一种诱导芸薹属植物茎生根尖的方法及其在染色体制片上的应用

本发明属于细胞遗传学领域，具体涉及一种诱导芸薹属植物茎生根尖的方法，还涉及上述方法在芸薹属植物染色体制片上的用途。

背景技术：

1、芸薹属(brassica l.)包含大量的栽培植物和野生植物，约占十字花科植物种类的1/10，芸薹属中这些众多的种类和多样的形态都源自芸薹属植物在长期进化和栽培驯化过程中经历了多轮杂交和多倍化。日本学者nagaharu提出芸薹属3个二倍体基本种和3个四倍体复合种之间的进化关系，3个二倍体基本种有白菜(b.rapa，aa,2n＝20)、黑芥(b.nigra，bb,2n＝16)和甘蓝(b.oleracea，cc,2n＝18)，它们两两杂交分别形成甘蓝型油菜(b.napus，aacc/ccaa，2n＝38)、芥菜型油菜(b.juncea，aabb,2n＝36)和埃塞俄比亚芥(b.carinata，bbcc,2n＝34)。除了a、b、c三个基本染色体组外，芸薹属植物还相应地存在三套亚基因组(ar,an,aj,bn,bj,bc,co,cn,cc)，该亚基因组内存在着丰富的遗传变异。研究表明,在油菜中开展亚基因组间杂种优势利用是增加油菜产量的有效途径之一,且通过导入属内其他物种中的相应亚基因组(ar,cc)替换原有的an和cn亚基因组,创建出新型甘蓝型油菜,发现新型甘蓝型油菜与常规甘蓝型油菜配制的杂种表现出很强的亚基因组间杂种优势。目前，远缘杂交和异源多倍化仍然是芸薹属植物改良的重要途径。在人工合成芸薹属多倍体时需要进行细胞遗传学鉴定，确定杂种的真实性或用于研究核型进化(cao等.pnas.2023.120.e2217672120)。而进行这些细胞遗传学鉴定的基础是中期染色体制片。

2、目前，用于制备芸薹属植物中期染色体的组织主要有幼嫩花芽、种子根(孔芳等.作物学报.2008.34.1188-1192.)。但是种子根数量有限且取根后会影响幼苗生长，因此，对于珍贵材料(特别是遗传或育种早代材料)不宜应用此法。幼嫩花蕾用于制片的取样时间和取材部位(柱头、花柱和子房)十分关键(张红梅等.园艺学报.2009.36.727-730.)，初学者不易掌握，且易于与处于减数分裂时期的细胞混淆。因此，用幼嫩花芽或种子根进行芸薹属植物的染色体制片都存在较大的缺点。

3、根尖作为体细胞，其有丝分裂产生的中期染色体是植株染色体信息的准确表征。若能获取到大量根尖而不影响植株生长发育，对于芸薹属植物细胞遗传学研究和多倍化育种都有重要意义。经检索，未发现诱导芸薹属植物茎生根尖的方法并将其用于染色体制片的报道。

技术实现思路

1、针对芸薹属植物染色体制片时种子根数量有限且取根后影响幼苗的生长，以及幼嫩花芽取材易与减数分裂细胞混淆等问题，本发明目的在于提供一种诱导芸薹属植物茎生根尖的方法。

2、本发明另一目的在于提供上述方法在芸薹属植物染色体制片上的应用。

3、本发明通过以下技术方案实现：

4、本发明一种诱导芸薹属植物茎生根尖的方法，包括如下步骤：

5、(1)茎秆环剥：待鉴定的芸薹属材料处于初花期时，剔除茎秆基部枯萎叶片，于距离地面5～10cm处用锋利刀片横向将茎秆表皮、皮层和韧皮部呈双环状切开，勿伤木质部，双环间距1～1.5cm；

6、(2)茎生根尖的诱导：①在茎秆基部、以及茎秆切口的上部8～12cm处涂抹薄荷油；②用棉签在步骤(1)所述茎秆的切口处均匀地涂抹萘乙酸，以及10％蜂蜜；③用高压繁殖盒包裹切口并使切口位于高压繁殖盒的几何中心处；④用基质填满高压繁殖盒、并用线绳缠绕固定；⑤用黑色塑料薄膜包裹高压繁殖盒；⑥将木棍(或其他类似木棍的替代物)插入土中，然后用绳子将环剥的茎秆绑到木棍上进行固定；⑦高压繁殖15～20天；

7、(3)根尖获取：在晴天的上午9:00～11:00时，打开黑色塑料薄膜，查看不定根生长情况；若见不定根生成，打开高压繁殖盒，用镊子于距离不定根尖端1～2cm处夹取根尖，将根尖用水洗净，立即放入带有双蒸水的ep管中，获得芸薹属植物的茎生根尖。

8、上述方法步骤(3)中，若仍需收集茎生根尖，则按步骤(2)重新安装高压繁殖盒，每隔5～10天夹取根尖，直至取够根尖或压条不再长根。

9、上述方法步骤(1)中所述的芸薹属植物是指芸薹属内植物、云薹属内的种间杂交种；此外，还包含芸薹属植物与菘蓝属(isatis)、芸芥属(eruca)、独行菜属(lepidium)、山芥属(barbarea)、葶苈属(drabeae)或大蒜芥属(sisymbrieae)等近缘属植物通过有性杂交或体细胞杂交合成的异源多倍体植物，且所述异源多倍体植物具有明显的主茎。

10、所述的芸薹属内植物包括大白菜(b.pekinensis)、芥菜(b.juncea)或甘蓝(b.oleracea)等。

11、所述的甘蓝包括结球甘蓝(b.oleracea var.capitata)、苤蓝(或称球茎甘蓝b.oleracea var.gongylodes)、菜花(或称花椰菜b.oleracea var.botrytis)、西兰花(青花甘蓝b.oleracea var.italica)、包芽菜(或称抱子甘蓝b.oleracea var.gemmifera)、紫包菜(或称紫甘蓝b.oleracea var.capitata rubra)或皱叶甘蓝(b.oleraceavar.subauda)等。

12、上述方法，其步骤(1)中所述的基质可自市场上购买；如丹麦进口的品氏泥炭土等。所述基质的使用方法：按照质量比为1.4～1.5:1的比例向品氏泥炭土(型号0-6)中加水，混合均匀即可。

13、上述方法步骤(2)中所述的萘乙酸是指10％萘乙酸可湿性粉剂的3000倍液。

14、上述方法步骤(2)中所述的10％蜂蜜是指重量百分比为10％蜂蜜。

15、上述方法，其步骤(2)、(3)中所述的高压繁殖盒的材质为透明塑料。高压繁殖盒可自市场上购买，或用透明的塑料瓶自制。以550ml农夫山泉矿泉水瓶为例，高压繁殖盒的制作方法为：沿着矿泉水瓶瓶口锥体与瓶体圆柱体交界线剪开，再用枝剪垂直于瓶底剪开瓶体，随后切口连着瓶底剪至瓶底中心处，并将瓶底中心处剪成与待高压植株茎秆基部直径大小一致的小孔。

16、上述方法，其步骤(3)中所述的根尖是指色白且根冠区直径大于0.5mm的幼嫩根尖。

17、上述方法在芸薹属植物染色体制片上的应用。

18、上述方法在芸薹属植物染色体鉴定上的应用。

19、本发明还提供了茎生根尖在芸薹属植物染色体制片上的应用，所述的茎生根尖按照上述方法制备。

20、本发明还提供了茎生根尖在芸薹属植物染色体鉴定上的应用，所述的茎生根尖按照上述方法制备。

21、本发明还提供一种利用茎生根尖进行芸薹属植物染色体制片的方法，包括如下步骤：

22、(1)根尖预处理：在室温下，将上述方法中所得茎生根尖用饱和α-溴萘预处理2～3h；

23、(2)固定：在4℃下，将经步骤(1)预处理的茎生根尖于3:1乙醇/冰醋酸溶液中固定12～24h；

24、(3)保存：将固定后的根尖依次通过95％、80％和70％乙醇梯度置换，每次置换停留20～30min，将固定液中的乙酸从根尖分生组织中置换掉，然后在-20℃下储存于70％乙醇中；

25、(4)酶解：用蒸馏水将储存的根尖洗涤3次，然后用锋利刀片切掉根尖分生组织前端的根冠区和后端的伸长区，再将根尖分生组织放入0.2ml pcr管中；在37℃下，按每个根尖加入混合酶液20μl的比例加入混合酶液，酶解30～40min；

26、(5)制片：将酶解后的分生组织通过压片、涂片、滴片或蒸片等方法进行染色体制片；还包括后续通过荧光原位杂交或基因组原位杂交完成染色体制片；

27、(6)镜检：在光学显微镜下，先用低倍镜(20×)寻找良好的中期分裂相，然后用高倍油镜(100×)观察染色体；选择染色体分散良好、形态清晰的细胞进行摄像。

28、上述方法步骤(4)中所述混合酶液的组成成分及其体积比为：5％(w/v)纤维素酶：5％(w/v)果胶裂解酶＝1：1。

29、所述混合酶液的制备方法，包括按照体积比为1：1的比例将5％(w/v)纤维素酶和5％(w/v)果胶裂解酶混合均匀即可。

30、与现有芸薹属植物染色体制片方法相比，本发明具有的优点和有益效果为：(1)本发明方法获取根尖数量多，且可分批多次获取；如本发明单次可以获得至少5个以上的幼嫩根尖，多则可达20余个幼嫩根尖用于染色体制片。而现有的种子发根获取根尖通常只有极少量根可用(通常1个初生根根尖)。(2)本发明将茎生根尖用于染色体制片效果好，染色体制片的中期染色体分裂相好，清晰，可真实展现鉴定植株的染色体数目，所得染色体鉴定结果真实、可靠；还可用于染色体核型、带型分析和原位杂交。而现有的通过植株幼嫩花芽获取的分生组织可能因取材不及时而进入减数分裂时期，并不能真实展现植株本身染色体信息。(3)由于是在地上的茎秆上取根，本发明方法取根后不影响芸薹属植物的正常生长发育，这对于珍贵的遗传材料以及需要单体染色体鉴定的远缘杂交育种后代具有非常重要的意义，同时对芸薹属植物细胞遗传学研究和多倍化育种都有重要意义。(4)本发明方法中在茎秆基部、以及茎秆切口的上部处涂抹薄荷油，可以驱赶蚂蚁防止其于高压繁殖盒中筑巢或活动。(5)本发明方法中在茎秆切口处涂抹蜂蜜是为避免受到病原菌的侵害。(6)本发明用木棍固定环剥的茎秆，以免因受到外力使茎秆折断，从而影响茎生根尖的形成和芸薹属植物的正常生长发育。(7)本发明方法中利用透明塑料制作高压繁殖盒，可随时观察生根情况。(8)本发明用黑色塑料薄膜包裹高压繁殖盒，可避免光线对根尖的影响。(9)本发明采用铝箔纸作为最外层包装，可起到反光隔热的作用，避免了高温对根尖发育的影响。