用于对细胞进行冷冻保护和冻干保护的方法与流程

本公开提供了对通过冷冻或冻干储存的细胞提供冷冻保护和/或冻干保护的方法。

背景技术：

1、人间充质干细胞(hmsc)是重要的多能干细胞，其具有(在体外)分化为不同的组织，如脂肪、肌肉、软骨、骨骼或神经细胞的能力[1-3]。hmsc在再生医学和细胞疗法中的用途正在扩大[4，5]。由于hmsc表现出免疫抑制能力[6]，因此其具有从成年供体中采集、扩增、修饰，并随后用于同种异体治疗的潜力[5]。为了实现这一点，hmsc必须储存持续很长的时间段。目前用于延长储存hmsc的方案是在液氮中冷冻保存[7]。然而，将细胞储存在液氮中既繁琐又昂贵[8]，尤其是在分配和运输方面，因为需要定期供应液氮以避免不受控制的解冻和对细胞的损害[9]。

2、hmsc的液氮储存还需要添加胎牛血清(fbs)和二甲基亚砜(dmso)来保存细胞[7，10]。dmso具有毒性[11-14]，并且可以改变hmsc中转录因子的表达和基因表达[15，16]。此外，fbs在人类中具有高度免疫原性，并且可以转移病原体[7]。因此，dmso和fbs通常在施用于人之前被去除，这是劳动密集型的并且需要经过专门培训的人员和特殊设施的过程。因此，存在不合标准的高风险和施用产品质量不一致的安全隐患。

3、与许多其它生物产品类似，将细胞疗法产品储存在冷藏温度下也是有益的，以促进更容易的处理和经济运输。实现这一点的一种可能方法是冻干(冷冻-干燥)细胞[18，19]。冻干通常应用于在液体调配物中不稳定，但在固体/干燥形式下稳定的(药物)产品，如疫苗、蛋白质、肽或抗生素[20]。

4、ep 3 403 502 a1公开了冷冻保护剂和/或冷冻保存剂组合物、方法以及其在保存和/或保护细胞、生物体和/或组织中的用途。

5、us 2009/123436 a1公开了用于对生物材料进行冷冻储存的组合物和相关方法。

6、wo 2021/050896 a1公开了一种产生冻干的细胞群的方法，所述方法包括：(a)冷冻包括细胞群、水性组分、多元醇、糖和多糖的组合物；以及(b)从冷冻的组合物中去除至少90％的水性组分以产生冻干的细胞群。

7、本发明的一个目的是提供用于对细胞进行冷冻保存和冻干的方法，所述方法允许细胞在储存期间保持存活。

技术实现思路

1、本公开涉及一种组合物，其包括活细胞群、水性组分、尿素和单糖。

2、在实施例中，所述组合物进一步包括疏松剂(bulking agent)。在实施例中，所述组合物进一步包括透明质酸凝胶。

3、在所述组合物的实施例中，所述单糖的浓度为约0.2m至约1.25m、或约0.3m至约0.8m、或约0.4m至约0.6m。

4、在所述组合物的实施例中，所述尿素的浓度为约0.2m至约1.25m、或约0.2m至约0.8m、或约0.4m至约0.6m。

5、在所述组合物的实施例中，所述单糖的浓度为约0.6m至约2.0m、或约0.7m至约1.7m、或约0.8m至约1.4m。

6、在所述组合物的实施例中，所述尿素的浓度为约0.6m至约2.0m、或约0.7m至约1.7m、或约0.8m至约1.4m。

7、在所述组合物的实施例中，所述组合物中的所述尿素与单糖的摩尔比为约5:1至约1:5、或约1:3至约3:1、或约1:2至约2:1、或约1:1。

8、在所述组合物的实施例中，所述单糖是葡萄糖、果糖或半乳糖。

9、在所述组合物的实施例中，所述疏松剂包括：a)二糖，其中所述二糖是蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、壳二糖、乳果糖、异麦芽糖蜜二糖或龙胆二糖；或b)糖醇，其中所述糖醇是甘露醇、山梨醇、半乳糖醇、岩藻糖醇、艾杜糖醇或肌醇；或c)二糖和糖醇两者；或d)蔗糖和甘露醇两者。

10、在所述组合物的实施例中，所述组合物不包括dmso，或者，其中所述组合物在冷冻前包括浓度为约1％至约10％的dmso，或者其中所述组合物在冷冻前包括浓度为约1％至约5％的dmso。

11、在所述组合物的实施例中，所述细胞群包括哺乳动物细胞。

12、在实施例中，所述组合物在约-10℃至约-100℃之间、或约-20℃至约-90℃之间或约-40℃至约-60℃之间的温度下处于冷冻状态。

13、在实施例中，所述组合物是冻干组合物。

14、根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述组合物含有小于约90％(vol/vol)的水。

15、在实施例中，本公开还涉及一种产生冷冻的细胞群的方法，所述方法包括冷冻如上所述的组合物以产生冷冻的细胞群的步骤(a)。

16、在实施例中，本公开还涉及一种产生复原的活细胞群的方法，所述方法包括冷冻如上所定义的组合物以产生冷冻的细胞群的步骤(a)和将所述冷冻的细胞群重新悬浮于复原剂中以形成复原组合物的步骤(b)，其中至少约1％的所述细胞是活的。

17、在实施例中，本公开还涉及一种产生冻干的细胞群的方法，所述方法包括冷冻如上所述的组合物的步骤(a)和从冷冻的组合物中去除至少约10％(vol/vol)的水以产生冻干的细胞群的步骤(b)。

18、在实施例中，本公开还涉及一种产生复原的活细胞群的方法，所述方法包括冷冻如上所定义的组合物的步骤(a)；从所述冷冻的组合物中去除至少约10％(vol/vol)的水以产生所述冻干的细胞群的步骤(b)；以及将所述冻干的细胞群重新悬浮于复原剂中以形成复原组合物的步骤(c)，其中至少约1％的所述细胞是活的。

19、在如上所述的方法的实施例中，在步骤(a)中冷冻之前，分离所述细胞群并使其与穿孔溶液接触。在实施例中，所述穿孔溶液包括海藻糖。在实施例中，所述穿孔溶液中的海藻糖的浓度为约0.1m至约1.0m或约0.1m至约0.6m。

20、本公开还涉及一种产生冷冻的细胞群的方法，所述方法包括：冷冻包括细胞群、水性组分、尿素、单糖和任选地疏松剂的组合物以产生冷冻的细胞群。

21、本公开还涉及一种产生复原的活细胞群的方法，所述方法包括：a)冷冻包括细胞群、水性组分、尿素、单糖和任选地疏松剂的组合物以产生冷冻的细胞群；以及b)将所述冷冻的细胞群重新悬浮于复原剂中以形成复原组合物，其中至少约1％的所述细胞是活的。

22、在所述方法的实施例中，所述组合物进一步包括水凝胶。在实施例中，所述水凝胶是生物相容性水凝胶。在实施例中，所述水凝胶是透明质酸凝胶、藻酸盐凝胶、琼脂糖凝胶、胶原凝胶或其组合。

23、在实施例中，所述细胞群悬浮在所述水凝胶中。

24、在所述方法的实施例中，冷冻前所述单糖的浓度为约0.6m至约2m、或约0.7m至约1.7m、或约0.8m至约1.4m。

25、在所述方法的实施例中，所述单糖是葡萄糖、果糖或半乳糖。

26、在所述方法的实施例中，所述单糖是葡萄糖，并且冷冻前所述葡萄糖的浓度为约0.2m至约1.0m、或约0.2m至约0.8m、或约0.4m至约0.6m。

27、在所述方法的实施例中，冷冻前所述尿素的浓度为约0.2m至约1.0m、或约0.2m至约0.8m、或约0.4m至约0.6m。

28、在所述方法的实施例中，冷冻前尿素与单糖的摩尔比为约1:3至约3:1、或约1:2至约2:1、或约1:1。

29、在所述方法的实施例中，所述单糖是葡萄糖，并且冷冻前尿素与葡萄糖的摩尔比为约1:3至约3:1、或约1:2至约2:1、或约1:1。

30、在所述方法的实施例中，冷冻是用悬浮液中或附着到容器的表面上的细胞，或用悬浮在所述水凝胶中的细胞群，和/或在具有或不具有胶原涂层的容器中进行的，任选地，其中所述容器是具有或不具有用于细胞附着或生长的膜的玻璃或塑料容器。

31、本公开还涉及一种产生冻干的细胞群的方法，所述方法包括：a)冷冻包括细胞群、透明质酸凝胶、水性组分、尿素、单糖和疏松剂的组合物，其中冷冻前所述单糖的浓度为至少约0.6m，并且冷冻前尿素的浓度为至少约0.6m；以及b)从冷冻的组合物中去除至少90％的水性组分以产生冻干的细胞群。

32、本公开还涉及一种产生冻干的细胞群的方法，所述方法包括：a)冷冻包括细胞群、透明质酸凝胶、水性组分、尿素、单糖和疏松剂的组合物，其中冷冻前所述单糖的浓度为至少约0.6m，并且冷冻前尿素的浓度为至少约0.6m；b)从冷冻的组合物中去除至少90％的水性组分以产生冻干的细胞群；以及c)将冻干的细胞群重新悬浮于复原剂中以形成复原组合物，其中至少约1％的所述细胞是活的。

33、在所述方法的实施例中，所述细胞群悬浮在所述透明质酸凝胶中。

34、在所述方法的实施例中，冷冻前所述单糖的浓度为约0.6m至约2.0m、或约0.7m至约1.7m、或约0.8m至约1.4m。

35、在所述方法的实施例中，所述单糖是葡萄糖、果糖或半乳糖。

36、在所述方法的实施例中，所述单糖是葡萄糖，并且冷冻前所述葡萄糖的浓度为约0.6m至约2.0m、或约0.7m至约1.7m、或约0.8m至约1.4m。

37、在所述方法的实施例中，冷冻前所述尿素的浓度为约0.6m至约2.0m、或约0.7m至约1.7m、或约0.8m至约1.4m。

38、在所述方法的实施例中，冷冻前尿素与单糖的摩尔比为约1:3至约3:1、或约1:2至约2:1、或约1:1。

39、在所述方法的实施例中，所述单糖是葡萄糖，并且冷冻前尿素与葡萄糖的摩尔比为约1:3至约3:1、或约1:2至约2:1、或约1:1。

40、在所述方法的实施例中，所述细胞群为每ml约1×104个细胞至每ml 1×107个细胞。在实施例中，所述细胞群为每ml约1×105个细胞至每ml 4×105个细胞。在实施例中，所述细胞群为每ml约2×105个细胞至每ml 2.5×105个细胞。

41、在所述方法的实施例中，所述疏松剂包括二糖。在实施例中，冷冻前二糖的浓度为约0.1m至约1.0m。在实施例中，冷冻前二糖的浓度为约0.1m至约0.5m。在实施例中，冷冻前二糖的浓度为约0.2m至约0.4m。在实施例中，所述二糖是蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、壳二糖、乳果糖、异麦芽糖蜜二糖或龙胆二糖。

42、在实施例中，所述二糖是蔗糖。在实施例中，冷冻前蔗糖的浓度为约0.1m至约1.0m。在实施例中，冷冻前蔗糖的浓度为约0.1m至约0.5m。在实施例中，冷冻前蔗糖的浓度为约0.2m至约0.4m。

43、在所述方法的实施例中，所述疏松剂包括糖醇。在实施例中，冷冻前糖醇的浓度为约0.1m至约1.0m。在实施例中，冷冻前糖醇的浓度为约0.3m至约0.8m。在实施例中，冷冻前糖醇的浓度为约0.4m至约0.6m。

44、在实施例中，所述糖醇是甘露醇、山梨醇、半乳糖醇、岩藻糖醇、艾杜糖醇或肌醇。在实施例中，所述糖醇是甘露醇。在实施例中，冷冻前甘露醇的浓度为约0.1m至约1.0m。在实施例中，冷冻前甘露醇的浓度为约0.3m至约0.8m。在实施例中，冷冻前甘露醇的浓度为约0.4m至约0.6m。

45、在所述方法的实施例中，所述疏松剂包括二糖和糖醇两者。在实施例中，所述疏松剂包括蔗糖和甘露醇两者。

46、在所述方法的实施例中，所述组合物不包括dmso。在实施例中，所述组合物在冷冻前包括浓度为约1％至约10％的dmso。在实施例中，所述组合物在冷冻前包括浓度为约1％至约5％的dmso。

47、在所述方法的实施例中，在(a)中冷冻之前，分离所述细胞群并使其与穿孔溶液接触。在实施例中，所述穿孔溶液包括海藻糖。所述穿孔溶液可以任选地进一步包括细胞培养基。在实施例中，所述穿孔溶液中的海藻糖的浓度为约0.1m至约1.0m。在实施例中，所述穿孔溶液中的海藻糖的浓度为约0.1m至约0.6m。

48、在包括细胞的复原的方法的实施例中，所述复原剂包括细胞培养基。在实施例中，所述复原剂包括磷酸盐缓冲溶液。

49、在所述方法的实施例中，所述组合物是等渗溶液。在实施例中，所述组合物是高渗溶液。

50、在所述方法的实施例中，所述细胞群包括哺乳动物细胞。在实施例中，所述细胞群包括干细胞。在实施例中，所述细胞群包括多能干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞或造血干细胞。在实施例中，所述细胞群包括间充质干细胞。在实施例中，所述细胞群包括诱导多能干细胞。在实施例中，所述细胞群包括神经母细胞瘤细胞。在实施例中，所述神经母细胞瘤细胞是sk-n-as细胞。

51、在本发明的上下文中，所述水性组分是水，并且任选地包括另外的组分，如缓冲液或细胞培养基。

52、在所述方法的实施例中，所述水性组分包括缓冲液。在实施例中，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、乙酸盐缓冲剂、碳酸氢盐缓冲液、组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或其组合。在实施例中，所述水性组分包括细胞培养基。在实施例中，所述细胞培养基不含血清。

53、在所述方法的实施例中，去除所述水性组分包括对所述冷冻的组合物降低压力、施加热量或两者以去除所述水性组分。在实施例中，去除所述水性组分包括初级干燥步骤和次级干燥步骤。在实施例中，去除所述水性组分仅包括初级干燥步骤。在实施例中，所述初级干燥步骤包括降低压力以去除所述水性组分。在实施例中，所述次级干燥步骤包括施加热量以去除所述水性组分。

54、在所述方法的实施例中，所述冷冻在约-10℃至约-100℃下发生。在实施例中，所述冷冻在约-20℃至约-90℃下发生。在实施例中，所述冷冻在约-40℃至约-60℃下发生。在实施例中，所述冷冻将所述组合物的温度降低至约-80℃。

55、在所述方法的实施例中，所述冷冻将所述组合物的温度降低至约-40℃，所述水性组分在约60mtorr至约80mtorr的室压力的压力下被去除。

56、在所述方法的实施例中，重新悬浮所述冷冻的细胞发生在冷冻后大于两小时。在实施例中，重新悬浮所述冷冻的细胞发生在冷冻后大于一天。在实施例中，重新悬浮所述冷冻的细胞发生在冷冻后大于一周。在实施例中，重新悬浮所述冷冻的细胞发生在冷冻后大于一个月。

57、在细胞被冻干的实施例中，重新悬浮所述冻干的细胞发生在去除所述水性组分后大于两小时。在实施例中，重新悬浮所述冻干的细胞发生在去除所述水性组分后大于一天。在实施例中，重新悬浮所述冻干的细胞发生在去除所述水性组分后大于一周。在实施例中，重新悬浮所述冻干的细胞发生在去除所述水性组分后大于一个月。

58、在所述方法的实施例中，所述冷冻或冻干的细胞在重新悬浮前储存在低于约-20℃下。在实施例中，所述冷冻或冻干的细胞在重新悬浮前储存在约-20℃至约30℃下。在实施例中，所述冷冻或冻干的细胞在重新悬浮前储存在约4℃至约28℃下。在实施例中，所述冷冻或冻干的细胞在重新悬浮前储存在约10℃至约27℃下。在实施例中，所述冷冻或冻干的细胞在重新悬浮前储存在约2℃至约8℃下。

59、在所述方法的实施例中，所述冷冻或冻干的细胞在重新悬浮前储存在大于约-20℃下大于2天。在实施例中，所述冻干的细胞在重新悬浮前储存在约20℃至约25℃下大于1周。在实施例中，所述冻干的细胞在重新悬浮前储存在约2℃至约8℃下大于1周。

60、在所述方法的实施例中，所述复原组合物中至少约20％的所述细胞是活的，例如，如通过测试测量的。在实施例中，所述复原组合物中至少约30％的所述细胞是活的，如通过测试测量的。在实施例中，所述复原组合物中至少约40％的所述细胞是活的，如通过测试测量的。在实施例中，所述复原组合物中至少约50％的所述细胞是活的，如通过测试测量的。

61、在实施例中，本公开还涉及一种组合物，其包括活细胞群、透明质酸凝胶、水性组分、尿素、单糖和疏松剂，其中尿素和所述单糖以约1:3至约3:1的摩尔比包括在所述组合物中，并且其中所述组合物含有小于约90％(vol/vol)水。

62、在所述组合物的实施例中，所述单糖是葡萄糖，并且尿素和葡萄糖以约1:3至约3:1的摩尔比包括在所述组合物中。在所述组合物的实施例中，尿素和葡萄糖以约1:2至约2:1的摩尔比包括在所述组合物中。在所述组合物的实施例中，尿素和葡萄糖以约1:1至约1:1的摩尔比包括在所述组合物中。

63、在实施例中，本公开还涉及一种组合物，其包括活细胞群、水性组分、尿素、单糖和任选地疏松剂，其中所述组合物中所述单糖与尿素的摩尔比为约5:1至约1:5。在实施例中，所述组合物中所述单糖与尿素的摩尔比为约3:1至约1:3。在实施例中，所述组合物中所述单糖与尿素的摩尔比为约2:1至约1:2。在实施例中，所述组合物中所述单糖与尿素的摩尔比为约1:1至约1:1。

64、在所述组合物的实施例中，所述单糖是葡萄糖。在实施例中，所述组合物中葡萄糖与尿素的摩尔比为约3:1至约1:3。在实施例中，所述组合物中葡萄糖与尿素的摩尔比为约2:1至约1:2。在实施例中，所述组合物中葡萄糖与尿素的摩尔比为约1:1至约1:1。

65、在实施例中，本公开还涉及一种组合物，其包括活细胞群、水性组分、约0.2m至约1.0m尿素、约0.2m至约1.0m葡萄糖和疏松剂。在实施例中，所述组合物包括约0.3m至约0.8m葡萄糖。在实施例中，所述组合物包括约0.4m至约0.6m葡萄糖。

66、在实施例中，所述组合物包括约0.3m至约0.8m尿素。在实施例中，所述组合物包括约0.4m至约0.6m尿素。

67、在实施例中，所述组合物进一步包括蔗糖。在实施例中，所述组合物进一步包括约0.1m至约0.5m蔗糖。

68、在实施例中，所述组合物进一步包括甘露醇。在实施例中，所述组合物进一步包括约0.1m至约0.8m甘露醇。

69、在所述组合物的实施例中，所述活细胞群包括哺乳动物细胞。在实施例中，所述活细胞群包括干细胞。在实施例中，所述活细胞群包括多能干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞或造血干细胞。在实施例中，所述活细胞群包括间充质干细胞。在实施例中，所述活细胞群包括诱导多能干细胞。在实施例中，所述活细胞群包括神经母细胞瘤细胞。在实施例中，所述神经母细胞瘤细胞是sk-n-as细胞。

70、在所述组合物的实施例中，所述组合物不含dmso。在所述组合物的实施例中，所述组合物包括浓度为约1％至约10％的dmso。在所述组合物的实施例中，所述组合物包括浓度为约1％至约5％的dmso。

71、在实施例中，本公开还涉及冷冻细胞群的方法，所述方法包括冷冻包括细胞群、水性组分、约0.2m至约1m尿素、约0.2m至约1m葡萄糖和约0.1m至约0.5m蔗糖的组合物，其中所述冷冻在低于约-30℃下发生。

72、在实施例中，本公开还涉及冻干的细胞群的方法，所述方法包括：a)冷冻包括细胞群、透明质酸凝胶、水性组分、约0.6m至约2.0m尿素、约0.6m至约2.0m葡萄糖和约0.1m至约1.0m蔗糖的组合物，其中所述冷冻在低于约-30℃下发生；以及b)从所述冷冻的组合物中去除所述水性组分以产生冻干的细胞群，其中所述冻干的细胞群中的所述水性组分小于约10％w/w。

73、在实施例中，本公开还涉及产生活细胞群的方法，所述方法包括：a)冷冻包括细胞群、水性组分、约0.2m至约1m尿素、约0.2m至约1m葡萄糖和约0.1m至约0.5m蔗糖的组合物，其中所述冷冻在低于约-30℃下发生；以及b)将冻干的细胞群重新悬浮于复原剂中以形成复原组合物，其中所述复原组合物中至少约1％的所述细胞是活的。

74、在实施例中，本公开还涉及产生活细胞群的方法，所述方法包括：a)冷冻包括细胞群、透明质酸凝胶、水性组分、约0.6m至约2.0m尿素、约0.6m至约2.0m葡萄糖和约0.1m至约1.0m蔗糖的组合物，其中所述冷冻在低于约-30℃下发生；b)从所述冷冻的组合物中去除所述水性组分以产生冻干的细胞群，其中所述冻干的细胞群中的所述水性组分小于约10％w/w；以及c)将冻干的细胞群重新悬浮于复原剂中以形成复原组合物，其中所述复原组合物中至少约1％的所述细胞是活的。

75、在实施例中，本公开还涉及冷冻细胞群的方法，所述方法包括冷冻包括细胞群、水性组分、约0.2m至约1m尿素、约0.2m至约1m葡萄糖和约0.1m至约0.8m甘露醇的组合物，其中所述冷冻在低于约-30℃下发生。

76、在实施例中，本公开还涉及冻干的细胞群的方法，所述方法包括：a)冷冻包括细胞群、透明质酸凝胶、水性组分、约0.6m至约2.0m尿素、约0.6m至约2.0m葡萄糖和约0.1m至约0.8m甘露醇的组合物，其中所述冷冻在低于约-30℃下发生；以及b)从所述冷冻的组合物中去除所述水性组分以产生冻干的细胞群，其中所述冻干的细胞群中的所述水性组分小于约10％w/w。

77、在实施例中，本公开还涉及产生活细胞群的方法，所述方法包括：a)冷冻包括细胞群、水性组分、约0.2m至约1m尿素、约0.2m至约1m葡萄糖和约0.1m至约0.8m甘露醇的组合物，其中所述冷冻在低于约-30℃下发生；以及b)将冻干的细胞群重新悬浮于复原剂中以形成复原组合物，其中所述复原组合物中至少约1％的所述细胞是活的。

78、在实施例中，本公开还涉及产生活细胞群的方法，所述方法包括：a)冷冻包括细胞群、透明质酸凝胶、水性组分、约0.6m至约2.0m尿素、约0.6m至约2.0m葡萄糖和约0.1m至约0.8m甘露醇的组合物，其中所述冷冻在低于约-30℃下发生；b)从所述冷冻的组合物中去除所述水性组分以产生冻干的细胞群，其中所述冻干的细胞群中的所述水性组分小于约10％w/w；以及c)将冻干的细胞群重新悬浮于复原剂中以形成复原组合物，其中所述复原组合物中至少约1％的所述细胞是活的。

79、在所述方法的实施例中，所述组合物进一步包括约1％至约8％的dmso。在所述方法的实施例中，所述组合物进一步包括水凝胶。在实施例中，所述水凝胶是透明质酸凝胶、藻酸盐凝胶或胶原凝胶。在实施例中，所述细胞群悬浮在所述水凝胶中。在实施例中，所述组合物不含dmso。

80、在所述组合物是复原的所述方法的实施例中，所述复原组合物中至少约20％的所述细胞是活的，例如，如通过测试测量的。在实施例中，所述复原组合物中至少约30％的所述细胞是活的，如通过测试测量的。在实施例中，所述复原组合物中至少约40％的所述细胞是活的，如通过测试测量的。在实施例中，所述复原组合物中至少约50％的所述细胞是活的，如通过测试测量的。