专利名称：一种抗生素新农药——宁南霉素的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵工程技术。
宁南霉素属碱性水溶性胞嘧啶核苷类抗生素，主要用于防治水稻白叶枯病，也可用于防治水稻小球菌核病、小麦白粉病、蔬菜白粉病、烟草花叶病毒病等。目前国内外用于防治水稻白叶枯病的主要药物是化学农药，以叶枯宁、叶枯净为代表。
五十年代以来，由于化学农药的使用带来环境污染，造成公害，因此，无公害农药-农用抗生素的研制在国际上受到极大重视，日本是农用抗生素研究最有成就的国家之一，为防治稻瘟病、稻纹枯病，先后投产了“灭瘟素s”、“多氧霉素”、“春日霉素”、“有效霉素”、“灰黄霉素”、“放线菌酮”等，但对水稻白叶枯病等未见大田试验报导，印度、中国和西方一些国家，也开展了同类研究，报导了Herbicidin，Azomultin，Crtromycin，Xanthostiu，Nogimycin，Prumycin等十多种对水稻白叶枯病原菌有较强生理活性的抗生素，但由于药害和其它一些原因，也未见防治水稻白叶枯病的大田应用报导。
为了控制病害，提高粮食产量，净化环境，保证人畜健康，寻找高效、低毒、低残留，无“三致”和蓄积作用的无公害广谱抗生素农药，是本发明的主要目的。
本发明的技术解决方案是筛选对水稻白叶枯病原菌有高生理活性的抗生素产生菌种→对产生菌进行分类鉴定→进行发酵条件试验→对产生的抗生素进行分离和结构鉴定→生产工艺→毒理试验→大田试验。
本发明的主要内容1.产生菌的鉴定宁南霉素产生菌16A-6菌株，根据形态特征，生理生化特性，碳源利用，细胞壁组份分析和拮抗性等试验结果形态特征在高氏一号培养基上，孢子丝为松敞螺旋，电镜下，孢子呈椭圆形0.9×1.3μm，圆形直径1.2μm，孢子表面带细刺;培养特征在高氏琼脂培养基上生长丰茂，短绒状，气生菌丝体由深蛛网灰转淡红灰，有白色次生菌丝，基内菌丝体淡灰黄，无可溶性色素;生理生化特性在酪氨酸琼脂上不产生黑色素，淀粉水解，明胶液化，牛奶胨化，硝酸盐还原，不产生硫化氢，纤维素上不生长碳源利用，可利用D-葡萄糖，D-果糖、蔗糖、甘露醇、肌醇，不利用鼠李糖，棉子糖，对D-木糖、L-阿拉伯糖利用可疑;细胞壁组分为I型;拮抗性菌株培养液对革兰氏阴性细菌，少数革兰氏阳性细菌，酵母菌，水稻纹枯病原菌，稻瘟病原菌，油橄榄疮痂病原菌有抑制作用，对水稻白叶枯病原菌和小球菌核病原菌抑制作用强。
根据以上结果，将此菌株与诺尔斯链霉菌比较，认为链霉菌16A-6菌株是诺尔斯链霉菌的一个新变种，定名为诺尔斯链霉菌西昌变种(Streptomycesnourseivar.xichangansisn.var)。
2.抗生素宁南霉素(16A-6I)的分离和鉴定发酵液过滤后，滤液通过732＃NH+4型阳离子交换树脂后，用无盐水洗去上层蛋白质沉淀，再用0.3N氨水洗脱，收集磷钨酸反应阳性部分，减压浓缩至小体积，浓缩液通过D-110大网树脂，吸附层析，用无盐水展层，收集磷钨酸反应部分，冻干得白色粗品，粗品经中性氧化铝柱层析，先用10倍体积75%甲醇水溶液洗，再用25%甲醇水溶液洗，收集磷钨酸反应阳性部分，减压浓缩，冻干得白色无定形粉末，最后再经高效液相色谱进一步纯化，得宁南霉素(16A-6I)色谱纯样品。
将宁南霉素(16A-6I)白色无定形粉末，进行理化性质检测，熔点195℃分解，旋光度[a]25D+38°，分子量444[质谱法]，分子式C16H25N7O3，易溶于水，难溶于醇、酮、醋酸乙脂、氯仿等一般有机溶剂，在pH2-8磷酸缓冲液中进行纸上电泳，移向负极，显碱性。显色反应茚三酮、双缩脲、高锰酸钾、磷钨酸呈阳性、坂口、三氯化铁、蒽酮、α-萘酚呈阴性。
对16A-6I进行紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱及水解产物等化学分析，确定宁南霉素16A-6I为谷氏菌素同分异构体，差别在于组成结构成分中，前者为L丝氨酸，后者为D丝氨酸，抗菌生理活性有明显差异，综上分析，农抗16A-6I为首次发现的胞嘧啶核苷肽型新抗生素，定名为宁南霉素，其结构式为
3.宁南霉素的生产工艺流程斜面菌种→一级种子→二级种子→发酵罐→发酵液→板框过滤→薄膜浓缩(2-3倍)→浓缩液加0.1-0.3苯甲酸钠→装瓶(10000单位/毫升以上)→成品。
本发明的优点1.低毒、低残留、无“三致”①急性毒性试验宁南霉素发酵液冷冻干燥品对小鼠腹腔注射LD50＝103.6mg/kg;口服LD50＝6485mg/kg;经皮LD50＞10000mg/kg，大鼠腹腔注射LD50＝126.1mg/kg;口服LD50＝5492mg/kg。
②鱼类半数耐受浓度试验宁南霉素发酵液冷冻干燥品对鲫鱼半数耐受浓度为3323mg/L。
③亚急性毒性试验低剂量组(100mg/kg，相当于田间用药量的50倍)及中剂量组(400mg/kg相当于田间用药量的200倍)与对照组比较，在体重、摄食、活动等基本一致，高剂量组中途死亡是因在药损基础上伴有感染，存活大鼠的血象、生化指标检查结果与对照组比较无明显差异，据追加剂量法以1/13LD50(中剂量组)测算蓄积指数K＞12.8，认为该药基本无蓄积作用。
④致突变试验宁南霉素对小鼠胸骨髓微核诱变试验和小鼠睾丸细胞染色体畸变分析均无诱变作用。
⑤采用高压液相色谱仪和数据处理机等仪器，检测标样为宁南霉素色谱纯;考查方法回收率在98%左右，对各类农作物样品残留分析，豆荚为0.0160ppm，稻叶为0.0952ppm，水稻土为0.0003ppm，豇豆土为0.0034ppm，黄瓜土、稻田水未检出，谷草0.1133ppm，糠0.1113ppm，米0.0350ppm，小麦0.0002ppm，属低残留。
2.防效好，增产显著。据5省6县3884亩大田试验证明，宁南霉素对水稻白叶枯病与叶枯宁、叶枯净、敌枯双等比较，宁南霉素相对防效一般为70%，高的可达90%以上，平均85.41%，增产效果一般为10～20%，最高达35%，而叶枯宁、叶枯净、敌枯双平均防效为62.14%～75.63%，增产效果为10%左右。
3.原料易得、价廉、发酵效价稳定，适合大规模工业化生产，生产设备可与其他抗生素生产设备通用。
4.对光、热、酸比较稳定，浓缩液在常温下保存2年不失效，对人、畜无毒害，对作物无药害，无特殊臭味，不刺激皮肤，耐雨水冲刷，在病虫害同时发生的田里，可与乐果，溴氰菊脂混用，不但可以达到防治明显效果，而且省劳力，省时间，从而降低了用药成本。
实施例11989年，在成都某厂进行1吨试验罐和6吨生产罐共20批的生产考察，证明该菌株产生效价稳定在5000单位/毫升，产品宁南霉素在常温下贮存两年不失效。用此抗生素在四川某县被水淹过并普遍发生白叶枯病的3580亩稻田示范试验，喷药的虽遇雨，仍未减药效，防治效果平均为86.48%，而对比的叶枯宁防效则为77.14%，叶枯净为66.85%，增产效果宁南霉素为11.77%，叶枯宁为9.09%，叶柘净为5.35%。
实施例2将宁南霉素与粉锈宁、硫磺胶悬剂在某二县对小麦白粉病进行对比防治试验结果，宁南霉素防效为80.19%，增产效果为27.73%，而粉锈宁的防治效果在同样条件下则为66.34%，增产效果为26.05%，硫磺胶悬剂的防治效果为67.54%，增产效果为16.81%。
实施例3将宁南霉素(浓度50ppm/ml)与浓度15%的粉锈宁4000倍，和浓度70%甲基托布津1000倍进行防治黄瓜、豇豆等蔬菜白粉病试验，结果，宁南霉素防效黄瓜为85.7%，豇豆为92.8%，增产效果黄瓜为37.3%;粉锈宁对黄瓜防效为81.0%，对豇豆为90.3%，增产效果为36.6%;甲基托布津，对黄瓜防效为64.3%，豇豆为78.9%，增产效果为9.2%。
实施例41990-1991连续两年在某地用宁南霉素对烟草花叶病进行防治试验，设83增抗剂为对比药剂，清水为对照，用常量喷雾，亩用药量(规格1%)750毫升，83增抗剂750毫升，兑水75公斤喷雾，施药共三次，结果表明，宁南霉素绝对防效为87.38%，增产效果为23.2%;83增抗剂的防效仅为22.47%，宁南霉素明显优于83增抗剂。
权利要求
1.用微生物发酵技术生产的抗生素农药，其特征是，其产生菌16A-6菌株是诺尔斯链霉菌的一个新变种，定名为诺尔斯链霉菌西昌变种(Streptomycesnourseivar·xichangensisn·var)。该菌所产生的抗生素，定名为宁南霉素，其分子量为444[质谱法]，分子式为C16H25N7O8，结构式为
2.根据权利要求1所述的抗生素农药-宁南霉素，其特征是水解产物为胞嘧啶核苷肽型抗生素，其丝氨酸为L-丝氨酸。
3.根据权利要求2所述的农用抗生素-宁南霉素，其特征是，其熔点为195℃，旋光度为[a]25D+38°。
全文摘要
链霉菌16A-6菌株是诺尔斯链霉菌的一个新变种，定名为诺尔斯链霉菌西昌变种，其产生的抗生素16A-6I为首次发现的胞嘧啶核苷肽型新抗生素，定名为宁南霉素。该抗生素是一种低毒、低残留、无“三致”和蓄积问题，不污染环境的新农药，对水稻白叶枯病相对防效为70％左右，高的可达90％，增产效果为10～20％，高的可达35％，另外它对小麦、蔬菜、花卉等白粉病的防病、增产效果都很显著，对水稻小球菌核病、油橄榄孔雀斑病、疮痂病及烟草花叶病防效也很好。
文档编号A01N63/00GK1093869SQ9310428
公开日1994年10月26日 申请日期1993年4月23日 优先权日1993年4月23日
发明者胡厚芝, 向固西, 陈家任, 陈维新, 吴林森, 徐生林 申请人:中国科学院成都生物研究所, 国家医药管理局四川抗菌素工业研究所