一种免疫细胞冻存液及其应用的制作方法

本发明涉及细胞冻存，尤其涉及一种免疫细胞冻存液及其应用。

背景技术：

1、免疫细胞疗法是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法，运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，以激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的，然而采集肿瘤病人体内的免疫细胞往往需要在化疗之前进行，这使病人放化疗的时间和免疫细胞回输时间产生冲突。

2、细胞冷冻技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已有深入广泛的应用，将免疫细胞培养好并冻存起来，待到需要时立刻复苏并回输可解决时间冲突的问题，并且随时可以使用。对供体的免疫细胞深低温保存可保持其活力和功能，无论对临床还是基础研究均具有重要意义。

3、正常情况下，液体冻结时会造成细胞损伤，现有细胞冻存液的配当多采用二甲基亚砜联合动物血清，大部分为10％的二甲基亚砜与90％的胎牛血清。但由于二甲基亚砜含量仍较高，具有相当的毒性，对病人身体不利，并且胎牛血清中含有大量的异种蛋白，既有传染病的危险，又很容易引起过敏反应或者免疫排斥，因此不能直接用于临床回输。

4、因此，目前寻找一种不仅可提高细胞冻存存活率，保持较好增殖能力的免疫细胞冻存液及冻存方法是亟待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种免疫细胞冻存液及其应用。

2、一种免疫细胞冻存液，其组分包括：二甲基亚砜0.01-0.05ml/ml，葡萄糖0.1-0.18g/ml，l-岩藻糖0.02-0.08mg/ml，氧化铁负载维生素c 1-4mg/ml，聚甘油脂肪酸酯0.1-0.6μg/ml，聚乙二醇0.01-0.05mg/ml，非必需氨基酸5-20mg/ml，人血白蛋白5-25mg/ml。

3、优选地，氧化铁负载维生素c采用如下步骤制得：将纳米二氧化硅、硝酸铁、聚天冬氨酸加入水中搅拌10-30min，冷冻干燥1-2h，冷冻干燥过程中采用单面冷冻降温至-40～-80℃；氮气保护下，400-500℃煅烧1-2h，降至室温，加入氢氧化钠溶液中，调节温度至120-130℃密闭搅拌1-2h，过滤，洗涤，干燥，再与维生素c、对羟基桂皮酸加入水中，超声处理，过滤，洗涤，干燥得到氧化铁负载维生素c。

4、聚天冬氨酸不仅可有效促使纳米二氧化硅与硝酸铁在水溶液中有效分散，而且聚天冬氨酸为带有羧酸侧链的聚合氨基酸，可与水溶液中纳米二氧化硅表面的羟基结合，所得多维网络结构可作为硝酸铁结构的附着网点，在冷冻干燥过程中，采用单面冷冻降温方式，可促使氧化铁孔径结构定向排列，配合煅烧处理，聚天冬氨酸占据的位置空出形成介孔，进一步对维生素c进行负载，对维生素c负载强度高。

5、同时申请人发现采用羟基桂皮酸与维生素c配合并负载至网络介孔氧化铁中，可有效避免脱水后细胞因为局部电解质浓度升高，引起内部空间结构紊乱，使所得冻存液对冻存细胞有极好的保护作用，冻存细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。

6、优选地，纳米二氧化硅、硝酸铁、聚天冬氨酸、维生素c、对羟基桂皮酸的质量比为1-4：1-3：1-2：0.1-1：0.1-1。

7、优选地，氢氧化钠溶液浓度为0.2-1mol/l。

8、优选地，超声处理时间为1-2h，超声频率为10-15khz，超声功率为300-400w。

9、优选地，氧化铁负载维生素c和聚乙二醇的质量比为2-3：0.02-0.04。

10、一种免疫细胞冻存方法，包括如下步骤：

11、s1、取外周血于离心管中，离心5-15min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的pbs缓冲液混合均匀，再加入ficoll分离液使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入pbs缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；

12、s2、将外周血单核细胞与上述免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-50～-70℃，冻存5-15h，然后转入液氮中冻存。

13、优选地，细胞悬浮液中细胞的浓度为1-1.8×107个/ml。

14、一种免疫细胞冻存复苏方法，包括如下步骤：将上述冻存方法所得冻存管取出，置于37℃恒温水浴锅中1-3min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤1-3次。

15、本发明技术效果如下所示：

16、本申请采用氧化铁负载维生素c与聚乙二醇复配，不仅具有良好亲水性，静电诱导水和作用并结合大量水分子，从而有效抑制冰晶形成，而且可明显提高细胞复苏后活性，促使细胞快速恢复活性，有效提高细胞冻存后的存活率，能保持较好的增殖能力。

17、本发明不含动物血清，不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，同时在二甲基亚砜含量低的前提下，使复苏细胞存活率依旧可达到95％以上，细胞生物学特性不发生变化，保证了免疫细胞的生物学活性，可满足医药等领域对免疫细胞的需求。

技术特征：

1.一种免疫细胞冻存液，其特征在于，其组分包括：

2.根据权利要求1所述免疫细胞冻存液，其特征在于，氧化铁负载维生素c采用如下步骤制得：将纳米二氧化硅、硝酸铁、聚天冬氨酸加入水中搅拌10-30min，冷冻干燥1-2h，冷冻干燥过程中采用单面冷冻降温至-40～-80℃；氮气保护下，400-500℃煅烧1-2h，降至室温，加入氢氧化钠溶液中，调节温度至120-130℃密闭搅拌1-2h，过滤，洗涤，干燥，再与维生素c、对羟基桂皮酸加入水中，超声处理，过滤，洗涤，干燥得到氧化铁负载维生素c。

3.根据权利要求2所述免疫细胞冻存液，其特征在于，纳米二氧化硅、硝酸铁、聚天冬氨酸、维生素c、对羟基桂皮酸的质量比为1-4：1-3：1-2：0.1-1：0.1-1。

4.根据权利要求2所述免疫细胞冻存液，其特征在于，氢氧化钠溶液浓度为0.2-1mol/l。

5.根据权利要求2所述免疫细胞冻存液，其特征在于，超声处理时间为1-2h，超声频率为10-15khz，超声功率为300-400w。

6.根据权利要求1所述免疫细胞冻存液，其特征在于，氧化铁负载维生素c和聚乙二醇的质量比为2-3：0.02-0.04。

7.一种免疫细胞冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述免疫细胞冻存方法，其特征在于，细胞悬浮液中细胞的浓度为1-1.8×107个/ml。

9.一种免疫细胞冻存复苏方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求7或8所述冻存方法所得冻存管取出，置于37℃恒温水浴锅中1-3min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤1-3次。

技术总结
本发明公开了一种免疫细胞冻存液，其组分包括：二甲基亚砜0.01‑0.05mL/mL，葡萄糖0.1‑0.18g/mL，L‑岩藻糖0.02‑0.08mg/mL，氧化铁负载维生素C 1‑4mg/mL，聚甘油脂肪酸酯0.1‑0.6μg/mL，聚乙二醇0.01‑0.05mg/mL，非必需氨基酸5‑20mg/mL，人血白蛋白5‑25mg/mL。本发明还公开了一种免疫细胞冻存方法，将外周血单核细胞与上述免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至‑50～‑70℃，冻存5‑15h，然后转入液氮中冻存。本发明还公开了一种免疫细胞冻存复苏方法。

技术研发人员：张孝松,俞英豪,彭昉,陈波
受保护的技术使用者：杭州中赢生物医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15