专利名称：化学试剂和细菌植物病原菌组合的生物除草剂的制作方法
本申请是1989年9月11日申请的序号为07/405138美国专利申请的接续。
本发明涉及一种通过用化学试剂如除草剂和细菌植物病原菌一起处理来控制有害植物生长的生物方法。
化学除草剂的广泛使用已使人们对正在介入环境中的大量化学试剂所产生的对生态学可能的有害影响引起注意。令人担忧的是这些化学品可能危及人类和动物的健康。特别要关注的是对农业工人健康的影响，他们可能面临影响其健康的高浓度的化学除草剂。事实上，在知晓了某些化学除草剂对环境和健康具有有害影响后，有必要从市场上取消或严格限制它们的使用。空的化学除草剂容器的处理受到严格管理，但对农民来说正确处理这些容器是不方便的并且是昂贵的。这些容器的处理地点受到限制，但不合法的容器处理成为越来越大的担忧。因此，需要导找一种减少用于控制杂草和其它有害植物的化学品用量的方法。
一种减少介入环境的化学除草剂量的策略是使用生物学上的微生物作为生物除草剂杀死杂草或抑制其生长。由于大量的已知植物病原菌是真菌，因此涉及生物除草剂的研究和商业利用都集中于使用可真菌除草的真菌。如Templeton的US3999973报道了使用Colletot richum malvarum作为真菌除草剂控制多刺的黄花稔属(Sida spinosaL.)。Van Dyke等人在US4606751中描述了使用Bipolaris sorghicola作为真菌除草剂控制约翰逊草(Johnsongrass，Sorghum haepense)的生长。Anderson等人的US4636386则公开了使用Alternaria zinniae控制意大利蓟(Carduus pycnocephalus)的生长。罗森镰孢霉属(Fusarium roseum)Culmorum可用作真菌除草剂控制黑藻(Hydrilla verticillata)的生长(Charudattan的US4263036)。为了进一步讨论真菌除草剂的使用，参见R.Charudattan的“使用天然和遗传学上变异的病原菌种属控制杂草”，载于M.A.Hoy和D.C.Herzog(eds)，农业IPM系统的生物学控制(Biological Control in Agricultural IPM Systems)，N.Y学术出版社，1985，PP.347～372，以及G.E.Templeton，“杂草的生物控制”，Amer.J.Alternative Agr.369-72(1989)。
已发展成真菌除草剂的真菌植物病原菌是主要的仅感染单一种属或窄范围的植物寄主种属的病原菌。真菌植物病原菌已被用作真菌除草剂来控制某种特定的植物。真菌不能发展成为大范围的真菌除草剂来控制多种杂草。使用真菌植物病原菌作真菌除草剂的另一缺点是，和植物病原细菌比较，它们相对较贵，并很难大规模地生长和在商业上应用。
某些情况下，化学除草剂可以和真菌除草剂组合使用以提高对那些对化学除草剂或真菌除草剂有耐药性的杂草的控制。E.g.，R.A.Klerk等人，微生物除草剂对稻谷(Oryza sativa)中的杂草和害虫的综合控制方法，杂草科学，3395-99(1985);Riley和Walker的US4755208。真菌除草剂和化学除草剂都对同种杂草起作用时也已将它们组合使用。参见，如US4776873(Caulder等)，然而尚未见报道用化学试剂来增加用作真菌除草剂的真菌的寄主范围。
尽管在正常条件下细菌植物病原菌通常感染窄范围的寄主的物种，但如果植物处于受迫状态时，它们时常能随机感染和伤害大范围的植物寄主。例如Pseudomonas Syringae pathovar(pv.)tabaci主要感染烟草植物(Nicotiana tabacum L.)，引起烟草迅速蔓延的病害。然而Pseudomonas syringae pv.tabaci能随机感染包含23个植物种属的大范围植物。G.B.Lucas，烟草病害，第三版，Raleigh，N.C.Biological Consulting Associates，1975，pp.397-409。当寄主植物受到环境胁迫时，那些能被Pseudomonas syringae pv.tabaci随机感染的植物种类的范围会增加，同上作者。其它种属的植物病原细菌也能随机感染和伤害受迫植物。D.F.Schoenweiss，“趋向、受迫和植物病害”(“Predisposition Stress and Plant Disease”)。Ann.Rev.Phytopathol.13193-211(1975)。但是，对于能感染大范围寄主的植物病原细菌的性能还未找到任何实际应用，因为还未得到发起可控制的，能再生的感染的方法，并且研究工作都集中在对不适于化学除草剂控制的单一杂草种类的控制上。因此，随机的植物病原细菌还没有被用作生物除草剂。
这样，在该技术领域中需要有能控制大范围的杂草种类，同时能降低为此目的所使用的化学除草剂量的组合物和方法。
现已发现化学试剂如化学除草剂可被用来协迫植物以某种方式引发细菌植物病原菌的随机感染。此发现使得将化学试剂和细菌植物病原菌组合使用以提供控制大范围杂草种类的方法成为可能。
尤其是，本发明通过提供一种能控制广谱杂草生长而同时减少达到此目的而使用的化学除草剂量的方法克服了现有技术中存在的问题和缺陷。由于细菌植物病原菌和化学试剂如除草剂共同施用于杂草，所以杂草的控制程度将大于单独使用化学品或植物病原细菌可能得到的结果。
因此，本发明的一个目的是提供一种控制杂草生长的方法，即使化学试剂如除草剂与感染植物的细菌组合使用。这样对杂草的控制要比单独使用同量的化学品得到的结果大的多。另一个目的是控制杂草的生长同时减少介入环境的化学品量，这样就减少了使用化学除草剂所带来的对工人的辐射量，环境负担以及容器处理等问题。再一个目的是提供一种比现行方法安全、便宜和有效的生物除草控制杂草生长的一般方法。提供一种一般方法以扩大被某种特殊化学除草剂控制的杂草范围是另一目的。本发明的其它目的和优点将在下面的说明书中部分地陈述，并且部分可从说明书中显而易见或可从本发明的实施中知晓。本发明的目的和优点将通过附加的权利要求书中特指的方法和组合物来实现和完成。
为达到本发明的目的，如本文中具体和概括地描述的，本发明的一个具体方案包括一种控制杂草的方法，即将一种化学试剂施用于杂草，并同时或相继将一种细菌植物病原菌施用于杂草，其中杂草生长的抑制或杂草的致死大于单独使用同量化学品或细菌可能得到的结果。本发明的另一个具体方案包括一种用于杂草控制的组合物，其中含有能感染受迫植物的细菌和一种能引起植物受迫并因此便于感染的化学试剂。
下面的一般描述是对发明的解释和说明，而不是限制。
图1表示单独使用麦草畏(0.61b/A)(虚线)或麦草畏加上Pseud omonas syringae pv.tabaci(实线)对三种杂草(白麻，金花狗尾草，稗)的作用效果。
图2表示单独使用草甘磷(0.25 1b/A)(虚线)或草甘磷加上Pseudomonas syringae pv.tabaci(实线)对牵牛花的作用效果。
对本申请来说，杂草指“任何讨厌的或妨碍人类活动或福利的植物”，除草剂(这里称之为化学除草剂)是指“用来控制，抑制，或杀死植物，或严重扰乱其正常生长过程的化学品”。美国杂草领域除草剂手册，第5版(1983)，xxi-xxiv。本文中使用的，术语“生物除草剂”意指用作控制、抑制、或杀死植物，或严重扰乱其正常生长过程的生物微生物。术语“真菌除草剂”指任何用来控制、抑制或杀死植物，或严重扰乱其正常生长过程的真菌微生物。
为实施本发明，将易使细菌感染的化学试剂和能随机感染的细菌植物病原菌都局部地施于杂草。用熟知的施药方法如喷雾或土壤浸渍将化学试剂和细菌植物病原菌施于杂草。
施药可以在芽前、芽后进行，或作为非选择性接触除草剂。在下述的优选具体方案中，化学试剂和细菌植物病原菌被施药于杂草。本发明可用于控制农业环境的杂草，也可用于非农业使用。例如，本发明可用以控制草地杂草和作为接触性除草剂来管理路旁植物。
化学品和植物病原细菌可同时使用。在其它情况下，较好的是先施用化学试剂，在其作用于植物一段时间后，再施用植物病原菌。同时施药或相继施药，哪个最好将取决于所选择的化学试剂和植物病原细菌的特殊组合。如果化学品和细菌同时施用，可以以同样的配方混合，并从同一容器中喷洒于杂草。为实施本发明组合物可以配制成多种方式，包括流动剂，干流动剂，水分散颗粒或乳化浓缩液。细菌植物病原菌的不同菌株或pathovars的混合物可用于实施本发明。实施本发明也可将不同的化学试剂的混合物与细菌植物病原菌连同使用。
本发明的配方中也可含有如表面活性剂和悬浮剂等助剂。通过施用悬浮在能维持或促进细菌生长的介质中的细菌可以促进和提高植物病原细菌的有效感染。这有助于杂草施药后这段时间里细菌的存活和生长，增加植物病原细菌成功地感染杂草的可能性。
可用各种化学试剂实施本发明。适宜的化学试剂需具备①对杂草具有伤害、胁迫或其它方式的作用，便于随机的致植物病害的细菌的感染;②不抑制植物病原细菌或不以其它方式干扰其随机感染植物的能力。不同类型的化学除草剂可用作化学试剂。起植物荷尔蒙的模仿物或光合作用抑制剂作用的除草剂可使植物易受细菌感染，但预期它们不会破坏或干扰细菌的活动。起新陈代谢抑制剂作用的除草剂可对某些细菌产生伤害，但使用那些抵抗或耐受或适应于新陈代谢抑制剂的致植物病害的细菌菌种仍可实施本发明。如果除草化学品与致植物病害的细菌分开使用，则可使用对细菌具有潜在伤害的试剂。下述的最佳实施方案中使用草甘磷，Sulfosate和麦草畏作为化学试剂。实施本发明也可使用阿特拉津和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。可用来实施本发明的其它化学除草剂见美国杂草学会除草剂手册，(Herbicide Handbook of the weed Society of America)，第5版(1983)，以及H.J.Lorenzini和L.S.Jeffrey的美国杂草及其控制(Weeds of the United States and their Control)，NYVan Nostrand，1987，表1.9。
除上述化学除草剂可用于本发明外，不适合用常规除草剂定义的化学品也可使用于本发明。尽管一种化学试剂单独使用不能杀死植物或严重扰乱其正常生长过程，但它可以胁迫植物使之受到随机细菌感染。例如，单独不能用作除草剂的植物荷尔蒙类似物仍然易于细菌的感染。实施在此描述的发明可以使用天然存在的细菌植物病原菌，它们很容易从公共保藏处获得或使用已知技术从土壤、植物、空气、水、昆虫等中分离。已发现Pseudomonas syringae pv.tabaci可用于此目的，但也可使用其它种属的植物病原细菌。例如，Pseudomonas solanacearum已成功地用于本发明。其它的植物病原细菌可选自几种原核生长细胞的genera，包括但并不限制于此假单胞菌属(Pseudomonas)，黄甲胞菌属(Xanthomonas)，土壤杆菌属(Agrobacterium)，欧文氏菌属(Erwinia)，棒状杆菌属(Corynebacterium)，链霉菌属(Streptomyces)和诺卡氏菌属(Nocardia)，见M.S.Mount和G.H.Lacy(eds.)的植物病原原核生物细胞(Phytopathogenic Prokaryotes)，Vol.1，N.Y.学术出版社，1982，PP19-29中N.W.Schaad的植物病原细菌的分类。此外，可以使用已知的分离或选择天然存的或诱发的突变株的技术得到具有其它所需特性的细菌。也可使用遗传工程和重组DNA的技术生产具有所需特性的细菌。
由于植物病原细菌普遍存在于自然界中，散布这些细菌菌种于田野里预期不会引起生态问题。然而如果希望降低细菌的持久性，可以施用几种方案。例如可以选择或用熟知技术由遗传工程生产那些当环境温度变化时将不能生存的对温度敏感的细菌作为突变株。因此，对冷敏感的细菌病原体可以在春天或夏天用作生物除草剂，在寒冷的冬天将致死。类似的，对高温敏感的细菌可在春天用作生物除草剂，在夏天比较高的温度下将死亡。
另一途径是选择植物病原细菌的营养突变株，它需要从被感染的植物上获得必需的而在环境中没有足够存在量的营养物。这些营养物可以包括氨基酸，核酸碱或维他命。这样的植物病原细菌将作用于活的杂草上，但如果未能感染杂草或在受感染的杂草死亡后，它们将不能生存。另一种限制细菌永久性存在的方法是运用重组DNA技术，产生含有“自杀基因”的细菌，该基因会限制细菌的持久性生存或使用后仅允许受限制的细菌繁殖。见R.Curtiss Ⅲ，工程微生物安全什么是必要的？M.Sussman等(eds.)，The Release of Genetically-engineered Microorganisms，N.Y.学术出版社，1988，pp.10-11。
本方法的优点是，与作为真菌除草剂的植物病原真菌不同，可用熟知的发酵技术使细菌植物病原菌更容易和更经济地大量繁殖。
应该认识到，在实施这个概括的方法控制杂草时，每种特定的化学试剂和特定的细菌病原菌以特定剂量将不一定有效，这和其它的广谱化学除草剂的行为是一致的，很难有效地控制所有类型的杂草，而通常是无力控制某些杂草种类。除草剂和细菌的一种特定组合是否将对某种应用有效，以及特殊组合的最佳条件可由本领域技术人员通过温室或田间的简单试验可容易地确定，不需过分的试验工作。一些原则可作为参数的选择指南。第一，当以单独使用除草剂对杂草产生微弱的或临界作用的量施用除草剂时，植物病原细菌的效果是最明显的。在一定剂量的除草剂已对杂草产生了很大程度的控制时，添加植物病原细菌的额外效用可能显示不出来。当杂草对所施的化学除草剂有部分反应时，生物除草剂的控制比较明显。草甘磷，麦草畏和Sulfosate这三种除草剂的最佳施药量在下面的实施例3到6中进行说明，改变化学除草剂浓度的影响见实施例7。第二，使用较大量的细菌可见较好的效果。在优选的实施方案中，植物病原细菌以至少5×105CFU/ml的浓度与化学品混合，优选的是106CFU/ml或更大的浓度。较优选的实施方案中细菌浓度为108CFU/ml。
第三，本技术领域的专业人员都清楚，尽管化学品的使用比例可以大大低于通常的田间使用比例(如实施例3和4中是25～50%;实施例5和6中是12.5%)，但化学品的某些含量太低将不会起有效的作用。因此在普遍优选的实施方案中(见实施例3和4)，麦草畏和草甘磷的施用量约是通常田间用量的1/2到1/4，而Sulfosate的用量在普遍优选的实施方案中(见实施例5到7)，约是田间需要量的1/8。在特殊的应用中，用量可以进一步的减少。
由于施用的植物病原细菌感染被化学试剂胁迫的植物，所以被植物病原细菌感染的植物寄主范围一般可扩大到化学除草剂活性的类似范围。然而，有时受化学除草剂控制的植物范围可能被扩大。由于田间施用率太低，某些种类的杂草不能被一特殊的除草剂控制，但除草剂的其它不明显的作用可足以便于随机感染。因此，一种广谱化学除草剂和一种细菌植物病原菌组合，不仅可以以较低剂量的化学除草剂控制同样范围的杂草种类，也可以控制通常不能被化学除草剂控制的杂草种类(如用麦草畏控制禾木科植物，见实施例3)。
本发明的实施有可能使化学除草剂的使用量进一步减少，使用者可以选择用更有效的芽后施药取代传统的除草剂芽前预防施药。根据需要可以仅选择性地使用与细菌植物病原菌连同的芽后化学除草剂，这对大量的预防性除草剂芽前使用提供了一种选择方案。由于成本和大多数芽后除草剂的受限范围此方法在过去一般是不可行的。
实施本发明可能还有额外的优点，即降低了与化学除草剂容器的处理有关的费用，它可通过减少使用化学除草剂的总量来实现。并且，细菌及某些细菌和化学品组合物的容器是可生物降解的。
下面的实施例是对优选的实施方案的说明而不是对其限制，本发明的真正范围在下面的权利要求书中给出。
实施例1说明了一种获得和培养优选的可用来实施本发明的植物病原细菌的方法。
实施例 1从美国典型培养基保藏处(American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852)(ATCC分离号＃11527)获得Pseudomonas syringae pv.tabaci。这种菌株被用于实施例1至4中，细菌在改性的King′s B培养基介质(表1)中生长。培养基中补充有锌，这可促进这些细菌毒素的生产。R.D.Durbin和T.F.Uchytil，锌在调节Tabtoxin生产过程中的作用，Experientia 41136-37(1985)。用橡皮淀帚将细菌从培养皿中刮出，并悬浮于水中，与化学除草剂混合。将系列稀释液分散到King′s B培养基的表面上，为鉴定生存能力和没有沾染物而进行试验。用Pseudomonas syringae pv.tabaci喷洒过的烟草叶上产生了黄色疾患，枯萎的、卷曲的叶子表明分离的菌种保持着毒力。
表1用锌改性的King′s B培养基(每升)胨No.3(Difco＊) 20g甘油 15mlK2HPO4·3H2O 1.5gMgSO4·7H2O 1.5g琼脂(Difco＊) 20gZnSO4·7H2O 0.0075gPH7.2King，E.O.，Ward，M.K.，和Raney，D.E.两个用来证明Pyocyanin和Fluorescin的简单介质。J.Lab.Clin.Med.44301-307(1954)。
＊Difco Laboratories，Inc.，Detroit，Michigan 48232。
实施例2说明了细菌和不同的化学试剂可混性的试验。并描述了实施本发明的方法。
实施例 2被试验的除草剂是麦草畏(3，6-二氯-O-茴香酸)，用量为0.25和0.5 1b/A(磅/英亩)，和草甘磷(N-(膦酰基甲基)甘氨酸)，用量为0.06和0.125 1b/A。选择的这些施药比例约是适宜的田间用量的25%和50%。每组试验都进行单独使用除草剂和除草剂与Pseudomonas syringae pv.tabaci混合使用的效果比较。不同试验中的Pseudomonas syringae pv.tabaci的浓度分布在105～106CFU/ml(菌落形成单位/ml)之间，但在每组特定试验中所有植物都得到相同浓度的细菌。在一些实验中，混合物中也含有CIDEKICKR的(4.75ml/quart)，一种表面活性剂，或ATTAGEL 40R(0.5%)，一种分散剂等作为助剂。CIDEKICKR由JLB International Chemical，Inc.(P.O.Box 6006，Vero Beach，Florida 32961-6006)制备，ATTAGEL 40R由Englehard Corporation(Specialty Chemicals Division，33 Wood Avenue South，Menlo Park CN 28，Edison，New Jersey 08818)制备。
初步实验表明，在混合容器中以使用浓度Pseudomonas syringae pv.tabaci在麦草畏和草甘磷中至少可存活120分钟。在CIDEKICKR(4.75ml/quart)或ATTAGEL 40R(0.5%)中其存活能力至少在120分钟内也没有明显伤害。而当Pseudomonas syringae pv.tabaci被悬浮于0.006 1b/gal的百草枯(二氯化1，1′-二甲基-4，4′-联阳离子吡啶)中时，则在1小时内被杀死。因此，百草枯不能用来和Pseudomonas syringae pv.tabaci混合。
下面的杂草被用来做试验曼陀罗(Datura stramonium)，白麻(Abutilon theophrasti)，牵牛花(Ipomea purpurea)，稗(Echino chloa crusgalli)，和金花狗尾草(Setaria glauca)。这些被选为中耕作物中具有经济价值的杂草，并作为整个植物属的代表。烟草植物(Nicotiana tabacum L.)被用来试验Pseudomonas syringae pv.tabaci的毒性。在温室中，在一般温室条件下，秧苗在4英寸的容器中生长。植物在一个密闭的有机玻璃房间里按指定设计方式处理，即用一个接有水流喷嘴的CO2压力喷雾器喷洒药物，水流喷嘴装在房间的顶端。喷嘴以15磅/平方英寸(psi)压力喷量约为25加仑/英亩(gpa)。实验设计为随机的完整区段设计，每次处理重复2次，每次重复试验使用2种植物。施药后用塑料袋罩住所有用Pseudomonas syringae pv.tabaci处理过的植物约1小时。
每周对伤害进行评价，以0～100计，0表示无伤害，100表示植物死亡。这种评价方式广泛应用于对除草剂效果的估价(如Eberlein等，杂草科学36792-799(1988))。
为了证实杂草已被同除草剂一起喷洒到植物上的致植物病害病菌所感染，将Pseudomonas syringae pv.tabaci培养成对抗菌素、利福平具有抵抗作用的突变株。使Pseudomonas syringaepv.tabaci(ATCC菌株11527和15373)培养物在含有100微克/毫升的利福平的介质中生长，繁殖具有抗药力的菌落供进一步研究。将选择的菌种移植到烟草植物上验证其毒力。然后从烟草植物的损伤处将Pseudomonas syringaepv.tabaci菌种再分离出来，进一步在含有100微升/毫升利福平的培养基中繁殖。选择一个菌株和化学除草剂组合在杂草上进一步试验，由Pseudomonas syringaepv.tabaci突变株和化学除草剂的组合可观察到对杂草的控制有所增强，不过细菌突变株在增强杂草控制的作用上效果低于原始菌种抗利福平的Pseudomonas syringaepv.tabaci是从被感染的杂草中分离的，这说明与化学除草剂一同施用的细菌是感染源。
实施例3和4说明了使用两种不同的化学试剂实施本发明的结果。
实施例 3五种杂草(曼陀罗、白麻、牵牛花、稗和金花狗尾草)用0.061b/A的麦草畏处理，含或不含Pseudomonas syringaepv.tabaci。Pseudomonas syringae pv.tabaci的用量约是5×105CFU/ml，包括CIDEKICKR，4.75ml/quart，作为助剂。施药时的温度为82°F，在第7，14，20，28天时估价伤害程度。白麻，金花狗尾草和稗的结果见
图1，这三种杂草的结果表明，当细菌和麦草畏共同施用于杂草时，其伤害程度明显大于单独施用麦草畏。曼陀罗和牵牛花(未表示)仅单独使用麦草畏其控制程度已相当高(60～100%)，因而当含有Pseudomonas syringae pv.tabaci时造成的伤害没有明显的增加。
特别有趣的是对稗和金花狗尾草控制的显著加强，因为麦草畏通常最有效于阔叶杂草，而对禾木科植物则相对无效。因而，细菌病原菌同麦草畏组合增加了可被化学除草剂控制的杂草种类范围，甚至除草剂的用量也低于田间适宜量。麦草畏适宜的田间用量范围为0.25～8.0 1b/A。
实施例 4五种杂草(曼陀罗、白麻、牵牛花、稗和金花狗尾草)用0.251b/A的草甘磷喷洒，含或不含Pseudomonas syringae pv.tabaci，含有4.75ml/quart的CIDEKICKR作为助剂。Pseudomonas syringae pv.tabaci的施药量约为5×105CFU/ml，施药时的温度为82°F。在第7，14，20和28天时评价其伤害程度。
单独使用草甘磷已给曼陀罗，白麻，稗和金花狗尾草以相当高程度的控制(57.5～100%)，所以加进Pseudomonas syringae pv.tabaci时，控制无显著变化。然而，牵牛花对单独使用0.25 1b/A的草甘磷具有较大的抗药性，当Pseudomonas syringae pv.tabaci和草甘磷组合使用时，增加了对牵牛花的伤害(图2)。因此草甘磷和细菌病原菌组合使用增加了受除草剂控制的杂草种类范围，甚至除草剂的量也低于适宜的田间使用量。草甘磷田间适宜的用量范围在0.5～4.0 1b/A。
实施例 5在温室条件下，试验Pseudomonas syringae pv.tabaci与从ICI Agricultural Products，wilmington，Delaware获得的除草剂Sulfosate(三甲基锍羧基甲基氨基甲基膦酸盐，公开于US4315765)的组合效果。在实施例5至7中，使用的Pseudomonas syringae pv.tabaci菌株(ATCC＃55090)是在马里兰由Arvydas Grybauskas博士(the Department of Botany，University of Maryland，College Park，Maryland)从烟草植物中分离的。对九种杂草进行效果评价，其中包括阔叶杂草(牵牛花，白麻，苍耳属植物[Xanthium strumarium]，反枝苋[Amaranthus retroflexus]和曼陀罗)以及禾木科植物(稗，金花狗尾草，约翰逊草和秋稷[Panicum dichotomiflorum])。比较四种处理结果单独使用水，单独使用Sulfosate，单独使用Pseudomonas syringae pv.tabaci，或Sulfosate加上Pseudomonas syringae pv.tabaci。Sulfosate的用量为0.6 1b/A，是适宜田间用量的1/8。细菌的用量大约是108CFU/ml。所有的溶液(包括水控制处理)包含0.25%(v/v)的ORTHO X-77R作为助剂。X-77R是从Chevron化学公司购得的分散剂。据制造商说X-77R中的活性试剂是烷基芳基聚氧乙烯乙二醇、游离脂肪酸和异丙醇。如前面的实施例，测定其伤害百分数。伤害百分数的测定方法见杂草科学中的研究方法(Research Methods in Weed Science)，第3版，Southern Weed Science Society，1986，P37。
为使处理标准化。所有溶液都使用Devries Manufacturing(Hollandale，Minnesota)制造的从R & D Sprayers，Inc.(Opelousas，Louisiana)购买的Model SB8 Spray Booth喷洒到杂草上。这种装置有利于试验溶液能高度再生喷雾。喷雾器装有压力为23～25psi的喷嘴，喷出量为25gpa。喷嘴的喷速为3.0英里/小时。植物在室内个别喷雾。与实施例3和4不同的是植物在喷雾后不置于塑料袋中。
进行两个试验。第一个试验中处理后第3，9和17天评价伤害程度，第二个试验中处理后第4，9和17天评价伤害程度。试验设计为随机的完整区段设计，每次处理进行2次重复试验，每次重复试验至少用2种植物。伤害值(表2)用重复实验数据的平均值表示。约翰逊草仅用于第二个试验中。第二个试验在春末进行。在此期间杂草经受较高的平均环境温度。
试验结果见表2，正如所希望的，以仅含X-77R助剂的水喷洒杂草，基本上不产生伤害。杂草对使用的低剂量Sulfosate的敏感性是不同的，阔叶杂草显示某些伤害(尤其在第二个试验中)，而对禾木科植物几乎没有或根本没有伤害。单独使用细菌(表2A)在第一个试验早期时对阔叶杂草产生一些伤害，之后，植物即恢复，而对禾木科植物则无伤害。
用Sulfosate和Pseudomonas syringae pv.tabaci的组合物(表2A)处理杂草显示的伤害程度一般要比单独使用它们处理杂草所产生的结果大。在两个试验中，阔叶杂草显示了很大程度的伤害。禾木科植物用组合物处理，在第一个试验中显示了很大程度的伤害，而在第二个试验中产生了较小的效果。第一、二个试验的详细差别要联系于环境因素如季节、温度和光线量。
实施例6说明了在液体培养基中生长的细菌的使用。
实施例 6替代在琼脂培养基培养皿上生长，令Pseudomonas syringae pv.tabaci在省去了琼脂的King′s B介质的液体培养基中生长。在28℃下，在一转速为180-190r.p.m的旋转震荡器(New Brunswick G10 gyroshaker)上，令细胞在2升的爱伦美(Erlenmeyer)烧瓶中培养64小时，直到细胞达到大约109CFU/ml的浓度。含有细菌细胞的介质用新鲜培养基介质稀释到浓度为108CFU/ml。加入X-77R后，所得的悬浮液在实施例5中描述的实验中作为另外的处理组(单独使用Pseudomonas syringae pv.tabaci或与Sulfosate组合使用)。
结果见表2中的B部分。某些阔叶杂草，尤其是牵牛花易于被单独使用的Pseudomonas syringae pv.tabaci所伤害，但是禾木科植物基本上无伤害。然而，所有植物在用Sulfosate和Pseudomonassyringae pv.tabaci的组合物处理后都显示了很大的伤害，其程度一般大于单独使用Sulfosate或细菌所产生的伤害。值得注意的是，尽管Sulfosate和细菌单独使用时，禾木科植物都对其有抗药力，但当Sulfosate和细菌组合使用时，则都产生了很大伤害。
实施例7说明了改变Sulfosate使用量带来的影响。
实施例7试验基本上和实施例6的方案相同，但是改变了Sulfosate的使用量。Sulfosate的使用量分别是适宜田间应用量0.48 1b/A的1/2，1/4，1/12(即分别为0.24，0.12和0.04 1b/A)。Pseudomonas syringae pv.tabaci生长在液体培养基中，用量约为108CFU/ml。
Sulfosate用量为适宜田间量的1/2，1/4时都产生了显著的伤害。单独使用Sulfosate产生的伤害程度对于阔叶杂草超过40%，对于禾木科植物是25%或更多。这些结果和通常的观察结果是一致的，即在温室条件下，与田间相比植物对同量的除草剂常常具有更大的敏感性。
施用Pseudomonas syringae pv.tabaci与1/4的Sulfosate的组合物一般可增大伤害程度。对于Sulfosate施用量为适宜田间用量的1/4时的增加程度注意较小，而观察的多是Sulfosate施用量为适宜田间量的1/8时的增加程度(见表2B)。例如单独使用0.12 1b/A的Sulfosate，牵牛花4天时显示42.5%的伤害，17天时则为47.5%的伤害。加上Pseudomonas syringae pv.tabaci后，伤害程度分别是50.0%和65.0%。单独施用1/4适宜田间用量的Sulfosate于稗草，在上述两个时间点都显示了27.5%的伤害。加入细菌后，4天时的伤害程度是30%，17天时是47.5%。单独使用Sulfosate其它杂草显示了较高程度的伤害。并且在某些情况下，当把Pseudomonas syringae pv.tabaci加入Sulfosate时伤害程度不再增加。
表3表示了Sulfosate的用量为适宜田间量的1/12时的结果，在此应用剂量，只有反枝苋对单独使用的Sulfosate较敏感。Sulfosate和Pseudomonas syringae pv.tabaci的组合物对所有的阔叶杂草和金花狗尾草都显示了增大了的伤害。
当与实施例5的结果相比较时，这些结果表明将植物病原细菌加到化学除草剂中能增大一系列除草剂浓度对杂草的伤害能力。然而当单独使用除草剂，且选择的量产生了可测的但低程度的伤害时，如实施例6中的情况，此时化学除草剂和植物病原细菌组合尤其有效。
在不违背本发明范围或精神的情况下，实施本发明时可作种种改进和变更，这对于本技术领域的专业人员来说是显而易见的。例如可用被遗传工程赋予了另外的所需特性的细菌实施本发明。对于本技术领域的专业人员来说根据说明书的描述和文中公开的本发明的实施例，本发明其它的实施方案将是显而易见的。这样，本发明还包括其改进和变更，只要它们落入附加的权利要求书或其等同物的范围内。
表2Sulfosate和Pseudomonas syringae pv.tabaci单独使用和组合使用的效果植物伤害程度百分数1处理 DAT2牵牛花白麻苍耳属植物反枝苋第1 第2 第1 第2 第1 第2第1 第2水3－4 0.0 5.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.090.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.017 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0Sulfosatae30.0 22.5 22.5 32.5 40.0 47.5 20.0 7.53-4 0.0 30.0 5.0 25.0 0.0 40.0 0.0 45.09 0.0 27.5 0.0 0.0 0.0 52.5 0.0 20.017 0.0 27.5 0.0 0.0 0.0 52.5 0.0 20.0A.器皿培养细菌43－4 20.0 20.0 12.5 0.0 30.0 0.0 45.0 45.0925.0 30.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 25.01712.5 17.5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 55.0Sulfosate33-4 40.0 30.0 42.5 30.0 52.5 27.5 87.5 60.0加上红菌49 70.0 47.5 45.0 22.5 47.5 30.0 100.0 60.017 60.0 27.5 40.0 20.0 40.0 35.0 100.0 97.5B.液体培养细菌43-4 20.0 5.0 22.5 0.0 25.0 0.0 17.5 0.09 25.0 20.0 0.0 0.0 27.5 0.0 0.0 12.51732.5 12.5 0.0 0.0 37.3 37.5 0.0 40.0Sulfosate33-4 40.0 25.0 50.0 37.5 62.3 27.5 75.0 55.0加上红菌49 60.0 27.5 45.0 30.0 55.0 25.0 97.5 67.517 40.0 40.0 40.0 62.5 50.0 42.5 100.0 57.51、根据试验中描述的方法测定植物伤害程度百分数。
0%＝无效，100%＝植物死亡2、DAT＝处理后天数3、Sulfosate施用量为0.06 1b/A＝1/8田间适宜用量。
4、Pseudomonas syringae pv.tabaci施用量为108CFU/ml.悬浮于King′s B介质中。
表2(续)Sulfosate和Pseudomonas syringae pv.tabaci单独使用和组合使用的效果植物伤害程度百分数1
1、根据试验中描述的方法测定植物伤害程度百分数。
0%＝无效，100%＝植物死亡2、DAT＝处理后天数3、Sulfosate施用量为0.06 1b/A＝1/8田间适宜用量。
4、Pseudomonas syringae pv.tabaci施用量为108CFU/ml，悬浮于King′s B介质中。
权利要求
1.一种控制杂草，抑制其生长或将其杀死的方法，包括用能促进细菌感染所述杂草的化学试剂接触所述杂草，和用所述化学试剂接触后，用能感染所述杂草的细菌植物病原菌接触所述杂草，其中，所述化学试剂的施用量足以促进所述细菌植物病原菌对所述杂草的感染，和其中，所述细菌植物病原菌的施用量足以感染所述的用所述化学试剂处理过的杂草，和其中，对杂草生长的抑制或杀死所述杂草的效果大于单独使用同量的所述化学试剂或细菌植物病原菌。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的化学试剂和所述的细菌植物病原菌同时施用于所述杂草。
3.根据权利要求1的方法，其中所述的化学试剂先于所述的细菌植物病原菌施用于所述杂草。
4.根据权利要求1的方法，其中所述的化学试剂是一种除草剂。
5.根据权利要求1的方法，其中所述的细菌植物病原菌在能维持或促进所述细菌生长的介质中施用于杂草。
6.根据权利要求1的方法，其中所述的细菌植物病原菌是Pseudomonas属的一种菌株。
7.根据权利要求6的方法，其中所述的细菌植物病原菌是Pseudomonas syringae种的一个pathovar。
8.根据权利要求7的方法，其中所述的细菌植物病原菌是Pseudomonas syringae pv.tabaci。
9.根据权利要求6的方法，其中所述的细菌植物病原菌是Pseudomonas solanacearum种的一个Pathovar。
10.根据权利要求1的方法，其中所述的化学试剂是麦草畏。
11.根据权利要求1的方法，其中所述的化学试剂是草甘磷。
12.根据权利要求1的方法，其中所述的化学试剂是阿特拉津。
13.根据权利要求1的方法，其中所述的化学试剂是2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。
14.根据权利要求1的方法，其中所述的化学试剂是Sulfosate。
15.根据权利要求1的方法，其中所述的细菌植物病原菌含有重组的DNA。
16.根据权利要求1的方法，其中所述的细菌植物病原菌是一种对温度敏感的细菌，在冬天温度下不能存活。
17.根据权利要求1的方法，其中所述的细菌植物病原菌是一种对温度敏感的细菌，在夏天温度下不能存活。
18.根据权利要求1的方法，其中所述的细菌植物病原菌是一种营养缺陷体，作为死物寄生菌不能存活。
19.一种用于杂草控制的组合物，包括一种能感染植物的细菌接种体和一种能使所述细菌易于感染的化学试剂的混合物。
20.根据权利要求19的组合物，其中所述的化学试剂是一种除草剂。
21.根据权利要求19的组合物，其中所述的细菌植物病原菌是Pseudomonas属的一种菌株。
22.根据权利要求21的组合物，其中所述的细菌植物病原菌是Pseudomonas syringae种的一个pathovar。
23.根据权利要求22的组合物，其中所述的细菌植物病原菌是Pseudomonas syringae pv.tabaci。
24.根据权利要求22的组合物，其中所述的细菌植物病原菌是Pseudomonas solanacearum。
25.根据权利要求19的组合物，其中所述的化学试剂是麦草畏。
26.根据权利要求19的组合物，其中所述的化学试剂是草甘磷。
27.根据权利要求19的组合物，其中所述的化学试剂是阿特拉津。
28.根据权利要求19的组合物，其中所述的化学试剂是2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。
29.根据权利要求19的组合物，其中所述的化学试剂是Sulfosate。
30.一种控制杂草，抑制其生长或将其杀死的方法，包括用能促进细菌感染所述杂草的化学试剂接触所述杂草，和用所述化学试剂接触后，用能感染所述杂草的细菌植物病原菌接触所述杂草，其中，所述化学试剂施用量足以促进所述细菌植物病原菌对所述杂草的感染，和其中，所述细菌植物病原菌施用量足以感染用所述化学试剂处理过的所述杂草，和其中，被所述细菌植物病原菌感染的寄生物种范围大于单独使用所述细菌植物病原菌所感染的寄生物范围。
31.根据权利要求30的方法，其中所述的化学试剂和所述的细菌植物病原菌同时施用于所述杂草。
32.根据权利要求30的方法，其中所述的化学试剂先于所述的细菌植物病原菌施用于所述杂草。
33.根据权利要求30的方法，其中所述的化学试剂是一种除草剂。
34.根据权利要求30的方法，其中所述的细菌植物病原菌是在能维持或促进所述细菌生长的介质中施用于杂草。
35.根据权利要求30的方法，其中所述的细菌植物病原菌是Pseudomonas属一种菌株。
36.根据权利要求35的方法，其中所述的细菌植物病原菌是Pseudomonas syringae种的一个pathovar。
37.根据权利要求36的方法，其中所述的细菌植物病原菌是Pseudomonas syringae pv.tabaci。
38.根据权利要求35的方法，其中所述的细菌植物病原菌是Pseudomonas solanacearum种的一个pathovar。
39.根据权利要求30的方法，其中所述的化学试剂是麦草畏。
40.根据权利要求30的方法，其中所述的化学试剂是草甘磷。
41.根据权利要求30的方法，其中所述的化学试剂是阿特拉津。
42.根据权利要求30的方法，其中所述的化学试剂是2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。
43.根据权利要求30的方法，其中所述的化学试剂是Sulfosate。
44.根据权利要求30的方法，其中所述的细菌植物病原菌含有重组的DNA。
45.根据权利要求30的方法，其中所述的细菌植物病原菌是一种对温度敏感的细菌，在冬天的气温下不能存活。
46.根据权利要求30的方法，其中所述的细菌植物病原菌是一种对温度敏感的细菌，在夏天的气温下不能存活。
47.根据权利要求30的方法，其中所述的细菌植物病原菌是一种营养缺陷体，作为死物寄生菌不能存活。
全文摘要
本发明提供了一种控制杂草的方法，其包括向杂草施用一种化学品如除草剂和一种细菌植物病原菌。化学品的作用是促使植物病原细菌对杂草的随机感染。这就可能实现用低于单独使用除草剂时所需要的除草剂量控制大范围的杂草种类。受控制的杂草种类范围大于单独使用除草剂的控制范围。
文档编号A01N63/02GK1050666SQ9010837
公开日1991年4月17日 申请日期1990年9月10日 优先权日1989年9月11日
发明者彼得·S·卡尔逊 申请人:谷物遗传学国际公司