海产绿藻之培养方法

专利名称:海产绿藻之培养方法
本发明系关于海产绿藻之培养方法，尤指可提高廿碳五烯酸含量，以提高所培养之海产绿藻中总脂价含量，且可加速生育速度的海产绿藻培养方法。
廿碳五烯酸(Eicosapentanoicacid以下称EPA)是生物体内各种前列腺素(Prostaglandin)关联物质之前驱体，近年来因发现具有抗血小板凝集等生理活性，颇受瞩目。以往，EPA虽可由鱼油分离精制，但对鱼油中之总脂质而言，EPA含量低至10-15%左右，且在鱼油中，EPA以外的高纯度不饱和脂肪酸中，含有较大量与EPA构造相似的脂肪酸，不容易进一步加以浓缩。
另方面，海产绿藻在一定条件下培养时，其EPA含量可达相当于总脂肪酸量之30%左右或以上，比鱼油为高。然而，海产绿藻之生育速度慢，且总脂肪酸含量低，故绝对量亦低，为其问题所在。
因此，本发明之目的，在于提供一种海产绿藻之培养方法，可提高总脂质量(因而可提高EPA含量)而且可提高生育速度。
依照本发明所提供之海产绿藻培养方法，是利用海水系培养基培养海产绿藻，其特征为，在该培养基中，添加选自碳酸氢盐，乙酸和乙酸盐中，至少一种为碳源，并加生物素加以培养者。
兹进一步详述本发明。
如上所述，本发明海产绿藻之培养方法，其特征在于采用之培养基，系于海水系培养基中添加特定碳源及生物素。
所用基本培养基，凡天然海水或人工海水(总称「海水培养基」)均可用。然而，在培养基中之氯化钠浓度以0.1-0.2重量%为佳(使用天然海水时，可藉加水等以调节其浓度)。氯化钠含量超出此范围时，生育速度会显著下降，附带降低EPA含量。
依照本发明，在上述海水系培养基所添加之碳源，有碳酸氢盐，乙酸，乙酸盐，或其任二种以上之混合物。此碳源之添加量，通常为每公升培养基约30至1000毫克。此添加量未满30毫克/公升培养基，则结果无法提高所培养绿藻之总脂质含量，另方面，添加量如超过1000毫克/公升培养基，显示不出效果有何特殊提高。碳源较佳添加量为100-600毫克/公升培养基。碳酸氢钠之例有碳酸氢钠，碳酸氢钾等，乙酸盐则有乙酸钠，乙酸钾，乙酸铵等。
依照本发明，与上述碳源同时添加于海水系培养基的生物素(biotin)，其量无特别规定，惟在0.1微克/公升培养基以下时，几天效果。生物素较佳添加量为0.5-10微克。
除上述碳源和生物素外，海水系培养基尚可添加硫酸铵等氮源，过酸钙等磷源。氮源以约100毫克/公升培养基之比率，而磷源以约10毫克/公升培养基之比率添加为佳。
培养基之pH值会随培养时间经过而变化，但至少在海产绿藻培养开始之前(即海产绿藻接种之前)的培养基，以设定于6至8之pH值为佳。
在本发明中，采用上述培养基时，海产绿藻(例如chlorellaminutissima)最好在15℃至25℃温度培养。培养温度超出此范围时，生育速度下降，且绿藻中EPA含量有下降之虞。培养种间通常为3-20天。
依照本发明培养海产绿藻时，绿藻接种量无特别限制，通常是以0-0.5克(湿菌体重量)/公升培养基之比率接种。
依照本发明海产绿藻培养方法，可加快生育速度，保持总脂质中所占EPA含量高，得以安定生产总脂质含量高之海产绿藻，此与选自碳酸氢盐，乙酸和乙酸盐群中选出之至少一种碳源，以及生物素的相乘效果，据推论系脂肪酸生成第一步骤中，促进丙二醯基COA生成之故。
又，利用光合作用之碳源供给方法，已知有将碳酸气在暴气中混入之方法，但依本发明，与习知方法相较，碳源之利用较佳，可降低生产成本。
依照本发明培养海产绿藻后，将培养绿藻菌体以适当溶剂，例如己烷和异丙醇之混合溶剂萃取，分离脂质成分，利用常法卤化分解。除去不卤化成分后，收集脂肪酸，以尿素附加物法饱和，并除去不饱和单脂肪酸。如此所得脂肪酸，其EPA含量相当高，如欲再提高纯度，则可利用矽胶等柱型色层分析法。藉此柱型色层分析法分离，可得95%以上之纯度。
兹记述本发明实例如下。
实施例表1所示碳源和生物素，分别以该表所示比率(/公升培养基)，添加于海水系基本培养液(以下称BM)调制成培养基，pH调节至7.4。基本培养液之组成如表2所示。如此备妥之各培养基。接种海产绿藻(0.1克/公升培养基)后以萤光灯连续照射，在20℃，于暴气下培养4天。培养完成后，利用离心分离法收集菌体冷冻干燥后，萃取脂质，分析脂肪酸组成分。结果如表3所示。又，生育速度是以培养完成时的菌体浓度(湿菌体重量/公升培养基)表示。
表1(培养基组成分)
由表3所示结果可知，本发明方法(培养基4-6)与其他方法(培养基1-3)相较，确定生育速度加快，总脂质含量增加。此结果虽不改变EPA含量，但依照本发明，可显著提高EPA的总收量。
权利要求
1.海产绿藻之培养方法，系利用海水系培养基培养海产绿藻，其特征为，在该培养基中，添加选自碳酸氢钠，乙酸和乙酸钠中至少一种碳源，以及生物素，加以培养者。
2.如请求专利部分第1项之培养方法，其中，碳源添加量为每公升培养基30-1000毫克者。
3.如请求专利部分第1或2项之培养方法，其中，生物素添加量为每公升培养基0.5-10微克者。
专利摘要
海产绿藻之培养方法，系利用海水系培养基进行培养海产绿藻，其特征为，于该培养基中，添加选自碳酸氢盐、乙酸和乙酸盐中至少一种为碳源，并加生物素(biotin)以进行培养者。
文档编号A01G33/00GK85103042SQ85103042
公开日1986年10月15日 申请日期1985年4月20日
发明者濑户明, 藤田匡 申请人:日清制油株式会社