一种淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法与流程

本发明属于药用植物组织培养，具体涉及一种淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法。

背景技术：

1、淫羊藿（epimedium brevicornum）又名仙灵脾、三枝九叶草、羊合草，为双子叶植物类群小檗科淫羊藿属植物，全草均具有药用价值，其味辛、甘，性温，是中国传统的补益类中药材，具有温补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效。现代医学研究发现了其许多新的药理作用，比如抗衰老、促进骨骼生长、改善造血系统障碍、增强机体免疫力、抗肿瘤、抗病毒等作用，极具开发价值。当前淫羊藿的市场需求量巨大，主要以采挖野生资源方式获得，随着采挖量增大，野生淫羊藿资源不断减少，非常不利于资源的再生和可持续利用。因此建立淫羊藿人工栽培和快速繁殖技术就显得迫在眉睫。

2、自然条件下，淫羊藿主要以种子繁殖和分株繁殖为主。种子繁殖萌发率极低且发芽周期长，分株繁殖容易导致品种退化，两者都非常不利于淫羊藿的规模化种植。采用组织培养的方式，在保留母本优良性状的同时能够大量繁殖，有利于保护淫羊藿野生种质资源。相关技术中，可利用淫羊藿外植体诱导出愈伤组织，通过愈伤组织诱导不定芽从而获得淫羊藿的组培苗。但是，通过愈伤组织诱导不定芽获得淫羊藿的组培苗的方式，遗传稳定性不佳，容易发生变异，不利于保持药用植物的特定性状。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明的目的在于，提供一种淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，通过该方法以淫羊藿幼苗子叶节为外植体进行组织培养，使用淫羊藿的直接器官发生途径，不经过愈伤组织，直接诱导不定芽，进而增殖培养获得丛生芽，不仅能够大量繁殖淫羊藿，而且具有良好的遗传稳定性，不容易发生变异，能够有效地保持淫羊藿的特定药用性状。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、一种淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，包括以下步骤：

4、s1.种子萌发：将淫羊藿种子去除杂质，然后选择充分成熟、饱满完整的种子，用流水冲洗1h之后，将种子消毒后沙藏保鲜，期间注意保湿和消毒，3-5个月种子陆续发芽。

5、s2.幼苗获得：将萌发的淫羊藿种子播于腐殖土的小花盆培养，待淫羊藿幼苗长出真叶，备用。

6、s3.子叶节消毒：将幼苗切去子叶，（截）取子叶附着点以下长度为0.5 cm的子叶节作为外植体，用流水冲洗30 min后，在超净工作台中，消毒处理。

7、s4.不定芽诱导培养：将消毒的子叶节接种到诱导培养基上培养，在温度为25 ℃，光照强度为2300-2500 lx，光照时长为12 h/d的条件下培养，得到淫羊藿不定芽。

8、s5.芽增殖培养：切取单个芽点，接种到增殖培养基上培养，在温度为25℃，光照强度为2300-2500 lx，光照时长为12 h/d的条件下培养，得到淫羊藿丛生芽。

9、进一步的，在步骤s1中，所述将种子消毒后沙藏保鲜的步骤为：喷洒0.1 %多菌灵对种子消毒后，将种子与含水率为55 %-60 %细河沙按1：3的比例混匀，之后在4 ℃的冷藏室内沙藏保鲜。

10、进一步的，在步骤s2中，所述淫羊藿种子播入小花盆内后，在环境温度为20 ℃，土壤湿度为25 %-30 %，空气相对湿度为70 %-80 %，光照强度为2000 lx，光照时长为12 h/d的条件下培养。

11、进一步的，在步骤s3中，所述消毒处理具体为：将取得的子叶节，先用75 %酒精消毒30 s，无菌水冲洗3次，再用0.1 %氯化汞消毒5 min，无菌水冲洗5次。

12、进一步的，在步骤s4中，所述诱导培养基为：ms/wpm/b5 +0.5 mg/l naa+2.0 mg/l6-ba+7 g/l琼脂+30 g/l蔗糖，调节ph为5 .8。

13、进一步的，在步骤s5中，所述增殖培养基为：ms/wpm/b5+0.5 mg/l naa+1.5 mg/l6-ba + 0.5 mg/l ga3+7 g/l琼脂+30g/l蔗糖，调节ph为5.8。

14、在本发明中：

15、所述ms是指多数植物组织培养快速繁殖用的基本培养基。

16、所述wpm是指根据ms培养基改良的培养基，使用了硫酸钾替换了kno3，nh4no3的含量也降低到了ms培养基的1/4，氮盐也主要以硝酸钙的形式供应。

17、所述b5是指含有较低的铵，主要用于培养双子叶植物的培养基。

18、所述naa是指a-萘乙酸，能促进细胞分裂与伸长。

19、所述6-ba是指6-苄氨基嘌呤，促进芽的形成。

20、所述ga3是指赤霉素，能促进植株生长，同时对植株的增殖倍数等方面也有一定的促进作用。

21、另：

22、种子发芽率=发芽种子粒数/供试种子粒数×100%。

23、不定芽诱导率=诱导不定芽数/接种子叶节数×100%。

24、丛生芽增殖系数=增殖芽数/接种芽数。

25、本发明采用淫羊藿的子叶节为外植体，不经过愈伤组织，通过丛生芽途径建立淫羊藿的快速增殖体系；结合种子萌发、消毒、诱导培养与增殖培养建立淫羊藿的快速增殖无菌体系，降低污染率，提高淫羊藿的产量及质量；整个流程简单，繁殖周期短，种子发芽率最高可达97 %，诱导率最高可达68.75%，增殖系数最高可达2.33，为淫羊藿种苗繁育及规模化繁殖提供技术指导，解决了淫羊藿种子发芽率低，发芽周期长而导致的育苗难的问题，对保护淫羊藿野生资源，实现可持续利用具有积极作用。

技术特征：

1.一种淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2. 根据权利要求1所述淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，其特征在于，在步骤s1中，所述将种子消毒后沙藏保鲜的步骤为：喷洒0.1 %多菌灵对种子消毒后，将种子与含水率为55 %-60 %细河沙按1：3的比例混匀，之后在4 ℃的冷藏室内沙藏保鲜。

3. 根据权利要求1所述淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，其特征在于，在步骤s2中，所述淫羊藿种子播入小花盆内后，在环境温度为20 ℃，土壤湿度为25 %-30 %，空气相对湿度为70 %-80 %，光照强度为2000 lx，光照时长为12 h/d的条件下培养。

4. 根据权利要求1所述淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，其特征在于，在步骤s3中，所述消毒处理具体为：将取得的子叶节，先用75 %酒精消毒30 s，无菌水冲洗3次，再用0.1 %氯化汞消毒5 min，无菌水冲洗5次。

5. 根据权利要求1所述淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，其特征在于，在步骤s4中，所述诱导培养基为：ms/wpm/b5 +0.5 mg/l naa+2.0 mg/l 6-ba+7 g/l琼脂+30 g/l蔗糖，调节ph为5 .8。

6. 根据权利要求1所述淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，其特征在于，在步骤s5中，所述增殖培养基为：ms/wpm/b5+0.5 mg/l naa+1.5 mg/l 6-ba + 0.5 mg/l ga3+7 g/l琼脂+30g/l蔗糖，调节ph为5.8。

技术总结
本发明公开了一种淫羊藿不定芽诱导及快速增殖的方法，包括以下步骤：S1.种子萌发；S2.幼苗获得；S3.子叶节消毒；S4.不定芽诱导培养；S5.芽增殖培养.本发明采用淫羊藿的子叶节为外植体，不经过愈伤组织，通过丛生芽途径建立淫羊藿的快速增殖体系；结合种子萌发、消毒、诱导培养与增殖培养建立淫羊藿的快速增殖无菌体系，降低污染率，提高淫羊藿的产量及质量；整个流程简单，繁殖周期短，种子发芽率最高可达97%，诱导率最高可达68.75%，增殖系数最高可达2.33，为淫羊藿种苗繁育及规模化繁殖提供技术指导，解决了淫羊藿种子发芽率低，发芽周期长而导致的育苗难的问题，对保护淫羊藿野生资源，实现可持续利用具有积极作用。

技术研发人员：张小微,王晓殿,李林,邱化荣,胡云凤
受保护的技术使用者：遵义市农业科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12