一种通过常压室温等离子诱变对虾受精卵的方法与流程

本发明涉及水产动物诱变，具体涉及一种通过常压室温等离子诱变对虾受精卵的方法。

背景技术：

1、诱变是指利用外界因素使细胞内的dna分子产生碱基错配、重组而产生基因突变。虽然大部分的突变是有害的，但中性同义突变或有益突变是增加群体遗传多样性、提升选育潜力的不可多得的遗传资源。因此，利用不同诱变方法对物种早期胚胎进行诱变是改善种质资源进而选育新品种的重要技术，被广泛应用于育种中。常见的诱变方法包括化学诱变和物理诱变，其中化学诱变有高污染性的缺陷，物理诱变中的紫外诱变等方法存在突变率低、遗传不稳定等缺陷。常压室温等离子体(atmospheric and room temperatureplasma，artp)诱变是一种新型物理诱变技术，其原理是利用具有能量的氦气离子攻击细胞从而引起生物体基因层面的突变。因其高突变率、易用性和操作安全等特点，被广泛应用于微生物育种和植物育种。比如中国专利cn201510004693.6公开了一种富核糖核酸啤酒酵母菌的诱变方法，中国专利cn114431072a公开了一种通过artp等离子诱变进行香菇育种的方法。而在水产动物育种中对该技术的应用研究较少，目前仅在少数鱼类如红白锦鲤(cyprinus carpiohaematopterus)、牙鲆(paralichthy solivaceus)、斑马鱼(daniorerio)等物种中有探索性的报道，尚未有在对虾中进行artp诱变育种研究的报道。

2、对虾是我国最重要的水产经济物种之一，如凡纳滨对虾是全球单一产值最高的水产经济物种。以规模化家系和数量遗传学为基础的选择育种技术已经广泛应用于国内凡纳滨对虾育种项目，选育出一些性状优良的新品种/系。然而凡纳滨对虾作为国外引进品种，种源“卡脖子”问题依然突出：即使国内的育种技术有较大突破，国外通过采取控种策略，利用近交等方式只提供给国内遗传背景极为单一的家系/群体种质资源，致使国内育种群体的遗传多样性低、可利用的遗传变异少，选育效率低、进展慢。而对于中国对虾等本土对虾物种，由于过度捕捞及大量增殖放流人工群体，致使野生群体已较难大批量捕捞，选育群体也长期处于封闭状态，可利用的遗传变异越来越少，致使性状的选育进展缓慢。

技术实现思路

1、针对现有选育流程中的上述不足，本发明的目的在于一种新的对虾辐射诱变育种方法，以克服现有水产动物选择育种技术流程中选育基础群体来源单一、遗传多样性低、可利用遗传变异资源不丰富、选育效率不高等问题。

2、为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

3、提供一种通过常压室温等离子诱变对虾受精卵的方法，采用常压室温等离子系统在对虾受精卵处于原肠胚期时进行辐射诱变，所述常压室温等离子系统辐射诱变参数为：工作气体为氦气，射频功率330-390w，氦气流量15l/min，距离为2-4mm。

4、进一步地，辐射诱变时，将对虾受精卵平铺于样品板上，水刚没过受精卵，辐射时间超过4min时，每2min暂停辐射补水1ml。

5、进一步地，辐射诱变时间为2～8min。

6、进一步地，还包括将诱变后的受精卵孵化出无节幼体，幼体培育过程中采用多阶段标准化操作以抵消密度及环境不同可能造成的生长差异；幼虾达到一定规格后，通过荧光标记混养测试、单尾口饲病原感染等方法，初步筛选生长、抗病等突变表型优秀的个体；初筛突变体利用基因组/转录组分析技术，通过寻找与对照组个体的分子水平差异，计算突变率、确认突变的有效性。

7、进一步地，标准化操作为：无节幼体随机挑选10000个，仔虾p5阶段随机挑选1000个，仔虾p25阶段随机挑选500个。

8、进一步地，突变表型优秀个体初筛标准为性状测试前10％～20％的个体。

9、本发明的有益效果为：

10、本发明从诱变方法方面摸索了一套适宜对虾artp辐射的最佳工艺参数，包括受精卵时期、受精卵密度、辐射强度、辐射时间等，在保证受精卵孵化率的同时保证了一定的突变率，获得了较好的诱变效果；在筛选方法方面除通过性状测试筛选出的正向突变个体，进一步利用基因组、转录组水平上的分子差异分析，验证了本发明方法获得突变体的有效性。

技术特征：

1.一种通过常压室温等离子诱变对虾受精卵的方法，其特征在于，所述方法为采用常压室温等离子系统在对虾受精卵处于原肠胚期时进行辐射诱变，所述常压室温等离子系统辐射诱变参数为：工作气体为氦气，射频功率330～390w，氦气流量15l/min，距离为2～4mm。

2.根据权利要求1所述的通过常压室温等离子诱变对虾受精卵的方法，其特征在于，所述辐射诱变时，将对虾受精卵平铺于样品板上，水刚没过受精卵，辐射时间超过4min时，每2min暂停辐射补水1ml。

3.根据权利要求1所述的通过常压室温等离子诱变对虾受精卵的方法，其特征在于，所述辐射诱变时间为2～8min。

4.根据权利要求1所述的通过常压室温等离子诱变对虾受精卵的方法，其特征在于，还包括将诱变后的受精卵孵化出无节幼体，幼体培育过程中采用多阶段标准化操作，幼体达到规格后，初步筛选生长、抗病突变表型优秀的个体，计算突变率、确认突变的有效性。

5.根据权利要求4所述的通过常压室温等离子诱变对虾受精卵的方法，其特征在于，所述标准化操作为：无节幼体随机挑选10000个，仔虾p5阶段随机挑选1000个，仔虾p25阶段随机挑选500个。

6.根据权利要求4所述的通过常压室温等离子诱变对虾受精卵的方法，其特征在于，突变表型优秀个体初筛标准为性状测试前10％～20％的个体。

技术总结
本发明公开了一种通过常压室温等离子诱变对虾受精卵的方法，具体为选择对虾受精产卵后5h左右的原肠胚阶段，利用流量为15L/min的氦气、360W的射频功率、距离3mm、辐射时间在2～8min并按时补充海水的条件下辐射诱变。本发明从诱变方法方面摸索了一套适宜对虾ARTP辐射的最佳工艺参数，包括受精卵时期、受精卵密度、辐射强度、辐射时间等，在保证受精卵孵化率的同时保证了一定的突变率，获得了较好的诱变效果；在筛选方法方面除通过性状测试筛选出的正向突变个体，进一步利用基因组、转录组水平上的分子差异分析，验证了本发明方法获得突变体的有效性。

技术研发人员：傅强,孟宪红,周静心,孔杰,栾生,代平,曹宝祥,刘学会
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院黄海水产研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8