肿瘤储存及细胞培养组合物的制作方法

背景技术：

1、在癌症患者中，继宿主免疫抑制之后，利用通过快速扩增方案(rep)体外培养的肿瘤浸润性淋巴细胞(til)的过继性细胞疗法已成为成功的过继性细胞疗法。然而，目前的til制造和治疗过程受到持续时间、成本、无菌性问题以及本文所述其他因素的限制，使得治疗癌症患者的潜力受到严重限制。

2、无菌性是til成功生长的重要因素。例如，必须通过手术切除小心保持样品的无菌性以限制微生物污染的风险。在将肿瘤样品输送至til处理设备、在处理前储存肿瘤样本以及在处理肿瘤样本以产生高级别治疗性til的过程中，也必须确保无菌。因此，需要在til治疗剂的制造中提供无菌保障的试剂。

技术实现思路

1、本文提供了可用于制造til治疗剂的肿瘤储存组合物、细胞培养基及肿瘤洗涤缓冲液。这些试剂允许制造高品质的til治疗剂，同时降低微生物生物负荷并在til制造过程中提供无菌保障。具体地说，本文提供的肿瘤储存组合物有利地使细菌(例如革兰氏阴性及革兰氏阳性细菌物种)及真菌污染减到最少，同时不会明显影响细胞存活率。另外的，在所主张的细胞培养基中培养的淋巴细胞能够在具有极少细菌(例如革兰氏阳性及革兰氏阴性细菌)和/或真菌污染情况下进行分化、耗竭和/或活化。

2、在一方面，本文提供了一种用于低温储存肿瘤样本的组合物。该组合物包含：a)无血清、无动物组分的冷冻保存培养基；和b)抗生素组分，该抗生素组分包含：1)抗生素组合，该抗生素组合选自：i)庆大霉素(gentamicin)和万古霉素(vancomycin)；以及ii)庆大霉素和克林霉素(clindamycin)；或者2)为万古霉素的抗生素。

3、在一些实施方式中，万古霉素的浓度为约50-600μg/ml。在某些实施方式中，克林霉素的浓度为约400-600μg/ml。在一些实施方式中，庆大霉素的浓度为约50μg/ml。

4、在示例性实施方式中，该抗生素组分包含约50μg/ml庆大霉素及约400-600μg/ml克林霉素。在某些实施方式中，该抗生素组分包含约50μg/ml庆大霉素及约50-600μg/ml万古霉素。在某些实施方式中，该抗生素组分包含约50μg/ml庆大霉素及约100μg/ml万古霉素。

5、在一些实施方式中，该抗生素组分还包含抗真菌性抗生素。在某些实施方式中，该抗真菌性抗生素为双性霉素b(amphotericin b)。在一些实施方式中，该双性霉素b的浓度为约2.5-10μg/ml。

6、在示例性实施方式中，该冷冻保存培养基包含：i)一种以上选自钾离子、钠离子、镁离子及钙离子的电解质；以及ii)在生理条件及低温条件下有效的生物ph缓冲液。在一些实施方式中，钾离子的浓度在约35-45mm范围内，钠离子的浓度在约80-120mm范围内，镁离子的浓度在约2-10mm范围内，并且，钙离子的浓度在约0.01-0.1mm范围内。

7、在一些实施方式中，该组合物还包含营养有效量的至少一种单糖。在某些实施方式中，该组合物还包含不可透过细胞膜且在冷暴露期间有效抵抗细胞膨胀的不透过性阴离子，该阴离子选自以下：乳糖酸根、葡糖酸根、柠檬酸根及甘油磷酸根。在一些实施方式中，该组合物还包含对atp再生有效的底物，该底物为选自如下的至少一个：腺苷、果糖、核糖及腺嘌呤。在某些实施方式中，该组成物还包含至少一种选自于edta或维生素e的调节凋亡诱导的细胞死亡的试剂。

8、在一些实施方式中，该冷冻保存培养基包含10％ dmso。

9、在另一方面，本文提供了一种肿瘤样本组合物，其包含：a)含有多个肿瘤细胞及多个肿瘤浸润淋巴细胞(til)的肿瘤样本；以及b)低温储存培养基。该储存培养基包含：i)无血清、无动物组分的冷冻保存培养基；和ii)抗生素，该抗生素包含：1)抗生素组合，该抗生素组合选自：i)庆大霉素及万古霉素；和ii)庆大霉素及克林霉素；或2)为万古霉素的抗生素。

10、在一些实施方式中，该肿瘤样本为实体瘤肿瘤样本。在某些实施方式中所述肿瘤样本为如下癌症类型的一种：乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌、皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌及黑色素瘤)、宫颈癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肉瘤、膀胱癌及胶质母细胞瘤。

11、在一些实施方式中，所述肿瘤组织样本为液体肿瘤样本。在一些实施方式中，所述液体肿瘤样本为来自血液恶性肿瘤的液体肿瘤样本。

12、在一些实施方式中，所述肿瘤样本从原发性肿瘤中获得。在某些实施方式中，所述肿瘤样本是从侵袭性肿瘤中获得。在一些实施方式中，所述肿瘤样本从转移性肿瘤中获得。在一些实施方式中，所述肿瘤样本从恶性黑色素瘤中获得。

13、在一些实施方式中，所述多个til包含至少90％的活细胞。

14、在某些实施方式中，万古霉素的浓度为约50-600μg/ml。在某些实施方式中，万古霉素的浓度为约100μg/ml。在一些实施方式中，克林霉素的浓度为约400-600μg/ml。在某些实施方式中，庆大霉素的浓度为约50μg/ml。在一些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素和约400-600μg/ml的克林霉素。在一些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素和约50-600μg/ml的万古霉素。在一些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素和约100μg/ml的万古霉素。

15、在一些实施方式中，所述抗生素组分还包含抗真菌性抗生素。在一些实施方式中，所述抗真菌性抗生素为双性霉素b。在一些实施方式中，所述双性霉素b的浓度为约2.5-10μg/ml。

16、在一些实施方式中，所述冷冻保存培养基包含：i)一种以上选自钾离子、钠离子、镁离子和钙离子的电解质；和ii)在生理条件及低温条件下有效的生物ph缓冲液。

17、在一些实施方式中，所述钾离子的浓度在约35-45mm范围内，所述钠离子的浓度在约80-120mm范围内，所述镁离子的浓度在约2-10mm范围内，并且，所述钙离子的浓度在约0.01-0.1mm范围内。

18、在一些实施方式中，所述组合物还包含营养有效量的至少一种单糖。

19、在某些实施方式中，所述组合物还包含不可透过细胞膜且在冷暴露期间有效抵抗细胞膨胀的不透过性阴离子，所述阴离子选自如下：乳糖酸根、葡糖酸根、柠檬酸根和甘油磷酸根。

20、在一些实施方式中，所述组合物还包含对atp再生有效的底物，所述底物为选自如下中的至少一个：腺苷、果糖、核糖和腺嘌呤。

21、在一些实施方式中，所述组合物还包含至少一种调节凋亡诱导的细胞死亡的试剂，所述试剂选自edta或维生素e。

22、在某些实施方式中，所述冷冻保存培养基包含10％dmso。

23、在另一方面，本文提供了一种细胞培养基组合物，其包含：a)基础培养基；b)谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物；c)血清；以及d)抗生素组分。该基础培养基包含：i)葡萄糖、ii)多种盐，以及多种氨基酸和维生素。该抗生素组分选自：包含以下的抗生素组分：1)抗生素组合，该抗生素组合选自：i)庆大霉素和万古霉素；和ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。

24、在另一方面，本文提供了一种细胞培养基组合物，其包含：a)基础培养基；b)血清白蛋白；c)胆固醇nf；d)可选的谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物；以及d)抗生素组分。该基础培养基包含：i)葡萄糖、ii)多种盐，以及iii)多种氨基酸和维生素。该抗生素包含：1)抗生素组合，其选自：i)庆大霉素和万古霉素；和ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。

25、在另一方面，本文提供了一种细胞培养基，其包含：a)成分确定的培养基或无血清培养基；b)可选的转铁蛋白；c)可选的胰岛素；d)可选的白蛋白；e)胆固醇nf；f)可选的谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物；以及g)抗生素组分。该成分确定的培养基或无血清培养基包含：i)葡萄糖、ii)多种盐，以及iii)多种氨基酸和维生素。该抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自：i)庆大霉素和万古霉素；和ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。

26、在一些实施方式中，所述细胞培养基包含(可选的重组的)转铁蛋白、(可选的重组的)胰岛素和(可选的重组的)白蛋白。

27、在一些实施方式中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含基础细胞培养基及血清补充剂和/或血清替代物。

28、在某些实施方式中，所述基础细胞培养基包括ctstmoptmizertmt细胞扩增基础培养基、ctstmoptmizertmt细胞扩增sfm、ctstmaim-v培养基，ctstmaim-vsfm，lymphoonetmt细胞扩增无外源物质培养基、杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(dulbecco's modifiedeagle's medium，dmem)、最低必需培养基(mem)、伊格尔氏基础培养基(basal mediumeagle，bme)、rpmi 1640、f-10、f-12、最低必需培养基(αmem)，格拉斯哥氏最低必须培养基(glasgow's minimal essential medium，g-mem)、rpmi生长培养基或伊斯科夫氏改良型杜尔贝科氏培养基(iscove's modified dulbecco'smedium)。

29、在一些实施方式中，所述血清补充剂或血清替代物选自于如下：ctstmoptmizer t细胞扩增血清补充剂和ctstm免疫细胞血清替代物。

30、在某些实施方式中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上白蛋白或白蛋白替代物。在一些实施方式中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上转铁蛋白或转铁蛋白替代物。

31、在某些实施方式中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上胰岛素或胰岛素替代物。在一些实施方式中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上抗氧化剂。在一些实施方式中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上胶原蛋白前体和一种以上微量元素。在某些实施方式中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含选自如下的一种以上成分：甘氨酸、l-组氨酸、l-异亮氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-羟脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸、l-缬氨酸、硫胺素、还原型谷胱甘肽、l-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分的化合物，所述微量元素部分为ag+、al3+、ba2+、cd2+、co2+、cr3+、ge4+、se4+、br、t、mn2+、p、si4+、v5+、mo6+、ni2+、rb+、sn2+、zr4+。在某些实施方式中，所述成分确定的培养基或无血清培养基还包含l-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。

32、在一些实施方式中，万古霉素的浓度为约50-600μg/ml。在一些实施方式中，万古霉素的浓度为约100μg/ml。在一些实施方式中，克林霉素的浓度为约400-600μg/ml。在一些实施方式中，庆大霉素的浓度为约50μg/ml。在某些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素和约400-600μg/ml的克林霉素。在一些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素和约50-600μg/ml的万古霉素。在一些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素和约100μg/ml的万古霉素。

33、在某些实施方式中，所述基础培养基为rpmi 1640培养基、dmem培养基或它们的组合。在一些实施方式中，所述基础培养基为dmem培养基。在一些实施方式中，所述谷氨酰胺衍生物为l-丙氨酸-l-谷氨酰胺(gutamax)。在某些实施方式中，所述谷氨酰胺为l-谷氨酰胺。

34、在一些实施方式中，所述血清为人ab血清。

35、在一些实施方式中，所述细胞培养基还包含il-2。在某些实施方式中，il-2是浓度为3,000-6,000iu/ml的il-2。

36、在一些实施方式中，所述细胞培养基还包含抗cd3抗体。在某些实施方式中，所述抗cd3抗体是浓度为30ng/ml的okt-3。

37、在一些实施方式中，所述细胞培养基还包含抗原呈递饲养细胞。

38、在某些实施方式中，所述细胞培养基还包含6,000iu/ml il-2。

39、在一些实施方式中，所述细胞培养基还包含3,000iu/ml il-2和30ng/ml okt-3。在一些实施方式中，所述细胞培养基还包含3,000iu/ml il-2、30ng/ml okt-3和抗原呈递饲养细胞。

40、在某些实施方式中，所述细胞培养基还包含6,000iu/ml il-2、30ng/ml okt-3和抗原呈递饲养细胞。

41、在一些实施方式中，所述细胞培养基还包含3,000iu/ml il-2。

42、在另一方面，本文提供了一种肿瘤浸润淋巴细胞组合物，其包含多个肿瘤浸润淋巴细胞和本文提供的任何细胞培养基。在一些实施方式中，所述多个til展现出至少90％的活细胞。在某些实施方式中，所述多个til展现出与不含万古霉素和克林霉素的对照肿瘤浸润淋巴细胞组合物相似的记忆性til群。在一些实施方式中，所述多个til展现出与不含万古霉素和克林霉素的对照肿瘤浸润淋巴细胞组合物相似的分化cd3+/cd4+、活化cd3+/cd4+和耗竭cd3+/cd4+til群。在某些实施方式中，所述多个til展现出与不含万古霉素和克林霉素的对照肿瘤浸润淋巴细胞组合物相似的分化cd3+/cd8+、活化cd3+/cd8+和耗竭cd3+/cd8+til群。

43、在另一方面，本文提供了一种用于扩增t细胞的方法，其包括通过如下方式由获自受试者的肿瘤样本来扩增第一t细胞群：在包含抗生素组分的培养基中培养获自受试者的肿瘤样本中的第一t细胞群，实现所述第一t细胞群的生长，其中所述抗生素组分包含：1)抗生素组合，所述抗生素组合选自i)庆大霉素和万古霉素，以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。

44、在一些实施方式中，所述培养基包含il-2。在一些实施方式中，所述第一t细胞群培养约7至14天的时间段。

45、在另一方面，本文提供了一种用于快速扩增t细胞的方法，其包括使第一t细胞群与包含il-2、okt-3(抗cd3抗体)、抗原呈递细胞(apc)和抗生素组分的细胞培养基接触，实现所述第一t细胞群的快速生长，由此产生第二t细胞群，其中所述快速扩增进行约7至14天的时间段，并且所述抗生素组分包含：1)抗生素组合，所述抗生素组合选自：i)庆大霉素和万古霉素，以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。在一些实施方式中，所述培养基还包含il-15和il-21。在某些实施方式中，万古霉素的浓度为约50-600μg/ml。在某些实施方式中，万古霉素的浓度为约100μg/ml。在一些实施方式中，克林霉素的浓度为约400-600μg/ml。在一些实施方式中，庆大霉素的浓度为约50μg/ml。在某些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素和约400-600μg/ml的克林霉素。在一些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素和约50-600μg/ml的万古霉素。在一些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素和约100μg/ml的万古霉素。

46、在另一方面，本文提供了用于将肿瘤浸润淋巴细胞(til)扩增为治疗性til群的方法，其包括：a)提供自受试者的切除肿瘤获得的包含多个肿瘤细胞和til的样本；b)通过将所述样本处理成多个碎片，获得第一til群；c)将所述片段添加至密闭系统中；d)通过在第一细胞培养基中培养所述第一til群来进行第一扩增，产生第二til群，其中所述第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，所述第一扩增进行约3-14天以获得第二til群，自步骤c)至步骤d)的转变在不打开系统的情况下发生，以及所述第一细胞培养基包含il-2和第一抗生素组分；e)通过在第二细胞培养基中培养第二til群来进行第二扩增，产生第三til群，其中，所述第二扩增进行约7-14天以获得第三til群，所述第三til群为治疗性til群，所述第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤d)至步骤e)的转变在不打开系统的情况下发生，所述第二细胞培养基包含il-2、okt-3、抗原呈递细胞(apc)及可选的第二抗生素组分；f)收集自步骤e)获得的治疗性til群，自步骤e)至步骤f)的转变在不打开系统的情况下发生；以及g)将自步骤f)收集的til群中的治疗性群转移至输注袋，其中，自步骤f)至步骤g)的转移在不打开系统的情况下发生；所述第一抗生素组分和可选的第二抗生素组分包含：1)抗生素组合，所述抗生素组合选自：i)庆大霉素和万古霉素，以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。

47、在一些实施方式中，在步骤d)之前，所述方法还包括以下步骤：(i)在包含il-2和可选的第一抗生素组分的培养基中培养第一til群，获得自所述多个肿瘤碎片释放的til；(ii)将步骤(i)中至少多个自多个肿瘤碎片释放的til与多个肿瘤碎片分离，获得多个肿瘤碎片、残留在多个肿瘤碎片中的til和自多个肿瘤碎片释放并在分离之后保留在其中的任何til的混合物；以及(iii)可选地消化所述多个肿瘤碎片、残留在所述多个肿瘤碎片中的til和自所述多个肿瘤碎片释放且在所述分离之后保留在其中的任何til的混合物，产生所述混合物的消化物，其中在步骤(d)中，将所述混合物或混合物的消化物在第一细胞培养基中培养，获得所述第二til群。

48、在一些实施方式中，在步骤(d)中进行的第一扩增包括：(i)在第一细胞培养基中培养第一til群约3-14天，获得自所述肿瘤碎片释放的til；(ii)将步骤(i)中至少多个自肿瘤碎片释放的til与所述肿瘤碎片分离，获得第二til群，所述第二til群为所述肿瘤碎片、残留在肿瘤碎片中的til和自肿瘤碎片释放且在分离之后保留在其中的任何til的混合物形式；以及(iii)可选地消化所述肿瘤碎片、残留在所述肿瘤碎片中的til和自所述肿瘤碎片释放且在分离之后保留在其中的任何til的混合物，产生所述混合物的消化物，其中在步骤e)中，所述第二扩增通过在第二培养基中扩增呈混合物或混合物的消化物形式的第二til群约7-14天来进行，由此产生第三til群。

49、在另一方面，本文提供了一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(til)扩增为治疗性til群的方法，其包括：a)提供第一til群，该第一til群由手术切除、穿刺活体组织切片(needlebiopsy)、粗针活体组织切片(core biopsy)、小型活体组织切片或用于自受试者获得包含肿瘤和til的第一混合物的样本的其他方式获得；b)在第一细胞培养基中进行第一til群的起始第一扩增，获得第二til群，其中，所述第一细胞培养基包含il-2、可选的okt-3(抗cd3抗体)、可选的抗原呈递细胞(apc)和第一抗生素组分，其中所述起始第一扩增进行约1至7或8天的时间段，所述第二til群的数量大于第一til群的数量；c)在第二细胞培养基中进行第二til群的快速第二扩增，获得治疗性til群，其中所述第二细胞培养基包含il-2、okt-3、可选的第二抗生素组分和apc；所述快速第二扩增进行约1至11天的时间段；以及d)收集治疗性til群，其中所述第一抗生素组分和所述第二抗生素组分包含：1)抗生素组合，所述抗生素组合选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。

50、在一些实施方式中，所述快速第二扩增进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天的时间段。在一些实施方式中，在步骤b)中，所述第一细胞培养基还包含apc，并且步骤c)中的第二培养基中apc的数量大于步骤b)中的第一培养基中apc的数量。

51、在一些实施方式中，在步骤(d)之前，所述方法还包括以下步骤：(i)在包含il-2和可选的第一抗生素组分的培养基中培养第一til群，获得自所述样本释放的til；(ii)将步骤(i)中至少多个自样本释放的til与样本分离，获得样本、残留在样本中的til和自样本释放并在分离之后保留在其中的任何til的第二混合物；以及(iii)可选地消化所述样本、残留在所述样本中的til和自所述样本释放且在所述分离之后保留在其中的任何til的第二混合物，产生所述第二混合物的消化物；其中步骤(b)包括在第一细胞培养基中对呈第二混合物或第二混合物的消化物形式的第一til群进行起始第一扩增，获得所述第二til群。

52、在一些实施方式中，步骤(a)包括通过自受试者的肿瘤中切除样本并将所述样本处理成含有来自所述受试者的肿瘤和til的混合物的多个肿瘤碎片，来提供第一til群。

53、在某些实施方式中，在步骤(b)之前，所述方法还包括如下步骤：(i)在包含il-2和可选的第一抗生素组分的培养基中培养第一til群，获得自所述多个肿瘤碎片释放的til；(ii)将步骤(i)中至少多个自样本释放的til与所述多个肿瘤碎片分离，获得样本、残留在多个肿瘤碎片中的til和自多个肿瘤碎片释放且在分离之后保留在其中的任何til的第二混合物；以及(iii)可选地消化所述多个肿瘤碎片、残留在所述多个肿瘤碎片中的til和自所述多个肿瘤碎片释放且在分离之后保留在其中的任何til的第二混合物，产生所述第二混合物的消化物；步骤(b)包括在第一细胞培养基中对呈第二混合物或第二混合物的消化物形式的第一til群进行起始第一扩增，获得第二til群。

54、在另一方面，本文提供了一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)的方法，其包括：a)通过在包含第一抗生素组分的第一培养基中培养第一til群以实现第一til群的生长并启动其活化，来进行第一til群的起始第一扩增，第一til群由手术切除、穿刺活体组织切片、粗针活体组织切片、小型活体组织切片或用于自受试者获得包含肿瘤和til的混合物的样本的其他方式获得；b)在步骤(a)中启动第一til群的活化之后，通过在可选的包含第二抗生素组分的第二培养基中培养第一til群以实现第一til群的生长且增强其活化，来进行第一til群的快速第二扩增，获得第二til群，其中所述第二til群为治疗性til群；以及c)收集治疗性til群，其中所述第一抗生素组分和所述第二抗生素组分包含：i)抗生素组合，所述抗生素组合选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。

55、在一些实施方式中，在步骤(s)中，所述第一培养基还包含il-2和okt-3(抗cd3抗体)，以及可选的抗原呈递细胞(apc)，并且在步骤(b)中，第二培养基还包含il-2、okt-3及apc。

56、在另一方面，本文提供了一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(til)扩增为治疗性til群的方法，其包括：a)提供第一til群，第一til群由手术切除、穿刺活体组织切片、粗针活体组织切片、小型活体组织切片或用于自受试者获得包含肿瘤和til的第一混合物的样本的其他方式获得；b)在第一细胞培养基中进行第一til群的第一扩增，获得第二til群，其中，所述第一细胞培养基包含il-2和第一抗生素组分，所述第一扩增进行约3至14天的时间段，所述第二til群的数量大于第一til群的数量；c)在第二细胞培养基中进行第二til群的第二扩增，获得治疗性til群，其中所述第二细胞培养基包含il-2、okt-3、可选的第二抗生素组分和抗原呈递细胞(apc)；所述第二扩增进行约7至14天的时间段；以及d)收集治疗性til群，其中所述第一抗生素组分和所述第二抗生素组分包含：1)抗生素组合，所述抗生素组合选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。

57、在一些实施方式中，所述第一扩增进行约11天的时间段。在某些实施方式中，所述第二扩增进行约11天的时间段。在一些实施方式中，所述第一扩增和所述第二扩增进行约22天的时间段。在某些实施方式中，在步骤b)之前，所述方法还包括如下步骤：(i)在包含il-2和可选的第一抗生素组分的培养基中培养第一til群，获得自所述样本释放的til；(ii)将步骤(i)中至少多个自样本释放的til与所述样本分离，获得样本、残留在样本中的til和自样本释放且在分离之后保留在其中的任何til的第二混合物；以及(iii)可选地消化所述样本、残留在所述样本中的til和自所述样本释放且在分离之后保留在其中的任何til的第二混合物，产生所述第二混合物的消化物；其中步骤b)包括在第一细胞培养基中对呈第二混合物或第二混合物的消化物形式的第一til群进行起始第一扩增，获得第二til群。

58、在一些实施方式中，在步骤b)中进行的第一扩增包括：(i)在第一细胞培养基中培养第一til群约3-14天，获得自所述样本释放的til；(ii)将步骤(i)中至少多个自样本释放的til与所述样本分离，获得第二til群，所述第二til群为所述样本、残留在样本中的til和自样本释放且在分离之后保留在其中的任何til的第二混合物形式；以及(iii)可选地消化所述样本、残留在所述样本中的til和自所述样本释放且在分离之后保留在其中的任何til的第二混合物，产生所述第二混合物的消化物；并且在步骤c)中，所述第二扩增通过在第二培养基中扩增呈第二混合物或第二混合物的消化物形式的第二til群约7-11天来进行，由此产生治疗性til群。

59、在一些实施方式中，步骤a)包括通过自受试者的肿瘤中切除样本并将所述样本处理成含有来自所述受试者的肿瘤和til的混合物的多个肿瘤碎片，来提供第一til群。

60、在一些实施方式中，在步骤b)之前，所述方法还包括如下步骤：(i)在包含il-2和可选的第一抗生素组分的培养基中培养第一til群，获得自所述多个肿瘤碎片释放的til；(ii)将步骤(i)中至少多个自样本释放的til与所述多个肿瘤碎片分离，获得样本、残留在多个肿瘤碎片中的til和自多个肿瘤碎片释放且在分离之后保留在其中的任何til的第二混合物；以及(iii)可选地消化所述多个肿瘤碎片、残留在所述多个肿瘤碎片中的til和自所述多个肿瘤碎片释放且在分离之后保留在其中的任何til的第二混合物，产生所述第二混合物的消化物；步骤b)包括在第一细胞培养基中对呈第二混合物或第二混合物的消化物形式的第一til群进行第一扩增，由此产生第二til群。

61、在一些实施方式中，在步骤b)中进行的第一扩增包括：(i)在第一细胞培养基中培养第一til群约3-14天，获得自所述肿瘤碎片释放的til；(ii)将步骤(i)中至少多个自肿瘤碎片释放的til与所述肿瘤碎片分离，获得第二til群，所述第二til群为所述肿瘤碎片、残留在肿瘤碎片中的til和自肿瘤碎片释放且在分离之后保留在其中的任何til的第二混合物形式；以及(iii)可选地消化所述肿瘤碎片、残留在所述肿瘤碎片中的til和自所述肿瘤碎片释放且在分离之后保留在其中的任何til的第二混合物，产生所述第二混合物的消化物；在步骤c)中，所述第二扩增通过在第二培养基中扩增呈第二混合物或第二混合物的消化物形式的第二til群约7-14天来进行，由此产生治疗性til群。

62、在一些实施方式中，所述第一细胞培养基和/或所述第二细胞培养基还包含il-15和il-21。

63、在一些实施方式中，万古霉素的浓度为约500-600μg/ml。在一些实施方式中，万古霉素的浓度为约100μg/ml。在某些实施方式中，克林霉素的浓度为约400-600μg/ml。

64、在示例性实施方式中，庆大霉素的浓度为约50μg/ml。在一些实施方式中，庆大霉素的浓度为约50μg/ml。在某些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素和约400-600μg/ml的克林霉素。在一些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素和约50-600μg/ml的万古霉素。在一些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素和约100μg/ml的万古霉素。

65、在一些实施方式中，通过在第一细胞培养基中进行第一扩增获得的til群展现出至少90％的活细胞。

66、在某些实施方式中，与通过在不含万古霉素和克林霉素的对照细胞培养基中进行til扩增获得的til群相比，通过在第一细胞培养基中进行第一扩增获得的til群展现出相似的记忆性til群。

67、在一些实施方式中，与通过在不含万古霉素和克林霉素的对照细胞培养基中进行til扩增获得的til群相比，通过在第一细胞培养基中进行第一扩增获得的til群展现出相似的分化cd3+/cd4+、活化cd3+/cd4+和耗竭cd3+/cd4+til群。在一些实施方式中，与通过在不含万古霉素和克林霉素的对照细胞培养基中进行til扩增获得的til群相比，通过在第一细胞培养基中进行第一扩增获得的til群展现出相似的分化cd3+/cd8+、活化cd3+/cd8+和耗竭cd3+/cd8+til群。

68、在某些实施方式中，所述第一细胞培养基包含约6,000iu/ml il-2。

69、在一些实施方式中，所述第一细胞培养基还包含okt-3和抗原呈递饲养细胞。在某些实施方式中，所述第一细胞培养基包含6,000iu/ml il-2和30ng/ml okt-3。在一些实施方式中，第二细胞培养基包含3,000iu/ml il-2和30ng/ml okt-3。在某些实施方式中，第二细胞培养基包含6,000iu/ml il-2和30ng/ml okt-3。

70、在一些实施方式中，所述样本提供于低温储存培养基中，所述低温储存培养基包含：a)无血清、无动物组分的冷冻保存培养基；和b)抗生素组分，所述抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。

71、在某些实施方式中，所述第一til群自受试者的样本获得，所述样本提供于低温储存培养基中，所述低温储存培养基包含：a)无血清、无动物组分的冷冻保存培养基；和b)抗生素，所述抗生素包括：1)抗生素组合，其选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。

72、在一些实施方式中，所述低温储存培养基中万古霉素的浓度为约50-600μg/ml。在一些实施方式中，所述低温储存培养基中万古霉素的浓度为约100μg/ml。在一些实施方式中，所述低温储存培养基中克林霉素的浓度为约400-600μg/ml。在某些实施方式中，所述低温储存培养基中庆大霉素的浓度为约50μg/ml。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素和约400-600μg/ml的克林霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素和约50μg/ml的万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素和约100μg/ml的万古霉素。在某些实施方式中，所述低温储存培养基中双性霉素b的浓度为约2.5-10μg/ml。

73、在一些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素、约2.5-10μg/ml双性霉素b和约400-600μm的克林霉素。在某些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素、约2.5-10μg/ml双性霉素b和约50-600μg/ml的万古霉素。在某些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素、约2.5-10μg/ml双性霉素b和约100μg/ml的万古霉素。

74、在另一方面，本文提供了一种根据本文所述方法中任一种制得的治疗性til群。

75、在一个方面，本文提供了一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(til)扩增为治疗性til群的方法，其包括：a)通过将自受试者获得的肿瘤样本消化成肿瘤消化物而自受试者的切除肿瘤获得和/或接收第一til群；b)自步骤a)中呈肿瘤消化物形式的第一til群中选择pd-l阳性til，获得富含pd-l的til群；c)通过在包含il-2、okt-3、第一抗生素组分和抗原呈递细胞(apc)的第一细胞培养基中培养所述富含pd-1的til群来进行起始第一扩增，获得第二til群，其中，所述起始第一扩增在包含第一透气表面区域的容器中进行，所述起始第一扩增进行约1至7或8天的第一时间段以获得第二til群，所述第二til群的数量大于第一til群的数量；d)通过在包含il-2、okt-3、第二抗生素组分和apc的第二细胞培养基中培养第二til群来进行快速第二扩增，获得治疗性til群，其中在所述快速第二扩增中添加的apc的数量是在步骤b)中添加的apc数量的至少两倍，所述快速第二扩增进行约1至11天的第二时间段以获得治疗性til群，所述快速第二扩增在包含第二透气表面区域的容器中进行；e)收集自步骤d)获得的治疗性til群；以及f)将自步骤e)收集的til群转移至输注袋，其中所述第一抗生素组分和所述第二抗生素组分包含：1)抗生素组合，所述抗生素组合选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。

76、在一些实施方式中，万古霉素的浓度为约50-600μg/ml。在一些实施方式中，万古霉素的浓度为约100μg/ml。在某些实施方式中，克林霉素的浓度为约400-600μg/ml。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/ml庆大霉素及约400-600μg/ml克林霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/ml庆大霉素及约50-600μg/ml万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/ml庆大霉素及约100μg/ml万古霉素。在一些实施方式中，庆大霉素的浓度为约50μg/ml。在某些实施方式中，第二til群展示出至少90％的活细胞。

77、在一些实施方式中，所述第二til群展现出与第一til群在不含万古霉素和克林霉素的对照第一细胞培养基中进行扩增获得的第二til群相似的记忆性til群。

78、在一些实施方式中，所述第二til群展现出与第一til群在不含万古霉素和克林霉素的对照第一细胞培养基中进行扩增获得的第二til群相似的分化cd3+/cd4+、活化cd3+/cd4+和耗竭cd3+/cd4+til群。

79、在一些实施方式中，所述第二til群展现出与第一til群在不含万古霉素和克林霉素的对照第一细胞培养基中进行扩增获得的第二til群相似的分化cd3+/cd8+、活化cd3+/cd8+和耗竭cd3+/cd8+til群。

80、在某些实施方式中，第一细胞培养基包含6,000iu/ml il-2。在一些实施方式中，第一细胞培养基包含6,000iu/ml il-2和30ng/ml okt-3。

81、在某些实施方式中，第二细胞培养基包含6,000iu/ml il-2和30ng/ml okt-3。

82、在一些实施方式中，步骤a)中的肿瘤样本提供于低温储存培养基中，所述低温储存培养基包含：a)无血清、无动物组分的冷冻保存培养基；和b)抗生素组分，所述抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。

83、在一些实施方式中，低温储存培养基中万古霉素的浓度为约50-600μg/ml。在一些实施方式中，低温储存培养基中万古霉素的浓度为约100μg/ml。在一些实施方式中，低温储存培养基中克林霉素的浓度为约400-600μg/ml。在某些实施方式中，低温储存培养基中庆大霉素的浓度为约50μg/ml。在某些实施方式中，抗生素组分还包含双性霉素b。在示例性实施方式中，低温储存培养基中双性霉素b的浓度为约2.5-10μg/ml。

84、在一些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素、约2.5-10μg/ml的双性霉素b和约400-600μg/ml的克林霉素。在某些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素、约2.5-10μg/ml的双性霉素b和约50-600μg/ml的万古霉素。在某些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素、约2.5-10μg/ml的双性霉素b和约100μg/ml的万古霉素。

85、在另一方面，本文提供了一种根据本文所述方法中的任一种制得的治疗性til群。

86、在一个方面，本文提供了一种用于扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(pbl)的方法，所述方法包括以下步骤：a)自患者的外周血获得外周血单核细胞(pbmc)的样本；b)在包含第一细胞培养基的培养物中培养所述pbmc选自如下的时间段：约9天、约10天、约11天、约12天、约13天和约14天，由此实现来自所述pbmc的外周血淋巴细胞(pbl)的扩增，所述第一细胞培养基具有il-2、抗cd3/抗cd28抗体和第一抗生素组合；以及c)自步骤b)中的培养物中收集所述pbl，其中所述第一抗生素组分包含：i)抗生素组合，所述抗生素组合选自：1)庆大霉素和万古霉素，以及2)庆大霉素和克林霉素；或者ii)为万古霉素的抗生素。

87、在一些实施方式中，患者用依鲁替尼(ibrutinib)或另一种白介素-2诱导性t细胞激酶(itk)抑制剂预治疗。在某些实施方式中，患者难以用依鲁替尼或另一种itk抑制剂治疗。

88、在一些实施方式中，低温储存培养基中万古霉素的浓度为约50-600μg/ml。在一些实施方式中，低温储存培养基中万古霉素的浓度为约100μg/ml。在一些实施方式中，低温储存培养基中克林霉素的浓度为约400-600μg/ml。在某些实施方式中，低温储存培养基中庆大霉素的浓度为约50μg/ml。在某些实施方式中，低温储存培养基中双性霉素b的浓度为约2.5-10μg/ml。

89、在一些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素、约2.5-10μg/ml的双性霉素b和约400-600μg/ml的克林霉素。在某些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素、约2.5-10μg/ml的双性霉素b和约50-600μg/ml的万古霉素。在某些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素、约2.5-10μg/ml的双性霉素b和约100μg/ml的万古霉素。

90、在一些实施方式中，自步骤(c)中培养物收集的pbl展现出至少90％的活细胞。

91、在某些实施方式中，与在不含万古霉素和克林霉素的对照细胞培养基中进行pbmc群扩增获得的pbl群相比，自步骤(c)中培养物收集的pbl展现出相似的分化cd3+/cd4+、活化cd3+/cd4+和耗竭cd3+/cd4+til群。在一些实施方式中，与在不含万古霉素和克林霉素的对照细胞培养基中进行pbmc群扩增获得的pbl群相比，自步骤(c)中培养物收集的pbl展现出相似的分化cd3+/cd8+、活化cd3+/cd8+和耗竭cd3+/cd8+til群。

92、在某些实施方式中，所述第一细胞培养基包含3,000iu/ml il-2。

93、在一些实施方式中，抗cd3抗体和抗cd28抗体与珠子缀合。在一些实施方式中，所述珠子与所述pbmc以3个珠子：1个pmbc细胞的比率混合于培养物中。

94、在某些实施方式中，步骤b)包括将pbmc和珠子的混合物以约25,000个细胞/cm2至约50,000个细胞/cm2的密度接种于透气表面上，在第一细胞培养基中培养约4天，将il-2添加至第一细胞培养基中，培养约5天至约7天，获得扩增的pbl。

95、在一些实施方式中，步骤a)中的pbmc提供于低温储存培养基中，所述低温储存培养基包含：a)无血清、无动物组分的冷冻保存培养基；和b)抗生素组分，所述抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。

96、在某些实施方式中，低温储存培养基中万古霉素的浓度为约50-600μg/ml。在某些实施方式中，低温储存培养基中万古霉素的浓度为约100μg/ml。在一些实施方式中，低温储存培养基中克林霉素的浓度为约400-600μg/ml。在某些实施方式中，低温储存培养基中庆大霉素的浓度为约50μg/ml。在一些实施方式中，低温储存培养基还包含双性霉素b。在示例性实施方式中，低温储存培养基中双性霉素b的浓度为约2.5-10μg/ml。

97、在某些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素、约2.5-10μg/ml的双性霉素b和约400-600μg/ml的克林霉素。

98、在一些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素、约2.5-10μg/ml的双性霉素b和约50-600μg/ml的万古霉素。在一些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/ml的庆大霉素、约2.5-10μg/ml的双性霉素b和约100μg/ml的万古霉素。

99、在一些实施方式中，在培养第一til群之前，将样本在肿瘤洗涤缓冲液中洗涤至少一次，所述洗涤缓冲液包含抗生素组分，所述抗生素组分包含：1)抗生素组合，所述抗生素组合选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。

100、在一些实施方式中，在所述洗涤缓冲液中的所述抗生素组分包含约100-600μg/ml浓度的万古霉素。在某些实施方式中，在所述洗涤缓冲液中的所述抗生素组分包含约400-600μg/ml浓度的克林霉素。在一些实施方式中，在所述洗涤缓冲液中的所述抗生素组分包含约100μg/ml浓度的万古霉素。在示例性实施方式中，所述抗生素组分为在所述洗涤缓冲液中约100μg/ml浓度的万古霉素。在示例性实施方式中，在所述洗涤缓冲液中的所述抗生素组分包含约50-600μg/ml浓度的万古霉素。在一些实施方式中，在所述洗涤缓冲液中的所述抗生素组分包含约50μg/ml浓度的庆大霉素。在一些实施方式中，在洗涤缓冲液中的抗生素组分包含约2.5-10μg/ml浓度的双性霉素b。在一些实施方式中，在洗涤缓冲液中的抗生素组分包含的抗生素组合，所述抗生素组合包含约100μg/ml的万古霉素和约50μg/ml的庆大霉素。在一些实施方式中，在洗涤缓冲液中的抗生素组分包含的抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/ml的庆大霉素、约2.5-10μg/ml的双性霉素b和约400-600μg/ml的克林霉素。在一些实施方式中，在洗涤缓冲液中的抗生素组分包含的抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/ml的庆大霉素、约2.5-10μg/ml的双性霉素b和约100-600μg/ml的万古霉素。在示例性实施方式中，样本在所述洗涤缓冲液中洗涤至少三次。

101、在一些实施方式中，第一抗生素组分与洗涤缓冲液的抗生素组分相同。在一些实施方式中，第一抗生素组分与洗涤缓冲液的抗生素组分不同。在一些实施方式中，第一抗生素组分与第二抗生素组分相同。在一些实施方式中，第一抗生素组分与第二抗生素组分不同。在一些实施方式中，第一抗生素组分与低温储存培养基的抗生素组分相同。在一些实施方式中，第一抗生素组分与低温储存培养基的抗生素组分不同。

102、在另一方面，本文提供了肿瘤样本，其包含多个肿瘤细胞和多个肿瘤浸润淋巴细胞(til)；和肿瘤洗涤缓冲液，其包含：i)一种以上选自钾离子、钠离子、镁离子和钙离子的电解质；ii)在生理条件下有效的ph缓冲液；和iii)抗生素组分，所述抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。在一些实施方式中，肿瘤洗涤缓冲液在维持生理渗透压方面是有效的。在示例性实施方式中，ph缓冲液为磷酸盐缓冲液。在一些实施方式中，肿瘤洗涤缓冲液为汉克氏平衡盐溶液(hank's balanced salt solution，hbss)。

103、在某些实施方式中，肿瘤洗涤缓冲液还包含营养有效量的至少一种单糖。在一些实施方式中，所述单糖为葡萄糖。

104、在一些实施方式中，所述肿瘤样本为实体肿瘤样本。在示例性实施方式中，肿瘤样本为如下癌症类型之一：乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌、皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌及黑色素瘤)、宫颈癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肉瘤、膀胱癌及胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，肿瘤样本为液体肿瘤样本。在示例性实施方式中，所述液体肿瘤样本为来自血液恶性肿瘤的液体肿瘤样本。在一些实施方式中，所述肿瘤样本从原发性肿瘤中获得。在某些实施方式中，所述肿瘤样本是从侵袭性肿瘤中获得的。在一些实施方式中，所述肿瘤样本从转移性肿瘤中获得。在一些实施方式中，所述肿瘤样本从恶性黑色素瘤中获得。

105、在某些实施方式中，所述抗生素组分包含约50-600μg/ml浓度的万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约100μg/ml浓度的万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约400-600μg/ml浓度的克林霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/ml浓度的庆大霉素。在一些实施方式中，抗生素组分为约100μg/ml浓度的万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/ml的庆大霉素和约400-600μg/ml的克林霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/ml的庆大霉素和约100-600μg/ml的万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/ml的庆大霉素和约100μg/ml的万古霉素。

106、在一些实施方式中，所述抗生素组分还包含抗真菌性抗生素。在一些实施方式中，所述抗真菌性抗生素为双性霉素b。在一些实施方式中，所述双性霉素b的浓度为约2.5-10μg/ml。

107、在另一方面，本文提供了一种用于洗涤肿瘤样本的组合物，所述组合物包含：i)一种以上选自钾离子、钠离子、镁离子和钙离子的电解质；ii)在生理条件下有效的ph缓冲液；以及iii)抗生素组分，所述抗生素组分包含：a)抗生素组合，其选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。在一些实施方式中，肿瘤洗涤缓冲液在维持生理渗透压方面是有效的。在示例性实施方式中，ph缓冲液为磷酸盐缓冲液。在一些实施方式中，肿瘤洗涤缓冲液为汉克氏平衡盐溶液(hbss)。

108、在某些实施方式中，肿瘤洗涤缓冲液还包含营养有效量的至少一种单糖。在一些实施方式中，所述单糖为葡萄糖。

109、在某些实施方式中，所述抗生素组分包含约50-600μg/ml浓度的万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约100μg/ml浓度的万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约400-600μg/ml浓度的克林霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/ml浓度的庆大霉素。在一些实施方式中，抗生素组分为约100μg/ml浓度的万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/ml的庆大霉素和约400-600μg/ml的克林霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/ml的庆大霉素和约100-600μg/ml的万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/ml的庆大霉素和约100μg/ml的万古霉素。

110、在一些实施方式中，抗生素组分还包含抗真菌性抗生素。在一些实施方式中，所述抗真菌性抗生素为双性霉素b。在一些实施方式中，所述双性霉素b的浓度为约2.5-10μg/ml。

111、在另一方面，本文提供了一种根据本文所述方法中的任一种制得的pbl。