专利名称：人参植株再生法的制作方法
技术领域：
本发明涉及用组织培养产生人参再生植株的一种方法。
人参(PanaxginsengC.A.Meyer)的根，是一种重要的中药，长久以来被认为是一种卓有成效的健胃药或(和)滋补药，目前仍是一种贵重药材，且需求量大。这不仅因为人参受地理分布限制，也因为人参栽培上的不利因素，例如，栽培期长和易感多种病害。已开展了旨在解决这些问题的人参育种工作。过去若干年的人参组织培养研究是为了其繁殖和育种材料的生产。最近已报道，通过人参分离块的愈伤组织诱导、愈伤组织繁殖、不定胚(体细胞胚或胚状体)诱导以及其后的再生，产生人参的再生植株。〔TheoreticalandAppliedGenetics，57卷，133-135页(1980);Nature，284卷，341-342页(1980)〕但是，应用所报道过的方法，使用各种人参分离块进行有效性试验并不产生再生植株。因此，这种方法既不能通用又不能重复。所以，理想的办法是创建一种能高度通用和能重复的人参再生植株生产方法。
在从事改善产生人参再生植株常规方法的栽培条件时，发明者发现，在不含有2，4-二氯苯氧基乙酸(以下简称2，4-滴)但含有低浓度的无机盐或(和)10-40毫克/升细胞激动素的一种培养基中诱导不定胚，不但能完成不定胚的诱导，也能实现植株再生。使用含有低浓度无机盐的培养基能加速再生过程。本发明就是在此事实基础上研究出来的。
也就是说，本发明涉及(1)它是通过人参分离块的愈伤组织诱导、愈伤组织繁殖、不定胚诱导以及其后的再生产生人参再生植株的一种方法，其特点是不定胚诱导的培养基为10-40毫克/升细胞激动素的稀释1/1至1/4的MS培养基，(2)如(1)中所述产生人参再生植株的方法其特点是在含有低浓度无机盐的培养基上进行再生。
本方法的具体做法是在人参分离块进行愈伤组织诱导、愈伤组织繁殖和不定胚诱导时，使用含有10-40毫克/升的细胞激动素的稀释1/1至1/4的MS培养基诱导不定胚，然后用常规方法再生。
本方法的每一具体步骤详述如下。
(A)分离块将组织培养等用于常规方法以制备人参分离块。虽然人参年龄并非关键，但推荐使用1-6年的人参。在本发明中，使用的参龄以发芽后0至1或2周的人参最为有利。制备分离块要取自人参茁壮发育部位，如根、子叶、(下)胚轴和小叶。用根、子叶等制备分离块尤佳。使用2年或更老的人参时，建议用小叶等制备，尤其应采用正在张开的或刚张开的小叶。
更具体地说，所用的人参部分要先用水充分清洗。在清洗中可使用磨光粉或表面活性剂，如Tween20(KaoAtlas)。在清洗过程中也可采用浸洗等法。在用水清洗后，将清洗过部分加以消毒。能使用的消毒剂包括碱金属次氯酸盐，如次氯酸钠和次氯酸钾，碱土金属次氯酸盐，如次氯酸钙，醇，如50～100%(W/V)的乙醇)，氯化汞，转化皂，Tween20，氯胺和过氧化氢水。这些消毒剂可以单独使用，也可二种或多种混合使用。若需要这些消毒剂可用于适合溶剂的溶液中，例如可用于去离子水和蒸馏水。用常规方法完成消毒，如冲洗、浸渍冲洗、喷雾和搅拌。在这些方法中推荐使用浸渍冲洗及其相似的方法。根据人参部位、污染程度、消毒剂类型和消毒方法这些因素，合适地确定消毒剂的应用条件，如浓度和处理时间。建议用无菌水等彻底将人参消毒部份的消毒剂洗净。更具体地说，将乙醇和次氯酸钠溶液均作为消毒剂时，把要利用的人参部位先浸在70%(W/V)的乙醇中达5-60秒钟，在消毒水中浸渍冲洗1～5分钟，然后浸在0.5～10%(W/V)的次氯酸钠水溶液中达2～60分钟。之后，用消毒水冲洗2～5次，每次冲洗时间为5～10分钟。在对人参的子叶或小叶进行消毒时，这种方法有能使人参器官消毒而对组织无损伤，因而是卓有成效的。换言之，建议所利用的子叶或小叶，正如上所述的在70%(W/V)乙醇中浸渍后用消毒水冲洗，然后在3～10%(W/V)过氧化氢水中浸渍消毒10～60分钟后用消毒水漂洗。如果使用上述方法有困难，例如用根作分离块时，则在下一阶段的愈伤组织诱导过程中，在培养基中添加浓度为10～100毫克/升的抗生素如链霉素，这样就有可能使器官得到消毒。建议在按上述方法将人参消毒之后，本发明的一切工序均应在无菌条件下完成。
在用上述方法进行消毒后，可将人参的每个部位切成分离块(组织切片)。切块的大小为3～10毫米长×3～10毫米宽×0.5～5毫米厚。一般使用约5毫米正方形和2毫米厚的切块。推荐用手术刀、剃刀、剪刀、软木钻孔器和镊子这样的工具制作切片。这些切片工具使用以前宜用高压灭菌器消毒。建议以粗根做分离块时，用手术刀或其他切片工具切成小块后，要使用软木钻孔器这类工具。用上述工序制备的分离块，可用于下一步的愈伤组织诱导。
(B)愈伤组织诱导采用在产生愈伤组织的培养基上培养分离块的方法将人参分离块置于培养基中培养生长，实现愈伤组织诱导。此程序可使用常规方法。更具体地说，能够使用培养人参组织所使用的任何一种普通培养基。能使用的培养基包括Murashige-Skoog基本培养基(以下简称“MS培养基”)〔Physiologia Plantarum，15卷，473-479页(1962)〕，其改进培养基如Linsmaier-Skoog基本培养基〔Physiologia Plantarum，18卷，100-127页(1965)〕和Gamborg等人的基本培养基，称为B5培养基〔Experimental Cell Research，50卷，151-158页(1968)〕。这些培养基能使用的碳源包括如蔗糖、葡萄糖、果糖和麦芽糖等糖化物以及可溶淀粉。能够利用的氮源包括硝酸盐和铵盐。能够利用的无机盐包括那些含有磷、钾、钙、镁、锰、铜、锌、钼、硼、铁、钴和镍等元素的无机盐类。能够利用的有机化合物包括维生素，如肌醇、烟酸、盐酸吡哆素、盐酸硫胺素、泛酸钙、叶酸、对氨基苯甲酸、维生素H、胆碱盐酸盐、核黄素、抗坏血酸、维生素A、维生素D3和维生素B12;有机酸如丙酮酸钠、柠檬酸、苹果酸和富马酸;天然物质如椰子汁、酪蛋白水解液、酵母提取物和麦芽提取物。
视需要，培养基可添加琼脂、植物生长调节剂，如植物生长素、细胞激动素、赤霉素、芸苔素酐或其类似化合物，以及素莠定 (Picloram )
4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸)等。能够使用的植物生长素包括2，4-滴、2，3-二氯苯乙酸、3-吲哚基乙酸、吲哚-3-丁醇酸、1-萘乙酸、2-萘氧基乙酸、对氯苯氧基乙酸、2，4，5-三氯苯氧基乙酸和1-萘乙酰胺。能够使用的细胞激动素包括腺嘌呤型的细胞激动素和脲型细胞激动素等。使用的腺嘌呤型细胞激动素可包括6-苄(基)腺嘌呤、6-苄(基)腺(嘌呤核)苷、2-异戊烯腺嘌呤、激动素、玉米素、二氢(化)玉米素、玉米素核(糖核)苷、4-苄基氨基苯并咪唑、4-苄基氨基吡唑嘧啶等。使用的脲型细胞激动素可包括二苯脲、N-(2-甲基-4-吡啶基)-N′苯脲、N-(2，6-二氯-4-吡啶基)-N′-苯脲、N-(2-氯-4-吡啶基)-N′-苯脲等。能够使用的赤霉素包括游离赤霉素和束缚赤霉素等。使用的游离赤霉素包括赤霉素GA1至GA52等。使用的束缚赤霉素包括赤霉素糖基醚(即赤霉素A1、A3、A8、A26、A27、A29或A35糖苷等)、赤霉素糖基酯(如赤霉素A1、A4、A5、A9、A37、A38或A44糖基酯等)及其类似物。能够使用的芸苔素酐或其类似化合物包括芸苔素酐、粟固酮、多萜醇酐、高芸苔素酐、表芸苔素酐和降芸苔素酐等。其中一般使用的有植物生长素(如2，4-滴)、细胞激动素(如激动素)、赤霉素(如GA3)及类似化合物。只要愈伤组织诱导不受抑制，加进培养基的物质的浓度没有特别限制。植物生长素浓度的选择范围为2.5×10-6至2.5×10-4摩尔。1～5×10-5摩尔的范围为佳。细胞激动素的浓度选择范围为10-8至10-6摩尔。5×10-7～5×10-6摩尔的范围为佳。这些植物生长素和细胞激动素的至少一种掺加到培养基中。但是，在本发明中，细胞激动素和植物生长素结合使用比单独使用细胞激动素更可取。例如，建议掺加植物生长素和细胞激动素各一种。
此外，培养基的PH值可以用氢氧化钾、氢氧化钠和盐酸等调整。培养基PH值的选择范围为5.0至6.6。5.5至6.0的PH值为好。将人参分离块置于上述工序制备的培养基上进行培养(可在培养基表面固定，也可接种)。一般推荐一个培养容器仅容放一个分离块。培养温度可在10～30℃的范围内选择。其中以15～25°为佳。培养的时间为20～60天，但在培养开始一个月后，培养可以停止，这时愈伤组织诱导初次出现(生成约15毫米直径的愈伤组织)。在此愈伤组织诱导过程中，将分离块置于黑暗中或黑暗条件下培养，就能得到良好的结果。不需要特殊的通风，但通风条件仍因培养容器的大小和类型而异。将通过上述工序从人参分离块诱导的愈伤组织用于以后的愈伤组织繁殖。
(C)愈伤组织繁殖经上述愈伤组织诱导方法长出的愈伤组织，从原来的分离块上切下，移植至一种新培养基，然后在那种培养基上培养，因而使愈伤组织繁殖。愈伤组织繁殖也能用常规方法进行。更具体地说，能使用的培养基包括上述愈伤组织诱导过程所使用的那些培养基。培养基可补充植物生长素和细胞激动素。当使用这些培养基时，建议使用低浓度，如在10-7至10-5摩尔的范围内。在这种情况下，植物生长素和细胞激动素两者的浓度差别减缩至最小为佳。也就是说，这两种物质以相等浓度或低浓度加入时，将得到良好的效果。愈伤组织繁殖可通过约为2周至1.5月间隔的分培的方法进行。当用分培的方法进行愈伤组织繁殖时，有可能使用一种新培养基，其成分和组分含量可与老的培养基不同。例如，在一种MS培养基中繁殖的愈伤组织，可以移植至稀释二分之一的MS培养基上进行分培(以下称这种培养基为“1/2MS培养基”)。建议使用消毒镊子、手术刀和白金圈等用常规方法，在无菌条件下移植愈伤组织。通常，长至直径1～5厘米的1～2个愈伤组织，移植至5～30毫升的每种培养基上。也有可能将2～3个长至直径1～5厘米的愈伤组织，同时移植至大量(50～200毫升)的培养基上。培养温度可在愈伤组织诱导所使用的温度范围内选择。培养时间至少一个月，但当培养阶段超过一年，再生比例则下降。培养可在光下或黑暗条件下进行。按上述工序再生的愈伤组织，然后用于不定胚的诱导。
(D)不定胚诱导在本发明中，不定胚是通过培养愈伤组织而诱导的，该愈伤组织是在不含有2，4-滴的低浓度无机盐或/和10-40毫克/升的细胞激动素的培养基上按(C)段所述的愈伤组织繁殖的方法得到的。在常规方法中，或采用含有2，4-滴的培养基，或采用含有等于诱导/繁殖愈伤组织用的高浓度无机盐及低浓度(5毫克/升或5毫克/升以下)细胞激动素两者的培养基，来诱导不定胚。然而，在发明人所作的验证试验中，在上述培养基上未形成过不定胚。因此本发明采用不含2，4-滴而含低浓度无机盐或者/和10-40毫克/升细胞激动素的培养基。不含2，4-滴而含有可用于本发明的低浓度无机盐的培养基(除不含2，4-滴而含无机盐外，可包含有其他常用的附加物，例如10～40毫克/升细胞激动素。同时不含2，4-滴而含有可用于本发明的10～40毫克/升细胞激动素的培养基(除了不含2，4-滴而含细胞激动素外，可包含其他常用的附加物，例如低浓度的无机盐。可以应用的无机盐有(B)段中所述的那些种类。培养基中无机盐浓度应该低至100～2000毫克/升，408.5～1361.5毫克/升较好，680～1021毫克/升更好。具体地说，建议采用下述无机盐混合物。但是，可以适当地增加一些无机盐，也可适当地删掉下述一些成分。
无机盐浓度较适宜的浓度NH4NO360to550mg/l (275to412.5mg/l)KNO380to633mg/l (316to475mg/l)MgSO4·7H2O 35to123mg/l (61to92.5mg/l)MnSO4·4H2O 0.10to7.43mg/l (3.71to5.575mg/l)ZnSO4·7H2O 0.05to4.50mg/l (1.43to2.15mg/l)CuSO4·5H2O 0.0025to0.0100mg/l(0.0041to0.0063mg/l)CaCl2·2H2O 19to147mg/l (73to110mg/l)CoCl2·6H2O 0.0025to0.025mg/l (0.0041to0.0063mg/l)KI0.01to2.49mg/l(0.138to0.208mg/l)KH2PO412.5to57mg/l (28to42.5mg/l)H3BO30.025to2.07mg/l (1.03to1.55mg/l)Na2MoO4·2H2O 0.025to0.1mg/l (0.041to0.0625mg/l)FeSO4·7H2O 2.78to9.27mg/l (4.63to6.95mg/l)Na2-EDTA 3.73to12.43mg/l (6.21to9.33mg/l)(EDTA表示乙二胺四乙酸)
可以采用的细胞激动素包括(B)段中所述的那些种类。培养基中细胞激动素的浓度可在10-40毫克/升范围内加以选择。15-30毫克/升的范围比较好，20-25毫克/升的更好。培养基中还可以采用诸如(B)段中所谈到的那些其他附加物。当然，除了2，4-滴外，可将植物生长素加进培养基中，只要能达到本发明的目的。可以采用的植物生长素有(B)段中所述的那些种类。培养基中这些附加物的浓度，可根据无机盐的浓度适当加以调整。
不含2，4-滴而含低浓度无机盐的培养基以及可以用于本法中的培养基包括稀释1/3-1/10的MS培养基(以下称之为“1/3-1/10MS培养基”)。
1/4-1/6MS培养基尤为可取。不含2，4-滴而含10-40毫克/升细胞激动素的培养基以及可以应用的培养基，包括那些补充了10-40毫克/升细胞激动素的1/1-1/4MS培养基尤其是1/1-1/2MS培养基而制备的培养基。可以采用的细胞激动素包括(B)段中所述的那些种类。尤其是激动素等更好。因此本发明中适用于诱导不定胚的培养基中包括补充了10-40毫克/升激动素的1/1-1/2MS培养基而制备的一些培养基。
可以采用的培养条件包括(C)段中所述的那些条件。例如，可以在15-30℃下或在黑暗中或在照明条件下进行培养。可在每天以2000勒克司或更高的照明度照明12小时或12小时以上进行培养。培养一周至3个月后将形成不定胚。以上述方法所得的不定胚再经过再生过程发育成人参的再生植株。
(E)再生再生可以用常规方法进行。就是，可以将通过(D)段所述的过程而获得的不定胚，移植到适于植株再生的培养基上，然后在培养基上培养它们，通过上述方法，完成再生过程。不定胚经过各个阶段，如球形胚阶段、心形胚阶段和鱼雷形阶段，而形成成熟的胚。建议在鱼雷形胚阶段或在成熟胚阶段进行移植。移植可以通过转移一个含有不定胚的愈伤组织或者就是不定胚到各个培养基上来进行，因为只移植一个不定胚时，有些情况下再生过程可能要化费一段很长的时间，所以建议一次移植3-15个，最好是5-6个不定胚。
可以采用常规方法中所用的那些培养基作为不定胚再生的培养基。例如，可以用(B)段所述的愈伤组织诱导过程中所用的以及(C)段中所述的愈伤组织再生过程中所用的那些培养基。为了取得良好结果，建议采用含有低浓度无机盐的培养基，例如(D)段中所述的培养基，供再生之用。具体说，最常用的是1/3-1/10MS培养基(1/6-1/10MS培养基更为适合)。用植物生长素、细胞激动素或赤霉酸等补充的这些培养基都可促进再生作用。
培养可在植株再生的常规培养条件下进行。例如，推荐培养温度为5-30℃，15°-25℃更好。最好在光照条件下培养;可在人工照明条件下进行培养，照明度为2000-9000勒克司，每天照明11-20小时。培养湿度可于50-80%范围内选择。往往在培养1-3个月以后就可完成目不定胚形成植株(小植物)的再生过程。
用上述方法取得的小植物在形态学和生理学特性两方面非常一致，并可以通过分培等方法进行培养并在长时期种植它们。例如，用本法获得的小植物，通过每月一次的间隔把它们移植到1/10MS培养基上，可培养1年以上。用本法获得的小植株也可以在移植到土壤中后，用人参常规的栽培方法进行栽培。
例1用人参(Panax ginseng C.A.Meyer)幼苗(发芽后8天)的子叶作原料。子叶经自来水洗净后，浸在70%(重量/容积)乙醇中并用70%乙醇冲洗30秒钟，然后用无菌水冲洗1分钟。将每片冲洗过的子叶浸在1%(重量/容积)的次氯酸钠水溶液中进行消毒15分钟，以后用无菌水冲洗两次，每次冲洗5分钟。使用外科手术刀把每片子叶切成约5毫米的方形小块。另外，在MS培养基中加入2.5×10-5摩尔的2，4-滴作植物生长素、10-7摩尔的激动素作细胞激动素、0.4%(重量/容积)的酪蛋白氨基酸和0.8(重量/容积)洋菜制备成培养用的培养基。以1当量浓度的氢氧化钠将PH值调到5.8以后，每个试管(直径16毫米×长度180毫米)内装入10毫升这种制备好的培养基，作为培养每个切下的小块的培养基。也就是说，将每个小块放在试管内的10毫升培养基上，试管用摩顿瓶塞(Morton stopper)塞紧，然后放在25℃温度下于黑暗中培养小块1个月。培养1个月后，从每个小块切下形成的愈伤组织，移植到装有10毫升新的培养基的试管中。新培养基的制备是在MS培养基中既不加植物生长素，也不加细胞激动素，只加0.8%(重量/容积)的洋菜，用1当量浓度氢氧化钠水溶液调整PH值至5.8。移植后，每个试管用摩顿瓶塞塞紧，并把各个愈伤组织放在25℃温度下于黑暗中培养1个月，以获得更多的愈伤组织，以后再将形成的各个愈伤组织进一步移植到每个试管中10毫升新培养基上。制备的这种新培养基，是于稀释1/2的MS培养基中不加植物生长素或细胞激动素，而只加0.8%(重量/容积)的洋菜，用1当量浓度的氢氧化钠溶液调整PH值到5.8。移植后，每个试管用摩顿瓶塞塞紧，并把各个愈伤组织放在25℃温度下于黑暗中培养1个月。
将获得的愈伤组织切成约7-8毫米的小片，之后把每个小片移植到装有10毫升新培养基的各试管内。这种新培养基，是于稀释1/4的MS培养基中，既不加植物生长素也不加细胞激动素，而只加0.8%(重量/容积)的洋菜，用1当量浓度的氢氧化钠溶液调整PH值到5.8后制备而成的一种培养基。移植后，每个试管用摩顿瓶塞塞紧，每个小片放在25℃温度人工照明(每天16小时，2000勒克司)条件下培养，1个月后，用上述方法培养的愈伤组织分化出了不定胚。有的愈伤组织中甚至分化出了芽和根。将已分化出不定胚的各愈伤组织移植到装有10毫升新培养基的各试管中。把稀释1/10的MS培养基，不加植物生长素也不加细胞激动素而只加0.8%(重量/容积)洋菜，用1当量浓度氢氧化钠溶液调整PH值到5.8后制备成的一种培养基，作为培养基质。移植后，各个试管用摩顿瓶塞塞紧，把各个愈伤组织放在25℃温度人工照明(每天16小时，2000勒克司)条件下培养。
结果，每个不定胚经过成熟胚阶段分化出了一个芽，接着分化出了子叶，在成熟胚阶段早期分化的不定胚进一步表现出增厚性生长。根的分化发生在一个芽和子叶的分化之后。每个月，将这些不定胚再生出的植株反复移植到装有30毫升新培养基的各个锥形瓶(100毫升)内。这种新培养基的制备，是于1/10MS培养基中，既不加植物生长素，也不加细胞激动素，只加0.8%(重量/容积)洋菜，用1当量浓度氢氧化钠溶液调整PH值到5.8。移植后，用纸瓶塞将每个锥形瓶塞紧，每个植株放在25℃人工照明(每天16小时，2000勒克司)条件下培养，以使之进一步生长。
结果，小植株长大成像幼苗一样的正常植株，同时，通过继续分培，成功地保持了一年多的时间。而且，将这些再生植株移植到土壤中，并在土中培育。
例2用4年龄人参小叶的切片为原料。将小叶用自来水充分冲洗后，用70%(重量/容积)乙醇中浸渍和冲洗30秒钟，然后用无菌水冲洗1分钟，然后每片小叶浸于1%(重量/容积)次氯酸钠溶液中消毒15分钟，之后用无菌水冲洗2次，每次冲洗5分钟。用一外科手术刀把小叶切成约5毫米的方形小块。将切下的小块放在盛有10毫升的培养基的试管(直径16毫米×长度180毫米)内。
这种培养基，是于MS培养基中加入10-5摩尔2，4-滴作为植物生长素、10-7摩尔激动素作为细胞激动素加0.9%(W/V)洋菜，用1当量浓度的氢氧化钠溶液，将PH值调整到5.8后制备而成。每个试管用摩顿瓶塞塞紧，放在25℃温度下于黑暗中培养1个月。1个月后，将形成的愈伤组织从切块上切下，把获得的各个愈伤组织移植到装在一个试管内的10毫升新培养基上。通过于MS培养基中加入10-5摩尔2，4-滴作植物生长素加10-5摩尔激动素作细胞激动素和0.9%(重量/容积)洋菜，用1当量浓度的氢氧化钠溶液将PH值调整到5.8后制成的一种培养基，将它用作新培养基。移植以后，每个试管用一摩顿瓶塞塞紧，放在25℃温度下于黑暗中培养1个月。将获得的每个愈伤组织然后放入装有10毫升新培养基的试管内。新培养基的制备方法是，在MS培养基中不加2，4-D，只加入10-4摩尔的激动素和0.9%(W/V)的洋菜，用1N氢氧化钠溶液将PH值调至5.8移植后每个试管用摩顿瓶塞塞紧，每个愈伤组织在25℃的黑暗条件下培养1个月。
结果，每个培养的愈伤组织于1个月内分化出了不定胚，以后又分化出了芽。把见到器官分化的各个愈伤组织移植到装有10毫升培养基的试管内，或者移植到装有30毫升同样的培养基的100毫升锥形瓶内。这种培养基是于稀释1/4的MS培养基中不加植物生长素或细胞激动素，只加0.9%(重量/容积)的洋菜，以1当量浓度的氢氧化钠水溶液把酸碱值调整到5.8后制备而成。移植后，分别用摩顿瓶塞及纸瓶塞把试管和锥形瓶塞紧。然后将各愈伤组织放在25℃人工照明(每天16小时，2000勒克司)条件下培养1个月。
结果，从不定胚分化出来的芽各自发育出子叶，同时还可看到根的分化，从而得到了再生植株。
当采用常规方法时，这是不可能的，如果可能，要诱导出不定胚及人参再生植株是极为困难的，此外，它们的可重复性非常低。现在这种生产人参再生植株的方法，与常规方法不同，它能保证诱导出不定胚和植株再生，使之很容易产生人参的再生植株。
权利要求
1.一种通过愈伤组织诱导、愈伤组织再生、不定胚诱导以及再生等从人参分离块产生人参再生植株的方法，这种方法的特点是，在一种含有10～40毫克/升的细胞激动素的稀释1/1至1/4的MS培养基上进行不定胚诱导。
全文摘要
一种通过愈伤组织诱导愈伤组织再生、不定胚诱导以及再生等从人参分离块产生人参再生植株的方法，这种方法的特点是，在一种含有10～40毫克/升的细胞激动素的稀释1/1至1/4的MS培养基上进行不定胚诱导。
文档编号A01G7/00GK1039343SQ8910622
公开日1990年2月7日 申请日期1989年7月26日 优先权日1985年8月29日
发明者春日久男, 贵志豊和 申请人:武田药品工业株式会社