细胞冻存方法与流程

本发明涉及细胞保存领域，具体地涉及一种细胞冻存方法。

背景技术：

1、细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用细胞冻存技术将细胞储存于液氮中深低温保存，可以使细胞达到长期储存的目的。同时，良好的冻存质量可以使细胞在复苏时具备与冻存前一致的细胞特性，如细胞倍增时间、表达产物的数量和品质的高度稳定和一致等，从而为生产和实验等工作长期稳定的开展提供了必要的支撑。

2、细胞的冻存通常遵循慢冻速溶的原则，通常的降温速率是细胞样品以1℃/分钟的速度降温至-80℃以下。传统的冻存方法大致包括以下三种，第一种是将细胞样品用棉花包裹直接放入-80℃冰箱，第二种是将细胞样品放入4℃环境中半小时、-20℃环境中一小时、-80℃环境中过夜，第三种是使用程序降温盒，细胞样品放入盒后直接放入-80℃冰箱过夜即可。

3、以上三种方法虽能在一定程度上保证降温速率，但是操作繁琐，操作时间长，且不能大量冻存，在一定程度上限制了这些方法的运用。

4、本发明的发明人设计了一种适用于细胞冻存的降温程序，其设定了多个变温阶段并控制变温过程中的温度梯度和不同阶段的温度变化速率，达到了可控性强、避免细胞在冻存的过程中受到伤害，并且不受冻存规模的影响，还能使细胞在复苏后仍具有良好的生物活性和生物学功能。

技术实现思路

1、本技术的一个方面提供了一种细胞冻存方法，包括设定变温步骤对细胞样品进行程序降温，所述细胞样品包含所述细胞和冻存液，其中所述变温步骤包括：

2、(a).将所述细胞样品放置于处于第一温度的环境中，所述第一温度为2℃至8℃；

3、(b).将所述细胞样品的温度以2℃-10℃/分钟的变温速度降至第二温度，所述第二温度为0℃至-18℃；

4、(c).将所述细胞样品所处的环境温度以30℃-80℃/分钟的变温速度降至第三温度，所述第三温度为-60℃至-90℃；

5、(d).将所述细胞样品所处的环境温度以15℃-40℃/分钟的变温速度升至第四温度，所述第四温度为-10℃至-30℃；

6、(e).将所述细胞样品所处的环境温度以0.2℃-10℃/分钟的变温速度降至第五温度，所述第五温度为-35℃至-50℃；

7、(f).将所述细胞样品所处的环境温度以大于5℃/分钟的变温速度降至第六温度，所述第六温度为-80℃以下。

8、在某些实施方式中，维持所述步骤(a)中的细胞样品处于所述第一温度的环境中1～60分钟。在某些实施方式中，维持所述步骤(a)中的细胞样品处于所述第一温度的环境中30～60分钟。在某些实施方式中，所述第一温度为4℃。

9、在某些实施方式中，所述步骤(b)中的变温速度为2℃-3℃/分钟。在某些实施方式中，所述步骤(b)中的变温速度为2℃/分钟。在某些实施方式中，所述步骤(b)中的变温速度为3℃/分钟。在某些实施方式中，所述第二温度为-4℃至-10℃。在某些实施方式中，所述第二温度为-7℃至-10℃。在某些实施方式中，所述第二温度为-7℃。在某些实施方式中，所述第二温度为-10℃。

10、在某些实施方式中，所述步骤(c)中的变温速度为35℃-62℃/分钟。在某些实施方式中，所述步骤(c)中的变温速度为45℃-62℃/分钟。在某些实施方式中，所述步骤(c)中的变温速度为50℃-62℃/分钟。在某些实施方式中，所述步骤(c)中的变温速度为45℃/分钟。在某些实施方式中，所述步骤(c)中的变温速度为50℃/分钟。在某些实施方式中，所述步骤(c)中的变温速度为52℃/分钟。在某些实施方式中，所述步骤(c)中的变温速度为62℃/分钟。在某些实施方式中，所述第三温度为-60℃至-80℃。在某些实施方式中，所述第三温度为-76℃至-80℃。在某些实施方式中，所述第三温度为-80℃。

11、在某些实施方式中，所述步骤(d)中的变温速度为17℃-33℃/分钟。在某些实施方式中，所述步骤(d)中的变温速度为23℃-33℃/分钟。在某些实施方式中，所述步骤(d)中的变温速度为23℃-30℃/分钟。在某些实施方式中，所述步骤(d)中的变温速度为23℃-26℃/分钟。在某些实施方式中，所述步骤(d)中的变温速度为23℃/分钟。在某些实施方式中，所述步骤(d)中的变温速度为24℃/分钟。在某些实施方式中，所述步骤(d)中的变温速度为25℃/分钟。在某些实施方式中，所述步骤(d)中的变温速度为26℃/分钟。在某些实施方式中，所述步骤(d)中的变温速度为30℃/分钟。在某些实施方式中，所述步骤(d)中的变温速度为33℃/分钟。在某些实施方式中，所述第四温度为-12℃至-26℃。在某些实施方式中，所述第四温度为-20℃至-26℃。在某些实施方式中，所述第四温度为-20℃。在某些实施方式中，所述第四温度为-23℃。在某些实施方式中，所述第四温度为-26℃。

12、在某些实施方式中，所述步骤(e)中的变温速度为1℃/分钟。在某些实施方式中，所述第五温度为-40℃。

13、在某些实施方式中，所述步骤(f)中的变温速度为10℃/分钟。在某些实施方式中，所述第六温度为-80℃。在某些实施方式中，所述第六温度为-90℃。

14、在某些实施方式中，本技术的冻存方法在90分钟内将细胞样品降温至-80℃至以下。在某些实施方式中，本技术的冻存方法在60-75分钟内将细胞样品降温至-80℃以下。

15、在某些实施方式中，所述细胞样品装于冻存管中。在某些实施方式中，在进行所述程序降温前，将所述细胞样品的温度控制在所述第一温度。在某些实施方式中，在进行所述程序降温后，将降温后的细胞样品转移至液氮中储存。

16、在某些实施方式中，所述细胞为中国仓鼠卵巢细胞。在某些实施方式中，所述细胞样品中的细胞起始浓度为1×107-5×108细胞/ml。在某些实施方式中，所述细胞样品中的细胞起始浓度为5×107细胞/ml。

17、在某些实施方式中，所述冻存液为无血清冻存液，其包含无血清培养基、dmso、海藻糖、人白蛋白和甲基纤维素。在某些实施方式中，所述冻存液为无血清冻存液，其包含无血清培养基、5％-10％(v/v)dmso、0.05-0.1m海藻糖、5-10g/l人白蛋白和2-5g/l甲基纤维素。在某些实施方式中，所述无血清培养基选自cd cho培养基、cd optichotm培养基、hycellcho培养基、s3 cd cho培养基和s4 cho培养基。

18、在某些实施方式中，上述无血清冻存液包含7.5％(v/v)dmso。在某些的实施方式中，上述无血清冻存液包含10％(v/v)dmso。

19、在某些实施方式中，上述无血清冻存液包含0.05m海藻糖。在某些实施方式中，海藻糖的浓度为0.1m。

20、在某些实施方式中，上述无血清冻存液包含5g/l人白蛋白。在某些实施方式中，上述无血清冻存液包含10g/l人白蛋白。在某些实施方式中，无血清冻存液包含的人白蛋白系通过重组表达获得的。在某些实施方式中，无血清冻存液包含的人白蛋白包含天然人白蛋白序列或者是突变的人白蛋白序列。

21、在某些实施方式中，上述无血清冻存液包含2g/l甲基纤维素。在某些实施方式中，上述无血清冻存液包含5g/l甲基纤维素。

22、在某些实施方式中，上述无血清冻存包含无血清培养基、10％(v/v)dmso、0.05m海藻糖、10g/l人白蛋白和2g/l甲基纤维素。

23、在某些实施方式中，上述无血清冻存包含无血清培养基、7.5％(v/v)dmso、0.1m海藻糖、5g/l人白蛋白和2g/l甲基纤维素。

24、在某些实施方式中，上述无血清冻存包含无血清培养基、7.5％(v/v)dmso、0.05m海藻糖、10g/l人白蛋白和2g/l甲基纤维素。