用于预防人类病原体在蔬菜上形成和生长的细菌菌株的制作方法

本发明涉及用于预防人类病原体在种子和蔬菜上形成和生长的细菌菌株。本发明还涉及所述菌株在不同应用中的用途。

背景技术：

1、世界各地的众多食谱中都含有绿叶蔬菜，并且人们认为绿叶蔬菜是营养健康的食物成分。然而，随着人们对新鲜方便蔬菜的需求增加，食源性疾病爆发的数量也在增加。人类病原体的污染可能在整个蔬菜生产链中发生，并且由于蔬菜产品是生食的，微生物很难去除或用自来水冲洗掉。氯处理旨在减少菌载量，但其有效性受到质疑，并被认为会造成健康和环境风险。许多国家也都禁止使用氯。生物保藏或生物控制的原理是利用拮抗细菌或其代谢物来控制病原体的生长和存活。这种效应背后的潜在机制是，例如营养物或物理空间的竞争，或拮抗化合物的产生。在以前的研究中，曾利用从新鲜农产品中分离出的细菌进行生物防治，以预防青椒盘中出现切斯特沙门氏菌(salmonella chester)和单核细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes)。发现菊苣天然微生物群的混合分离株可以抵御单核细胞增生李斯特菌，而乳酸菌菌株则抑制嗜水气单胞菌(aeromonas hydrophilia)、单核细胞增生李斯特菌、肠炎沙门氏菌(salmonella enterica)和金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)。虽然大肠杆菌(e.coli)是在绿叶蔬菜上发现的最常见且最严重的病原体之一，但通过生物保藏来预防其生长的研究寥寥无几。然而，在生物保藏过程中，重要的是要关注对人和植物都不致病的拮抗细菌。到目前为止，拮抗细菌菌株对人类病原体的作用还没有在活体植物上进行过测试，特别是没有在实际生产环境中进行过测试，这种测试对于评估细菌菌株的商业用途潜力至关重要。以前的研究只在灭菌的叶片系统上进行，其中天然微生物群已被去除，这与实际的田间生产系统完全不同。

2、在已经建立的生态系统中，对空间的竞争和共存应该是潜在细菌菌株生存和生长的最重要挑战之一，而这种情况只能在植物体内进行测量。

3、wo 2016/005974披露了在幼苗中对种子相关疾病的生物防治。描述了在油和细菌混合物中包含颗粒物质的配制剂。在所述文件的表5b中，该配制剂仅针对植物病原体进行过测试。肠杆菌科(enterobacteriaceae)是植物病原体的实例。肠杆菌科中有庞大而多样的细菌种类。有些物种与人类疾病有关(例如，大肠杆菌)，并且有些与植物相关疾病有关(例如，欧文氏菌(erwinia))。由于肠杆菌科的种类繁多，所以例如，即使一种拮抗菌株对一种或几种肠杆菌科(enterobacteriaceae)物种具有拮抗作用，那么也不能得出该拮抗菌对所有肠杆菌科物种都有效的结论。即使病原体属于同一个细菌分类家族，也不能假定抗植物病原体的拮抗剂对人类病原体也有效。细菌的致病性是菌株特异性的，而植物病原体一般不是人类病原体。

4、因此，有必要提供新型改良细菌菌株，其既对活体植物具有较高的病原体抗性，特别是人类病原体抗性，又能改变植物的微生物群，使之朝着有利于消费者健康的方向发展。此外，希望获得足够稳健的细菌菌株来处理现实生活中的田间生产系统，并且这些细菌菌株随着时间的推移是稳定的，即具有改进的存储能力。

技术实现思路

1、鉴于以上所述，本发明构思的目的是提供至少一种细菌菌株，其中解决了现有技术的一个或多个上述缺点。

2、根据第一方面，本发明涉及从可食用叶子中分离的细菌菌株，该细菌菌株选自由以下组成的组：具有登录号lmg p-32204的普农假单胞菌(pseudomonas punonensis)、具有登录号lmg p-32205的凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)、具有登录号lmg p-32206的凝结芽孢杆菌、和具有登录号lmg p-32207的松柏假单胞菌(pseudomonas cedrina)，用于预防人类病原体在种子和蔬菜上形成和生长。

3、正如下文中详细描述的，令人惊讶地是，上述菌株已被证明在商业领域环境中对活体植物上的潜在的人类病原体(如大肠杆菌)具有拮抗作用。

4、通过用上述细菌菌株进行种子涂覆，已经表明有可能使植物的微生物组成朝着有利于消费者健康的方向发展。通过这种方式，绿叶蔬菜上病原体繁殖和传播的风险就可以降低，并且未来病原体爆发的相关后果也可以减轻。人们还观察到，蔬菜(如叶菜)一旦种植，在播种后细菌多样性就会增加。

5、在另一方面，本发明提供组合物，该组合物包含至少一种细菌菌株，该细菌菌株选自由以下组成的组：具有登录号lmg p-32204的普农假单胞菌、具有登录号lmg p-32205的凝结芽孢杆菌、具有登录号lmg p-32206的凝结芽孢杆菌、和具有登录号lmg p-32207的松柏假单胞菌，用于预防人类病原体在种子和蔬菜上形成和生长。

6、在又一方面，本发明提供至少一种如上所述的细菌菌株用于预防人类病原体在种子和蔬菜上形成和生长的用途。

7、在本发明的又一方面，本发明提供分离菌株，该分离菌株选自由以下组成的组：具有登录号lmg p-32204的普农假单胞菌、具有登录号lmg p-32205的凝结芽孢杆菌、具有登录号lmg p-32206的凝结芽孢杆菌、和具有登录号lmg p-32207的松柏假单胞菌。

8、本文披露的新型菌株是从可食用叶子中分离的非致病性细菌菌株，该细菌菌株能够减轻田间植物体内的例如大肠杆菌等。

技术特征：

1.一种从可食用叶子中分离的细菌菌株，该细菌菌株选自由以下组成的组：具有登录号lmg p-32204的普农假单胞菌(pseudomonas punonensis)、具有登录号lmg p-32205的凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)、具有登录号lmg p-32206的凝结芽孢杆菌、和具有登录号lmg p-32207的松柏假单胞菌(pseudomonas cedrina)，用于预防人类病原体在种子和蔬菜上形成和生长。

2.根据权利要求1所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株用于预防人类病原体和植物病原体在种子和蔬菜上形成和生长。

3.根据权利要求1或2所述的细菌菌株，用于预防人类病原体埃希氏菌属(escherichia)物种和肠杆菌科(enterobacteriaceae)物种在种子和蔬菜上传播。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的细菌菌株，其中所述蔬菜是绿叶蔬菜。

5.一种组合物，该组合物包含至少一种细菌菌株，该细菌菌株选自由以下组成的组：具有登录号lmg p-32204的普农假单胞菌、具有登录号lmg p-32205的凝结芽孢杆菌、具有登录号lmg p-32206的凝结芽孢杆菌、和具有登录号lmg p-32207的松柏假单胞菌，用于预防人类病原体在种子和蔬菜上形成和生长。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物用于预防人类病原体和植物病原体在种子和蔬菜上形成和生长。

7.根据权利要求5或6所述的组合物，其中所述组合物包含以下的组合：具有登录号lmgp-32204的普农假单胞菌、具有登录号lmg p-32205的凝结芽孢杆菌、具有登录号lmg p-32206的凝结芽孢杆菌、和具有登录号lmg p-32207的松柏假单胞菌。

8.至少一种根据权利要求1-4中任一项所述的细菌菌株或根据权利要求5-7中任一项所述的组合物用于预防人类病原体在种子和蔬菜上形成和生长的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述蔬菜是绿叶蔬菜。

10.根据权利要求8或9所述的用途，其中所述至少一种菌株在打包之前被添加到用于洗涤该蔬菜的洗涤水中，或者在将蔬菜打包进包装之前、打包进包装的过程中或打包进包装后被喷洒到该蔬菜上。

11.根据权利要求8或9所述的用途，其中将所述至少一种菌株添加到与灌溉相关的水中或添加到水培生长系统中的营养液中。

12.根据权利要求8或9所述的用途，其中所述至少一种菌株被施加在包装的内部，或者被施加在该包装的衬里中或者在该包装的包装材料中。

13.根据权利要求8所述的用途，其中所述至少一种菌株在播种前被涂覆在种子上。

14.根据权利要求12所述的用途，其中所述至少一种菌株以104cfu/ml至1012cfu/ml的量涂覆在种子上。

15.根据权利要求12-13中任一项所述的用途，用于增加如播种后获得的蔬菜如叶菜的细菌多样性。

16.一种分离菌株，该分离菌株选自由以下组成的组：具有登录号lmg p-32204的普农假单胞菌、具有登录号lmg p-32205的凝结芽孢杆菌、具有登录号lmg p-32206的凝结芽孢杆菌、和具有登录号lmg p-32207的松柏假单胞菌。

17.至少一种根据权利要求1-4中任一项所述的分离菌株或根据权利要求5-7中任一项所述的组合物，用于在预防人类感染中使用。

技术总结
本发明涉及从可食用叶子中分离的细菌菌株，该细菌菌株选自由以下组成的组：具有登录号LMG P‑32204的普农假单胞菌CR10b、具有登录号LMG P‑32205的凝结芽孢杆菌H7、具有登录号LMG P‑32206的凝结芽孢杆菌H10、和具有登录号LMG P‑32207的松柏假单胞菌Y13.1，用于预防人类病原体在种子和蔬菜上形成和生长。

技术研发人员：伊丽莎白·乌利格,阿萨·哈坎森
受保护的技术使用者：维沃保护公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15