻丙酮粗提物采用丙酮溶解后，加水稀释使其终浓度为1～5mg/l(以生药计)，并加入适量表面活性剂(如按8％的量加入吐温-80)混合均匀得到稀释液，采用上述稀释液对松林进行喷施，两次喷施间隔15～25天，每次用量300～500公斤/亩。
11.本发明的有益效果：
12.(1)本发明首先对收集的17种海藻类植物的甲醇(极性溶剂)和正己烷(非极性溶剂)粗提物的松材线虫杀灭活性检测发现，马尾藻的杀线虫活性最佳，然后对马尾藻不同溶剂粗提取的松材线虫杀灭活性检测发现，马尾藻丙酮粗提物杀线虫效果优于其它溶剂和不同溶剂的组合物，因此确定最佳的海藻粗提物为马尾藻丙酮粗提物，且经实验证实马尾藻中可能含有多种具有杀松材线虫活性物质(马尾藻的甲醇和正己烷的组合粗提物杀松材线虫活性优于马尾藻甲醇粗提物)；
13.(2)本发明海藻粗提物的制备方法大大提高了海藻活性成分的提取效率，保留了多种活性成分，且制备方法简单，成本低廉，便于大规模生产；
14.(3)经试验证明马尾藻丙酮粗提物能够有效防治松材线虫，其lc
50
＝70.73μg/ml，且500倍马尾藻丙酮粗提物在林间能够有效预防松材线虫病发生，能将马尾松死亡率降低至0；
15.(4)本发明的粗提物可用于制备防治松材线虫的无公害、新型植物源杀线虫剂；同时，相比传统打孔注药的化学方法安全环保且简便易行，具有可推广性。
附图说明
16.图1为松材线虫状态变化图(0h和24h)。
具体实施方式
17.下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实例中，马尾藻及其他藻类的使用部位为茎叶混合部位。
18.实施例1：不同种类海藻粗提物的获取及杀线虫效果检测
19.本实施例提供了不同海藻粗提物的提取方法及不同粗提物对松材线虫杀灭效果
相关实验。
20.1.实验方法
21.(1)不同种类海藻粗提物的获取
22.①
材料前处理
23.收集17种海藻类植物作为供试材料，具体为：石花菜、海带、紫菜、马尾藻、沙菜、龙须菜、软骨藻、环节藻、浒苔、裙带菜、角叉菜、石莼、羊栖菜、海黍子、江蓠、松藻、麒麟菜；将上述材料分别用清水冲洗3～5次，去掉杂藻、泥沙等异物；再利用超声波清洗机清洗1～2次，每次25～30min。
24.②
真空干燥
25.清洗完成后，将供试材料置于电热鼓风干燥箱中71～75℃烘干10～12h；之后研磨成粉末，常温下真空干燥24～26h。
26.③
粗提液获取
27.分别取20g干燥好的供试材料粉末，置于滤纸包中，放入规格为250ml的索氏提取器中；准确量取300ml溶剂加入到索氏提取器中，将样品充分浸泡4～5h，多余的溶剂置于圆底烧瓶中；浸泡完成后，加热(保持温度80℃)进行回流提取，时间为6h左右，完成后即为粗提液。本实验用甲醇和正己烷分别进行提取。
28.④
浓缩
29.提取完成后冷却降温，35～40℃条件下进行旋转蒸发，直至粗提液呈粘稠状，即为粗提物。
30.(2)不同海藻粗提物对松材线虫杀灭效果检测
31.①
不同粗提物初浓度确定
32.提取完成后分别加入甲醇和正己烷定容至100ml，在此基础上调整各粗提物浓度为：以生药计为1mg/ml。
33.②
松材线虫溶液制备
34.将松材线虫(bursaphelenchus xylophilus)接种于灰葡萄孢菌(botrytis cinerea)平板(pda培养基)上，25℃恒温培养箱中培养5～7d；待松材线虫长满平板后，利用贝尔曼漏斗法分离线虫；将分离到的线虫液，在3500r/min条件下离心5min去除杂质，用无菌水稀释线虫液体，重复3次，最后收集到线虫液；随后制成浓度约为5000头/ml松材线虫提取液。
35.③
相同浓度的不同粗提物对松材线虫杀灭活性检测
36.将待测不同粗提物与线虫提取液按照1:1的体积比均匀混合于96孔板中，混合液总量为300μl，并使松材线虫稳定在2500头/ml左右；空白对照为无菌水代替待测粗提物；混合完成后，25℃条件下静置处理，在0.5h、1h、2h、4h、6h、12h、24h、48h和72h用光学显微镜镜检，观察松材线虫死亡情况，计算各待测粗提物处理松材线虫校正死亡率。
37.镜检方式：处理完成后将混合液于2000r/min离心机离心180s，去掉上清，用200μl无菌水重悬，取50μl重悬液于载玻片上，镜检。
38.我们以僵直不动线虫为死亡线虫标准；
39.校正死亡率(％)＝(处理死亡率-空白对照死亡率)/(1-空白对照死亡率)
×
100，
40.死亡率(％)＝处理线虫死亡数/处理线虫总数
×
100。
41.2.结果分析
42.经实验证明，以甲醇为单一溶剂提取的不同海藻粗提物中，仅马尾藻粗提物具有杀松材线虫活性；以正己烷为单一溶剂提取的不同海藻粗提物中，马尾藻和石花菜粗提物表现出杀松材线虫活性；剩余15种供试海藻粗提物均不具有杀松材线虫活性。在对各处理松材线虫校正死亡率统计中发现，马尾藻甲醇粗提物对松材线虫的杀灭活性优于马尾藻正己烷粗提物和石花菜正己烷粗提物，且在处理松材线虫4h时开始发挥作用，处理24h后松材线虫校正死亡率达100％(参照表1)。该结果说明，用极性溶剂甲醇和非极性溶剂正己烷提取马尾藻，其粗提物具有不同的杀松材线虫活性。
43.表1不同海藻材料的甲醇、正己烷提取物对松材线虫杀灭效果
[0044][0045]
为了验证两种溶剂粗提物的组合物杀松材线虫活性，我们按照按1:1体积比将马尾藻甲醇提取物与马尾藻正己烷提取物充分混合，测试其杀松材虫活性(实验方法同上)，对照为马尾藻甲醇提取物。结果发现，组合物杀松材线虫活性优于马尾藻甲醇粗提物；组合物在处理松材线虫2h时开始发挥作用，处理12h后松材线虫校正死亡率达92.10％(参照表2)。这表明，马尾藻中可能含有多种具有杀松材线虫活性物质，需要进一步研究。
[0046]
表2马尾藻单一粗提物与组合物对松材线虫杀灭效果
[0047][0048]
实施例2：马尾藻不同溶剂粗提物杀线虫效果检测
[0049]
本实施例提供了马尾藻不同溶剂粗提物对松材线虫杀灭效果相关实验。
[0050]
选取5种典型溶剂，具体为丙酮、乙酸乙酯、甲醇、石油醚和正己烷，进行提取，提取方法同实施例1所述。将所得5种马尾藻粗提物按照实施例1所述方法进行杀松材线虫效果检测。
[0051]
结果表明，在测试的5种马尾藻粗提物中，马尾藻丙酮粗提物对松材线虫杀灭效果最优；其处理2h后，松材线虫开始死亡；在处理12h后，松材线虫校正死亡达94％(参照表3)。综合分析5种马尾藻粗提物，杀虫活性为：马尾藻丙酮粗提物＞马尾藻乙酸乙酯粗提物＞马尾藻甲醇粗提物＞马尾藻石油醚粗提物＞马尾藻正己烷粗提物。
[0052]
表3马尾藻不同溶剂粗提物对松材线虫杀灭效果
[0053][0054]
同时，我们比较了马尾藻丙酮提取物与马尾藻甲醇提取物、马尾藻正己烷提取物的组合物(1:1)的杀线活性。结果表明，马尾藻丙酮粗提物杀线虫效果略优于组合物(参照表4)；并且，用单一溶剂丙酮提取，使用方法简便，效率更高，更易于推广。
[0055]
表4马尾藻丙酮粗提物与组合物对松材线虫杀灭效果
[0056][0057][0058]
实施例3：马尾藻丙酮粗提物杀线毒力测定
[0059]
实施例2说明，马尾藻丙酮粗提物杀线虫效果优于其它溶剂马尾藻粗提物和组合物，故我们对马尾藻丙酮提取物的毒力进行测定，确定了其24h的lc
50
。利用稀释法(丙酮为溶剂)将马尾藻丙酮提取物(以生药计为1mg/ml)分别稀释到200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml和1200μg/ml。按照实施例1所述方法进行杀松材线虫效果检测，在处理24h后观察松材线虫死亡情况，计算各处理松材线虫校正死亡率，各处理马尾藻丙酮提取物终浓度为100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml和600μg/ml。
[0060]
结果发现，600μg/ml马尾藻丙酮粗提物处理松材线虫24h，松材线虫校正死亡率达99.67％，线虫僵直死亡(参照图1)；我们进一步得到了其毒力回归方程，通过毒力回归方程计算得到马尾藻丙酮粗提物lc
50
＝70.73μg/ml，说明马尾藻丙酮粗提物具有较高的杀松材线虫活性(参照表5)。
[0061]
表5不同浓度马尾藻丙酮粗提物对松材线虫杀灭效果
[0062][0063]
实施例4：马尾藻丙酮粗提物林间药效试验
[0064]
1.试验方法
[0065]
(1)试验地点
[0066]
试验地选取威海刘公岛马尾松林场，往年该基地松材线虫发病严重，马尾松受破坏严重；同时，此处栽培条件、地势等条件均能满足试验要求。
[0067]
(2)试验药剂
[0068]
供试药剂：马尾藻丙酮粗提物(以生药计为1mg/ml)稀释500倍，并按照8wt％的量加入吐温-80，吐温-80为表面活性剂。对照为清水。
[0069]
(3)试验方法
[0070]
施药方式：无人机喷雾；型号为大疆t40，机载gps，机载电脑调控喷洒流量，配进口专用喷头，喷雾压力2.5bar。
[0071]
本试验共设1个施药处理：500倍稀释的马尾藻丙酮粗提物，用量400公斤/亩，共64亩，处理株数3567棵；对照为清水，用量400公斤/亩，共71亩，处理株数3954棵。我们于2021年6月5日在威海刘公岛马尾松林场展开试验，施药后20d，进行第二次施药。
[0072]
两次施药完成后，于第二年对马尾松死亡情况进行统计。
[0073]
2.结果分析
[0074]
结果分析发现，喷施500倍稀释马尾藻丙酮粗提物后，马尾松死亡率为0；喷施清水对照，马尾松死亡率为4.3
‰
(参照表6)；说明，马尾藻丙酮粗提物在林间能够有效预防松材线线虫病发生。同时，该方法相比传统打孔注药的化学方法安全环保且简便易行，具有可推广性。
[0075]
表6马尾松死亡情况统计
[0076]