促进无子刺梨快速生根的组培方法

本技术涉及无子刺梨组培，特别是一种促进无子刺梨快速生根的组培方法。

背景技术：

1、无子刺梨(rosa sterilis s.d.shi)为蔷薇科蔷薇属多年生攀援小灌木，别名金刺梨、无籽刺梨和搭钩刺梨等。无子刺梨是1954年当地村民在贵州省兴义市兴仁县回龙镇狮子村云盘山上采挖草药时发现，1985年贵州省植物园时圣德先生将其正式定名为无子刺梨，属蔷薇属植物新种。2015年10月，国家林业局2015第18号公告正式授予植物新品种权。

2、无子刺梨果实富含黄酮类化合物、萜类化合物、多糖、超氧化物歧化酶、维生素和矿物质元素等，无子刺梨与传统水果刺梨(r.

3、roxburghii)，在贵州当地通常统称为刺梨，可以药食两用。无子刺梨中总黄酮含量明显高于普通刺梨，具有较强的抗氧化活性和降血糖活性，且果实香气浓郁，风味独特。

4、无子刺梨属分布范围窄的野生资源，资源稀少，且由于大多数胚珠不育，无种子或带少数败育的种子，故只能通过传统扦插方法进行种苗繁育，其扩繁速度相对较慢，易受多因素制约。加之随着具有较强药理活性的黄酮类化合物在功能性食品、化妆品和药品中的广泛应用，从无子刺梨组培苗中提取黄酮类化合物可有效满足市场需求。

5、现有cn201210541995.3中公开了一种无子刺梨种苗快速扩繁的方法，该方法采用无子刺梨当年生嫩茎作为外植体，启动培养基包括：6-ba和iba，增殖培养基包括：zt和iba，生根培养基包括：ms、iba和iaa激素建立组培体系。该方法中并未公开所得组培苗的生根率，且该方法通过选取生根苗将未生根苗排除后进行炼苗处理后在棚内移植。该方法回避组培苗生根率低的问题，无法保证处理后组培苗的生根率。

6、公开于背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域普通技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本技术针对上述技术问题提供了一种促进无子刺梨快速生根的组培方法，该方法可实现无子刺梨幼嫩茎组培苗的生根率大于等于94％，有效提高组培苗的生根率，可为无子刺梨的种质资源保护、大规模繁育及进一步开发利用奠定基础。

2、本技术提供了一种促进无子刺梨快速生根的组培方法，包括以下步骤：

3、1)将当年生的幼嫩茎段经过清洗、消毒、漂洗后，切成带1～3个叶腋的茎段，以叶腋朝上斜插于腋芽诱导培养基上进行诱导培养得到腋芽；

4、腋芽诱导培养基包括：ms+6-ba 0.1～2.0mg/l+naa0.1～0.5mg/l

5、培养条件：温度为26～30℃，光照强度2000～2500lx，光照周期比为光照时间：无光照时间为12～14h:12～10h，诱导培养25～30d；

6、2)待诱导出的腋芽长成3cm以上的组培苗后，将其切成带1～3个叶腋的茎段，然后叶腋朝上斜插于腋芽增殖培养基中进行增殖培养30～35d，得到无子刺梨组培苗；

7、所用腋芽增殖培养基包括：ms+6-ba 0.1～2.0mg/l+naa 0.01～0.2mg/l，

8、增殖培养条件为：温度为26～30℃，光照强度2000～2500lx，光照周期比为光照时间：无光照时间为12～14h:12～10h；

9、3)将所得无子刺梨组培苗转移至生根培养基中，进行诱导生根培养10～15d，得到无子刺梨生根苗；

10、生根培养基包括：ms+无子刺梨总糖提取物0.1～1.0mg/l；

11、生根培养条件为：温度26～30℃下，光照强度1500～1800lx，光照周期比为光照时间：无光照时间为10～12h:14～12h。

12、具体地，所用ms为市售植物组织培养常用培养基试剂，可以为phytotech产的murashige and skoog basal medium with vitamins(ms medium)(powder)的m519型ms培养基。

13、优选地，步骤2)中为待诱导出的腋芽长成3～4cm的组培苗后，切成带1～3个叶腋的茎段。

14、采用该操作，无需获取大量的当年生幼茎，即可以步骤2)中增殖得到的组培苗作为幼茎使用，节省步骤1)中的繁琐前处理操作，又能快速获得大量的组培苗，便于大量快速进行无子刺梨的扩繁，通过该步骤可有效提高该方法的增殖系数至3。

15、优选地，腋芽诱导培养基、腋芽增殖培养基、生根培养基均还包括：凝胶剂、白糖；白糖在培养基中的终浓度为25～30g/l，琼脂在培养基中的终浓度为5～6g/l，培养基最终ph5.5～6.0

16、优选地，各培养基的ph值均用1mol/l naoh或1mol/l的hcl调节；各的培养基的灭菌条件均为：121℃、101kpa下灭菌20min。

17、优选地，步骤1)中消毒操作为采用75％酒精浸泡清洗操作所得茎段10～30s后，在0.1％升汞中浸泡5～10min。

18、优选地，步骤1)中清洗操作为用洗洁精水快速冲洗5～10min，流水冲洗30～60min。

19、优选地，幼嫩茎段长为2～4cm，且去除幼嫩茎段上叶片。

20、优选地，步骤1)中漂洗为用无菌水漂洗4～5次。

21、优选地，步骤3)所用无子刺梨总糖提取物的制备方法：干燥无子刺梨新鲜果实在40～50℃烘干至恒重，粉碎过筛得到无子刺梨果实粉末，酶解，超声提取，抽滤得到上清液，用ab-8型大孔树脂纯化上清液，

22、收集所得滤液，经旋蒸浓缩后醇沉、离心得到沉淀，所得沉淀冻干后为无子刺梨总糖提取物。优选地，酶解操作中：蒸馏水与无子刺梨果实粉末按料液比25～30:1ml/g混合，并在所得混合溶液中添加蒸馏水体积2～3％的纤维素酶。

23、优选地，酶解条件为50℃下酶解40～60min。

24、优选地，超声提取条件为在40～50℃下，超声功率为300w的60％条件下提取40～60min。

25、优选地，醇沉操作为：浓缩液与95％乙醇按体积比为1:4混合后置于4℃下醇沉12小时。

26、优选地，离心操作为5000r/min下离心10min。

27、采用上述方法提前得到的无子刺梨总糖提取物纯度高，用于诱导组培苗的根时，生根效果更好。

28、具体地，该方法包括以下步骤：

29、(1)腋芽诱导的启动培养

30、在健壮的无子刺梨植株上获取当年生的幼嫩茎段作为外植体，外植体剪除叶片剪成2～4cm长的茎段，用洗洁精水快速冲洗5～10min，流水冲洗30～60min后置于超净工作台中，消毒采用75％酒精浸泡10～30s，0.1％升汞浸泡5～10min，消毒后用无菌水漂洗4～5次，切成带1～2个叶腋的茎段，然后叶腋朝上斜插于腋芽诱导培养基上进行培养，腋芽诱导培养基为：ms+0.5mg/l 6-ba+0.1mg/l naa，其中白糖30g/l，琼脂5g/l，ph5.5；培养温度为28±2℃，光照强度2000～2500lx，光照周期比中光照时间：无光照时间为14h:10h。诱导25d后，芽诱导率为96％。

31、(2)腋芽的增殖培养

32、待诱导出的腋芽长成3cm以上的小苗后，将其切成带1～3个叶腋的茎段，然后叶腋朝上斜插于腋芽增殖培养基中进行培养，腋芽增殖培养基为：ms+1.0mg/l 6-ba+0.01mg/lnaa，其中白糖30g/l，琼脂5g/l，ph5.5；培养温度为28±2℃，光照强度2000～2500lx，光照周期比12h:12h。30d后(见图2)，小苗可长至3～4cm高，同时在叶腋处可诱导出新的不定芽小苗，反复将3～4cm高的小苗切成带1～3个叶腋的茎段转到相同的腋芽增殖培养基上进行增殖培养，可以使得无子刺梨进行大量快速的扩繁，其增殖系数为3。

33、(3)无子刺梨组培苗的生根诱导

34、将生长健壮的无子刺梨组培苗转移至生根培养基中，生根培养基为：ms+0.2mg/l无子刺梨总糖提取物，其中白糖30g/l，琼脂5g/l，ph5.5；培养温度26±2℃，光照强度1500～1800lx，光照周期比10h:14h。培养15d后，组培苗(见图3)即可生长出数条根系，生根率为94％。

35、无子刺梨总糖提取物的制备方法，将无子刺梨果实洗净自然晾干后置于50℃烘箱烘干至恒重，粉碎过40目筛后备用。取适量无子刺梨粉末，按料液比25:1ml/g加入蒸馏水和3％的纤维素酶，在50℃恒温水浴锅中酶解40min，在超声温度为50℃，超声功率为60％(300w)的条件下提取40min，结束后抽滤去上清液。所得上清液用ab-8型大孔树脂纯化，收集过滤液体并通过旋转蒸发仪浓缩，浓缩液按1:4的比例加入95％乙醇，置于4℃冰箱醇沉12小时后，离心(5000/min，10min)取沉淀，冻干即得无子刺梨总糖提取物，提取率为15％。

36、本技术能产生的有益效果包括：

37、1)本技术所提供的促进无子刺梨快速生根的组培方法，该方法有利于无子刺梨无菌苗的诱导、增殖，能实现无子刺梨无菌苗完成快速生根，该方法的外植体诱导成功率达97％以上，所得芽苗健壮，生长快，诱导培养芽苗生根率达95％，10～15天即可完成组培苗的生根培养。

38、2)本技术所提供的促进无子刺梨快速生根的组培方法，该方法中以ms+6-ba+naa作为诱导培养基、腋芽增殖培养基中的主要调节激素，并以0.2mg/l无子刺梨总糖提取物作为生根培养基实现快速生根，该方法扩繁速度快、周期短、生根迅速、成本低，完全能满足大面积规模化栽培的需求，具有良好的应用前景。