一种罗非鱼健康养殖方法

：本发明属于水产养殖领域，具体涉及一种罗非鱼健康养殖新方法。

背景技术

0、
背景技术：

1、近年来，随着集约化养殖模式的快速发展和对鱼产量的不断追求，因饲料品质差和水质恶化，导致重要经济鱼类普遍出现疾病频发、严重脂肪肝、饲料利用率降低等问题，给鱼类养殖业造成巨大经济损失；同时，在追求利润驱使下，激素产品的过量和违规使用导致养殖水体的严重激素残留问题，对人体健康和生态环境安全造成了严重威胁。

2、

3、罗非鱼(oreochromis niloticus)原产于非洲，又名非洲鲫鱼，属鲈形目、鲡鱼科、罗非鱼属，因其具有生长快、食性杂、养殖水域广、繁殖力强、无肌间刺等特点，养殖遍布140余个国家和地区，是全球第二大养殖鱼类。但随着近年鱼类养殖集约化模式的快速发展，罗非鱼疾病爆发的问题亦愈发严重，其中以无乳链球菌为病原菌的致死率最高，严重影响了罗非鱼养殖产业的可持续发展。近年来，水产养殖中主要依赖抗生素类药物进行无乳链球菌病的防治，但抗生素的长期使用或滥用会导致耐药性细菌增加，其残留还威胁食品和环境安全,并产生严重的社会问题。目前，微生物对宿主及其水体环境表现出许多有益特性，作为生长促进剂、免疫刺激剂和疾病预防被广泛用于水产养殖中。益生菌可对水产养殖产生多种影响，包括免疫调节、营养和环境调节等，进而在预防疾病方面表现出巨大的竞争优势。虽然无具体证据表明益生菌比免疫刺激剂或疫苗的效果更好，但其对宿主及环境的有益影响明确，益生菌仍是用于控制疾病及环境调节的最有希望的选择之一。

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、本发明的目的是提供一种罗非鱼健康养殖方法。

2、本发明的罗非鱼健康养殖方法，是用拮抗罗非鱼链球菌的酵母菌饲喂罗非鱼。

3、所述拮抗罗非鱼链球菌的酵母菌是通过以下方法制备的：

4、将罗非鱼抗菌肽tp3和tp4导入到酵母菌中并进行表达，获得拮抗罗非鱼链球菌的酵母菌；

5、所述的罗非鱼抗菌肽tp3和tp4的核苷酸序列分别如seq id no.1或2所示。

6、>tp3(seq id no.1)

7、atgaagtgcaccatgctgttccttgtgctgtcgatggttgtcctcatggctgaacctggggaggcctttattcaccatattatcggtggactta ttagtgttggcaaacatatccacggcctcatccacggacatgggaatgtcaaacagcaacaacagcagcaagagcagctaaaccaacgctcatttaaccgagaacagttcaaacgggaaagggctgcttttaac

8、>tp4(seq id no.2)

9、atgaagtgcactatactgttccttgtgctgtcgatggtcgtcctcatggctgaacctggggaaggctttatttcccatattatcggtggactgtttagtgctggcaaggctatccatcgcctcatacgacgtagacgaagaggggaactgcagcttgagcaggaactgcagcaacaactggagcaactggaaaaacttcagcaacaggaaaagcttagccaacgctttaaccgagagcagctcaaacgagagagagttgcttttaac

10、优选，是将罗非鱼抗菌肽tp3和tp4的编码基因导入质粒pgapzαa中，分别获得转基因质粒pgapzαa-tp3和pgapzαa-tp4并将其转入到了野生型酵母菌x33中，依据同源重组原理其成功整合到酵母的基因组启动子pgap位点下游，获得拮抗罗非鱼链球菌的酵母菌。

11、本发明采用以下技术方案：

12、a、酵母表达抗菌肽质粒载体的构建

13、酵母同源重组质粒pgapzαa-tp3.3和pgapzαa-tp4.3的构建过程总共分为四步：

14、第一步，扩增抗菌肽tp3和tp4的全长序列，通过无缝克隆的方法将其分别克隆到质粒pgapzαa上，构建质粒pgapzαa-tp3.0和pgapzαa-tp4.0；所用无缝克隆引物序列分别为：

15、扩增载体pgapzαa的引物序列为：

16、pgapαa_fwd：5’-ggccgtctcggatcggtac-3’；

17、pgapαa_rev：5’-gctgggccacgtgaattc-3’；

18、扩增抗菌肽tp3和tp4全长序列所用的无缝克隆引物分别为：

19、tp3_fwd：5’-ctgaattcacgtggcccagcgccaccatgaagtgcaccatgctg-3’；

20、tp3_rev：5’-ggtaccgatccgagacggccgttaaaagcagccctttc-3’；

21、tp4_fwd：5’-ctgaattcacgtggcccagcgccaccatgaagtgcactatactgttc-3’；

22、tp4_rev：5’-ggtaccgatccgagacggccgttaaaagcaactctctctc-3’；

23、第二步，去掉质粒pgapzαa-tp3.0和pgapzαa-tp4.0中的编码抗菌肽c端功能域的dna序列，构建质粒pgapzαa-tp3.1和pgapzαa-tp4.1，所用引物分别为：

24、dtp3_fwd：5’-acggcctcatccacggacatgaacaaaaactcatctcagaagagg-3；

25、dtp3_rev：5’-atgtccgtggatgaggcc-3’；

26、dtp4_fwd：5’-tcatacgacgtagacgaagagaacaaaaactcatctcagaag-3；

27、dtp4_rev：5’-tcttcgtctacgtcgtatg-3’；

28、第三步，去掉质粒pgapzαa-tp3.1和pgapzαa-tp4.1中的编码抗菌肽的信号肽的dna序列，构建质粒pgapzαa-tp3.2和pgapzαa-tp4.2，所用引物分别为：

29、3.1_fwd：5’-agaaaagagaggctgaagcttttattcaccatattatcggtg-3；

30、3.1_rev：5’-agcttcagcctctcttttc-3’；

31、4.1_fwd：5’-agaaaagagaggctgaagcttttattcaccatattatcggtg-3；

32、4.1_rev：5’-agcttcagcctctcttttc-3’；

33、第四步，去掉质粒pgapzαa-tp3.2和pgapzαa-tp4.2上的编码myc的标签序列，只保留6×his标签，其位于表达抗菌肽功能域序列的后面，构建质粒pgapzαa-tp3.3和pgapzαa-tp4.3，所用引物分别为：

34、3.2_fwd：5’-acggcctcatccacggacatcatcatcatcatcatcattgagttttagc-3；

35、3.2_rev：5’-atgtccgtggatgaggcc-3’；

36、4.2_fwd：5’-tcatacgacgtagacgaagacatcatcatcatcatcattgag-3；

37、4.2_rev：5’-tcttcgtctacgtcgtatg-3’；

38、b、高浓度的线性化质粒pgapzαa-tp3.3和pgapzαa-tp4.3的线性化方法：

39、1)线性化质粒pgapzαa-tp3.3和pgapzαa-tp4.3，在质粒上的限制性内切酶avr ii酶切位点处设计引物，通过pcr的方法将质粒线性化。以质粒pgapzαa-tp3.3和pgapzαa-tp4.3为模板，用质粒线性化引物(avf/avr)扩增出长度分别为3104bp和3110bp的片段，pcr循环条件：98℃2min；98℃10s，58℃15s，72℃1min，35个循环；72℃5min；

40、所用线性化引物序列为：

41、avf：5’-cctaggaaattttactctgctggagagc-3；

42、avr：5’-gacggtaacgggcggtgg-3’；

43、2)pcr完成之后，600μl的pcr产物用等体积的苯酚/氯仿(1：1)抽提一次，12000g离心10min，取上清；

44、3)加入1/10体积的3m醋酸钠(ph＝5.2)和2倍体积的无水乙醇，-20℃孵育30min，12000g离心10min，弃去上清；

45、4)将得到的dna沉淀用500μl 70％的乙醇重悬，12000g离心10min，弃去上清，空气干燥5min，溶解于20μl无核酸酶的去离子水中，并测量浓度，即得到高浓度的线性化质粒pgapzαa-tp3.3和pgapzαa-tp4.3；

46、5)取制备的线性化质粒dna 5μg，进行酵母的转化；

47、6)将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，挑单克隆进行pcr鉴定，同时对pcr产物进行测序鉴定；

48、阳性菌检测引物序列：

49、pgap forward：5′-gtccctatttcaatcaattgaa-3′3′

50、aox1：5′-gcaaatggcattctgacatcc-3；

51、由此获得拮抗罗非鱼链球菌的酵母菌。

52、本发明建立了一种适合罗非鱼健康养殖的新模式，主要是通过以下方式获得：

53、(1)我们基于前期构建的转基因质粒pgapzαa-tp3和pgapzαa-tp4转入到了野生型酵母菌x33中，依据同源重组原理其成功整合到酵母的基因组启动子pgap位点下游。通过培养在酵母培养基中检测到抗菌肽tp3和tp4的表达，无乳链球菌抗菌活性检测显示表达罗非鱼抗菌肽tp3和tp4的酵母培养液具有显著的拮抗无乳链球菌活性。

54、(2)利用商品化的罗非鱼成鱼饲料和拮抗罗非鱼链球菌的酵母菌液，按10升/吨饲料的比例，充分混匀后进行发酵。

55、(3)分析发酵饲料营养成分以及功能微生物菌数，进行功能性发酵饲料营养价值评定。

56、(4)评价发酵饲料对罗非鱼的养殖效果，建立罗非鱼发酵饲料使用操作规程，构建罗非鱼健康养殖前沿技术体系。

57、与现有技术相比，本发明具有如下优点：

58、1.生产的发酵饲料特别适用于罗非鱼，具有显著提高罗非鱼成活率的功能。

59、2.构建罗非鱼健康养殖的前沿技术体系并进行产业化示范推广，促进其养殖业的安全、优质、高效和无公害发展。