控制昆虫的方法

专利名称：控制昆虫的方法
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本发明涉及通过提供可直接用于植物的蛋白质或由微生物在其上产生的蛋白质，或者通过用遗传工程方法修饰植物以产生所述蛋白质来控制植物昆虫感染的方法，本发明还涉及在所述方法中有用的微生物和植物。本发明背景使用包括蛋白质在内的天然产物是熟知的控制许多昆虫害虫的方法。例如，用苏云金芽孢杆菌(B.t.)内毒素控制鳞翅目和鞘翅目昆虫害虫。生产这些内毒素的基因已被导入并已由各种植物，包括棉花、烟草、番茄表达。然而，还存在一些对B.t.内毒素不敏感的经济上重要的昆虫害虫。这些重要害虫的例子有棉象虫(BWV)、Anthonomus grandis和南瓜十二星叶甲(CRW)(条叶甲属)。另外，其他用于控制对B.t.内毒素敏感的昆虫的不同基因产物，如果不是致死的，则对于抗性处理也是重要的。
在植物中发现了其他几种已知的杀虫蛋白质，包括植物凝血素、淀粉酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。在以高剂量使用时，它们会影响昆虫的生长和发育[Boulter et al.，1989；Broadway and Duffey，1986；Czapla and Lang，1990Gatehouse et al.，1986；Heusing et al.，1991；Ishimoto and K.Kitamura，1989；Nurdock et al.，1990；Shukle and Murdock，1983]，但不会提供由B.t.蛋白质所给予的急性致死性。
本发明的一个目的是提供能控制BWV、CRW或其他昆虫害虫的蛋白质和生产所述蛋白质所用的基因。本发明的另一目的是提供遗传构建体和将所述遗传物质插入微生物和植物细胞的方法。本发明的另一目的是提供含所述遗传物质的转化微生物和植物。本发明概述已经发现马铃薯贮存蛋白(patatin)(马铃薯块茎的主要贮存蛋白质)可以控制各种昆虫，包括玉米幼芽根叶蛼(WCRW)、Diabrotica virgifera、southern corn rootworm(SCRW)、Diabrotica undecimpunctata和棉象虫(BWV)、Anthonomusgrandis。马铃薯贮存蛋白对于一些幼虫是致死的，并会阻碍幸存者的生长以致防止或严重延缓了幼虫的成熟，从而使其无法繁殖。可以将这些已知具有酯酶(脂酰基水解酶)活性的蛋白质直接用于植物或用其他方式转导，例如通过使用已转化的生产所述酶的植物-定殖微生物，或者用相似转化后的植物本身。
马铃薯贮存蛋白是在马铃薯[Gaillaird，1971；Racusen1984；Andrews et al.，1988]和其他植物，尤其是茄形(solanaceous)植物[Ganal et al.，1991；Vancanneyt et al.，1989]中发现的蛋白质家族。在马铃薯中，马铃薯贮存蛋白主要是在块茎中发现的，在其他植物器官中的水平很低[Hofgen and Willmitzer，1990]。已检测了几种马铃薯贮存蛋白同工酶的酯酶底物特异性[Hofgen andWillmitzer，1990；Racusen，1986]。
以前已由Mignery等人(1984)、Mignery等人(1988)、Stiekema等人(1988)和其他人分离了编码马铃薯贮存蛋白的基因。Rosahl等人(1987)将其转移到烟草植物中，并观察了马铃薯贮存蛋白的表达。这表明可以由植物异源表达马铃薯贮存蛋白。
相似地，可以分离马铃薯贮存蛋白基因，然后将其插入适当的转化载体盒中，然后(1)用所述盒转化植物一定殖微生物，当用于植物时，所述微生物表达生产马铃薯贮存蛋白的基因，由此控制昆虫，或者(2)将所述盒掺入植物基因组中，然后通过表达基因并生产马铃薯贮存蛋白可保护其自身免受昆虫的攻击。另外，可以转化或培育植物以共表达一种或多种编码控制昆虫的蛋白质的B.t.基因。这就使植物要么(1)抵御较多种类的害虫和/或要么(2)对一些害虫有两种作用模式，这是抗性处理中的一种重要手段。转化后表达B.t.基因的植物实例公开在欧洲专利公开No.0，385，962中，相当于美国系列申请号476,661,1990，2，1 2申请[Fischhoff等人](该文献掺入本文作为参考)。另外，由于已经表明蛋白酶抑制剂提高其他杀虫蛋白的活性，所以可以转化或者培育植物以便共表达蛋白酶抑制剂基因，如编码马铃薯木瓜蛋白酶抑制剂[Rodis and Hoff，1984]或大豆胰蛋白酶抑制剂[参见Ryan的有关综述，1990]的那些基因。
结合上文内容，根据本发明的目的之一，提供控制植物昆虫感染的方法，包括提供有效量的杀虫马铃薯贮存蛋白供昆虫摄食。通过提供植物-定殖微生物可完成该方法，所述微生物已被转化来表达马铃薯贮存蛋白基因，然后导入植物，表达所述基因，并提供杀虫有效量的马铃薯贮存蛋白。也可以用DNA分子经遗传工程方法转化待保护植物来实现该方法，所述DNA分子含有(i)在植物细胞中起作用的启动子，以引起RNA序列的产生；(ii)编码马铃薯贮存蛋白的结构编码序列；(iii)在所述植物细胞中起作用的3’非转译区，以促使多腺苷酸核苷酸加到RNA序列的3’末端。其中所述启动子对于所述结构编码序列而言是异源的，而且其中所述启动子与所述结构编码序列经操作相连，所述结构编码序列依次与所述非转译区可操作相连。优选地是植物将以约0.1-0.5％的总蛋白质水平表达马铃薯贮存蛋白。
本发明还提供用遗传工程方法转化的昆虫抗性玉米、棉花、番茄和马铃薯植物。
本文所用的术语“控制昆虫感染”指或者通过致死性、延缓幼虫的发育(发育障碍)，或者降低繁殖效率来减少引起有益产率降低的昆虫数量。本文所用的术语“杀虫的”指或者通过致死性，延缓幼虫的发育(发育障碍)，或者降低繁殖效率来减少导致有益产率降低的昆虫数量。
本文所用的术语“结构编码序列”指编码多肽的DNA序列，所述多肽由细胞在将DNA转录成mRNA，然后转译成所需的多肽而得到。
本文所用的术语“马铃薯贮存蛋白”指一种植物蛋白质，与SEQID NO31)(下文所示)编码的蛋白质有75％或更高同源性，或者更优选的是至少80％同源性，或甚至更优选的是至少85％的同源性。该术语包括由经设计用于提高单子叶植物中的表达而合成的DNA序列产生的蛋白质。本发明的详细描述马铃薯贮存蛋白是在马铃薯[Gaillaird，1971；Racusen，1984；Andrews et al.，1988]和其它植物，特别是茄形植物[Ganal etal.，1991；Vancanneyt et al.，1989]中发现的酯酶家族。在马铃薯中，主要在块茎中发现了马铃薯贮存蛋白，但它也以很低的水平存在于其它的植物器官中[Hofgen and Willmitzer，1990]。已经检测了几种马铃薯贮存蛋白同工酶的酯酶底物特异性[Hofgen andWillmitzer，1990；Racusen，1986]，发现有广泛的底物特异性，表明这些酶对底物有限制。使用所有植物衍生的马铃薯贮存蛋白和其等同物(两者均在本文详细公开)和同源蛋白质，无论是得自天然DNA序列还是合成DNA序列，只要是为了控制植物昆虫感染的目的均在本发明范围内。
来自马铃薯的粗马铃薯贮存蛋白制品可从市场上购买。例如，Sigma Chemical Company，St，Louis，MO提供由Sigma标为酸性磷酸酶(P-1146和P-3752)或腺苷三磷酸双磷酸酶(A-9149)的马铃薯蛋白质制品。也需要马铃薯块茎并可用文献中描述的方法(Racusen and Foote，1980；Park et al.，1983)制备蛋白质提取物。生物效能检测人工食物的生物检测在与Marrone等人1985描述的用于SCRW的相似琼脂食物上，通过覆盖检测样品完成抗SCRW、BWV、马铃薯甲虫(CPB)和欧洲玉米螟(ECB)幼虫的活性检测。将蛋白质溶解在4-5ml 10mM HEPES，pH7.5中，然后使用3500分子量的截止试管在这种相同的缓冲液中透析来制备试验样品。在26℃用处理过的食物喂养新生幼虫，然后在5或6天评估死亡率和生长障碍。表1列出了P-3752(Sigma)的检测结果。表明这种粗马铃薯制剂有广谱杀虫活性。
表1速率 死亡率/发育障碍％* SCRWBWV CPBECB0.01X 0 11 0 00.03X 0*20*0 130.10X 19**20**6 0*0.30X 6*****46**13*6*1.00X 6***73**13**6**a*＝轻微发育障碍(大小降低约30-40％)**＝中度发育障碍(大小降低约50-80％)***＝严重发育障碍(大小降低＞90％)对接触5天后的SCRW(表2)和接触6天后的ECB(表3)进行精确定量的重量测量，结果列于下文。在摄入含P-3752的食物时，发育中的SCRW幼虫与对照相比体重减少92％，ECB幼虫与对照相比体重减少62％。
表2处理平均存活重量(修正值)重量减轻％死亡率％ Tris 4.00mg(0.60)a--对照水平--P-37520.30mg(0.03)a92 6a平均存活重量在95％显著不同(一个因子的ANOVA)。
表3处理平均存活重量(修正值)重量减轻％死亡率％ Tris 5.39mg(0.49)a--对照水平--P-37522.05mg(0.27)a62 7a平均存活重置在95％显著不同(一个因子的ANOVA)。
通过热不稳定性，硫酸铵沉淀，分子大小分离和蛋白酶敏感性实验确定具有抗Southern corn rootworm(SCRW)和棉象虫(BWV)活性的P-3752杀虫组分的蛋白质性质。
为了证实P-3752的作用归因于摄取马铃薯贮存蛋白的直接效果而不是抗喂养反应引起的间接效果，用ECB和SCRW完成食物选择研究。这项选择研究的结果表明对以P-3752和Tris处理的食物为食没有明显的偏好。就Tris处理的食物而言，似乎无法废除P-3752处理的食物。
-项P-3752抗SCRW的长期(25天)试验利用了第2龄幼虫，并将几个存活昆虫转移到新鲜处理的食物上。这项研究结束时，所有对照幼虫均已化蛹。相反，50％的处理幼虫死亡而另外的50％其体重仅比开始时的增加16％(2.48mg对2.14mg)。这表明抑制了幼虫发育，而不仅仅是延缓。由于幼虫无法发育到成虫，从昆虫控制的角度看，这具有重要的结果。因此后代SCRW的数量将会减少。
仅在实验室实验中使用了第2龄幼虫阶段的玉米幼芽根叶蛼(WCRW)幼虫。为了检测P-3752抗WCRW的作用，用第2龄SCRW幼虫设计了平行试验。P-3752的处理分别导致SCRW和WCRW第2龄幼虫仅增加13％和11％的重量。在7天内，对照SCRW增重474％和WCRW增加200％。这表明马铃薯贮存蛋白的抗WCRW活性大致等于其抗SCRW的活性。
P-3752对烟青虫(TBW)、烟芽夜蛾、甜菜夜蛾(BAW)、玉米穗蛾、棉红铃虫和烟草天蛾有较低的活性，在相同的浓度其发育障碍率为1-1.5，而对SCRW的发育障碍速率为3。P-3752对小地老虎的发育障碍速率为2.5(在上文表1中定义了发育障碍速率)。在所试验的浓度，对桃蚜没有活性。植物组织生物检测(1)马铃薯将1g粗P-3752溶于4ml 25mM Tris，pH7.5缓冲液中，然后通过0.2μm膜透析并过滤。加入TritonX-100以得到0.1％的溶液。将马铃薯叶浸在酶制剂中，放在培养皿中沾湿的滤纸上。放入CPB幼虫，于27℃将平板培养3天。P-3752处理的马铃薯叶导致CPB幼虫发育障碍并进食减少。试验结果是，与P-3752处理的叶相比，作为对照叶的叶组织明显减少。(2)玉米和棉花从琼脂板中取出黑墨西哥甜玉米愈伤组织(BMS)或棉花愈伤组织，然后转移到50ml离心试管中。使愈伤组织成漩涡并用IEC Clinical离心机以8档离心5分钟。缓缓倒出上清液，将30ml2％的液体琼脂加到含15ml愈伤组织的50ml试管中。完全混合后，将食物移到-检测arena中进行昆虫生物检测。将透析过的P-3752作为-种食物覆盖物加入(以20％体积)，然后如上所述完成检测。
用粗P-3752或25mM Tris，pH7.5缓冲液真空浸润[Inflt]切开的玉米根和茎，将对照样品全部组织浸没在Iris缓冲液中。将约10-15片根或3片茎组织放在24孔组织培养平板的孔中，重复4次。每孔加入4个新生SCRW幼虫。将试验物在26℃培养4天，在此时对死亡率和平均幼虫重量进行观察，结果列于表4。
表4组织 昆虫 死亡率％ 重量减少％ 真空浸润的玉米根 SCRW90 44真空浸润的玉米茎 SCRW51 52处理的BMS愈伤组织SCRW24 51处理的BMS愈伤组织WCRW023处理的BMS愈伤组织ECB 033处理的棉花愈伤组织 BWV60 没有数据因此，当P-3752与植物组织被共同摄取时，保持了对所有四种昆虫(SCRW、BWV、CPB和ECB)的杀虫活性。这些食物研究表明，当用其营养仅由植物组织(根、茎、愈伤组织或叶)组成的食物检测时，马铃薯贮存蛋白是有杀虫活性的。作用模式研究下面的研究表明马铃薯贮存蛋白(P-3752的杀虫活性组分)对昆虫本身有直接作用，而且在上述实验中表明的活性不可能是活性组分对摄取前昆虫食物的作用。食用效果研究将1gP-3752溶于10ml 25mM Tris pH7.6的缓冲液中，然后在MWCO 12-14,000试管中对同样的缓冲液透析。0.2μm过滤后，在加入昆虫前4天，将50μl等份试样加到两个平板上的昆虫食物中。两个平板均在27℃培养4天。培养后，将-个平板加热到80℃，经1小时使酶失活。将50μl等份试样加到第三个平板上。因此，用培养过的、培养＋加热的和未培养过的平板进行SCRW生物检测。
在食物预培养研究中，SCRW活性如下未培养过的P-3752——6***培养过的P-3752——0**培养过、加热过的P-3752——0*在食品培养期间，损失了一部分活性，而加热处理造成活性的完全损失。这样的数据与直接的摄取后作用模式-致，并且当与植物组织检测-起考虑时，对不同昆虫的可变性表明蛋白质对SCRW和其它昆虫的活性不是饮食的作用。蛋白质鉴定已经纯化、部分定序并描述了来自P-3752的杀虫活性组分的特征。已鉴定出该活性剂为马铃薯贮存蛋白，来自马铃薯的脂酰基水解酶家族。蛋白质分离用四种方法纯化P-3752的SCRW生物活性组分。
用阴离子交换层析纯化SCRW活性-先用Q-Sepharose(Pharmacia)阴离子交换层析，接着经MONO-Q(HR5/5，Pharmacia)阴离子交换层析纯化P-3752的SCRW-活性组分。在SCRW活性部分中的蛋白质水平表明用蛋白质浓度为31PPm的食物可达到观察到的**生长障碍。SDS-PAGE表明在活性部分中存在三种主要的蛋白质带(Mr42,000、～26,000和～16,000)。
SCRW活性的5步纯化-用5个连续的纯化步骤从P-3752中纯化SCRW活性组分。有膜大小分离、硫酸铵沉淀、Q-Sepharose IEC、S-Sepharose IEC和P-200IEC。最纯的SCRW活性部分的SDS-PAGE表明蛋白质带在Mr42,000、～26,000和～16,000 。
经等电聚焦纯化生物活性-按制造商的说明，在RF3蛋白质分离器(Rainin)上连续跑2次，纯化SCRW生物活性马铃薯蛋白质。 SCRW活性部分的SDS-PAGE图与从5步纯化和阴离子交换纯化的活性部分中观察到的图相似。IEF凝胶表明，蛋白质从pH4.6到5.1分离，与报道的马铃薯贮存蛋白的pH范围(Racusen和Foote，1980)一致。
通过在RF3上在一窄pH范围(pH4-5)连续等电聚焦以分离马铃薯贮存蛋白同工酶。按预期的，在蛋白质的pH4.6-5.1时，看到一生物活性峰。这些部分有不同的同工酶模式和不同水平的生物活性。在这些部分中生物活性的范围从80ppm剂量的0死亡率，*-**发育障碍到512ppm。有些生物活性部分仅有2种主要的同工酶，表明对于生物活性并不需要复杂模式的同工酶。
用天然PAGE纯化-在自然条件下电泳P-3752，分离出酯酶活性的(用α-乙酸萘酯为底物)三联带。凝胶纯化的酯酶阳性物质有抗SCRW活性，产生1.5*发育障碍。该物质的SDS-PAGE揭示出主带在Mr42,000、～26,000和～16,000，与以前用其它纯化方法观察到的图相同。这进一步证实马铃薯贮存蛋白是来自马铃薯的杀虫组分。氨基酸序列在阴离子交换纯化和5步纯化方法的SCRW活性层析部分中，得到了所有蛋白质带(Mr42,000、～26,000和～16,000)的NH2-末端氨基酸序列。总之，得到了活性部分中所有带的序列资料。大部分带与15-氨基酸序列在NH2-末端(SEQ ID NO1)或一种马铃薯贮存蛋白同工酶的内部序列(SEQ ID NO7)。(Stiekemaet al.，1988)有＞85％的同源性。一个17KD带与报告过的马铃薯贮存蛋白NH2-末端序列的开始8个氨基酸有75％的同源性。另-17KD带与公开过的马铃薯贮存蛋白NH2-末端序列的开始8个氨基酸有＞85％的同源性。这些带表示马铃薯贮存蛋白的蛋白质水解产物。NH2-末端和内部序列两者位置1和3上氨基酸的可变性清楚地表明了同工酶的存在。
N-末端氨基酸序列 公开过的序列KLEEMVTVLSIDGGG(SEQ ID NO1)带1(42kD)XLGEMVTVLSIDGGG(SEQ ID NO2)带2(28kD)TLGEMVTVLSIDGGG(SEQ ID NO3)带3(26kD)TLGEMVTVLSIDGGG(SEQ ID NO4)带4(24kD)KLXEMVTVLSIDGGG(SEQ ID NO5)带5a(17kD)XXEEMVTV (SEQ ID NO6)内部序列(氨基酸位置224) 公开过的序列SLDYKQMLLLSLGTG(SEQ ID NO7)带5b(17kD)KLDVKQML (SEQ ID NO8)带6(16kD)SLXYKQMLLLSLGTG(SEQ ID NO9)带7(15kD)SLNYKQMLLLSLGTG(SEQ ID NO10)酯酶活性进行几个实验以检测SCRW活性部分中的酯酶活性。
α-乙酸萘酯底物如果SCRW活性部分(来自5步纯化法)表现出酯酶活性，就用SDS-PAGE(10-20％)来确定。在凝胶的两半上，负裁加热的和未加热的SCRW活性部分。在未加热的样品中观察到一个酯酶阳性带，Mr为55,000。加热的样品有原来的Mr42,000带，但没有55,000带。这个结果与马铃薯贮存蛋白酯酶活性的电泳迁移性的文献报告一致[Racusen，1984]。在加热的样品中未观察到Mr55,000带，表明在SDS中加热处理降低了酯酶活性。在加热样品没有Mr55,000带的情况下，用考斯马染色观察到原来看到的Mr42,000带。
对-硝基苯基底物特异性研究-检测一系列的对-硝基苯酯(C-2、C-4、C-6、C-8、C-10、C-12、C-14和C-16)以确定底物特异性。与其它酯相比，对-硝基C-8和C-10酯对于大多数被测马铃薯贮存蛋白的酯酶活性来说，始终是最佳底物。
脂酯底物-检测SCRW活性纯化部分(来自5步纯化方法)水解几种脂的能力。将每种脂溶解，然后与一份SCRW活性纯化部分一起培养。通过使用三种溶剂显色系统的TLC(Pernes et al.，1980)分析样品。四种脂表现出由TLC作的修饰痕迹。这些包括油酰基溶血卵磷脂、二油酰L-α-卵磷脂、1-单亚麻酰-外消旋-甘油和二油精(Sigma)。与亚油和油脂肪酸标准比较，在这些脂/活性部分反应混合物的有机提取物中，鉴定出在Rf0.37的新TLC点为游离脂肪酸。因此，SCRW活性物质对这四种脂酯有酯酶活性。
从用玉米根喂养的第3龄幼虫中取出WCRW的中肠。提取中肠脂，溶解，然后在中肠pH(pH6.55)与SCRW活性纯化部分一起培养。通过使用上述方法的TLC来分析样品。表明纯化的SCRW活性部分在中肠pH时，对WCRW中肠磷脂有酯酶活性。这说明了有关马铃薯贮存蛋白杀虫活性的可能的作用模式。马铃薯贮存蛋白的其它来源由于全部初步实验均是用P-3752(一种市售的来自MinnesotaRusset var.Kranz马铃薯块茎的酶制剂(Sigma)，因此，有必要说明从新鲜的马铃薯块茎也能再找到有杀虫活性的马铃薯贮存蛋白，基本按文献(Racusen and Foote，1980；Park et al.，1983)中的描述制备块茎提取物。分析3种市售马铃薯栽培品种(Russet，Desiree和LaChipper)和7种野生品种(S.kurtzianum，S.berthaultii，S.tarijense，S.acaule，S.demissum，S.cardiophyllum和S.raphanifolium全部得自Inter-RegionalPotato Introduction Station，USDA，ARS，Sturgeon Bay，WI)。通过SDS-PAGE和Western印迹分析，所有提取物均是马铃薯贮存蛋白阳性；由C-10酯酶检测，所有的均是酯酶阳性；而且所有的均对SCRW有杀虫活性，即发育障碍率为2-3，见表5。这说明可以从数种块茎中分离有杀虫活性的马铃薯贮存蛋白，预期这一整组蛋白质的许多成员都有杀虫特性。
表5品种[Prot] ΔO.D./min·mLSCRWa(mg/mL) 1X 0.1XS.acaule 26.682,500 2 1S.berthaultii23.129 3 1S.cardiophyllum 14.6 89 2.51.5S.demissum 35.3 375,0003 1.5S.kurtzianum25.0 2,700 2.51S.raphanifolium 33.7 3,725 3 2S.tarijense 27.2 1008 2.51
a以幼虫发育障碍表示SCRW活性1＝轻微发育障碍(大小减小30-40％)，2＝中度发育障碍(大小减小50-80％)，3＝严重发育障碍(大小减小＞90％)。
生物检测S.berthaultii，S.kurtzianum和S.tarijense提取物抗另外两种靶昆虫CPB和ECB的活性。在表6中总结了生物检测数据。注意到这些提取物对CPB几乎没有活性，而在1X速率，造成ECB幼虫中度至严重的发育障碍。然而，由在0.1X对ECB完全没有活性表明，ECB幼虫对这些提取物的敏感性略低于SCRW幼虫。
表6品种 CPBa ECBa1X0.1X 1X0.1XS.berthaultii 0 0 3 0S.kurtzianum 1 0 2.5 0Starijense0 0 3 0a幼虫发育障碍用Southern分析检测9种不同植物基因组DNA与马铃薯贮存蛋白的蛋白质同源性。用α-32p标记的SEQ ID NO11探针检测的Southern印迹表明在几种其它植物品种内有同源序列。在玉米、番茄、甜菜、大米和马铃薯中得到强烈信号。在该实验中不能分辨单条带但在所有这些种中，涂片大小和其强度相似。在夏南瓜、大豆和canola中也看到弱信号，并在各品种的DNA表现为少量不连续的带。可能由于正如在凝胶的溴化工锭染色中见到的，负载的DNA量更少，因此在本实验所用的条件下，黄瓜和拟南芥属用马铃薯贮存蛋白探针没有可检测的杂交。
本领域普通技术人员可以很容易得到这些同源蛋白质的DNA序列，并用已知方法插入植物或其它生物中。在例如由杆状病毒或E.coli异源表达后，最易检测所述蛋白质的杀虫特性。因此，可以用已知方法经常量实验得到可用于本发明方法的其它蛋白质，并于此后用来配备给植物以保护其免于昆虫感染。遗传鉴定有几个研究人员已克隆了马铃薯贮存蛋白基因。由Mignery等人公开的序列称为GM203。它有一个不完全的信号序列。Mignery等人(1988)鉴定了一个基因组克隆，称为PS20，包括GM203，并含有一完整的信号序列。用PS20的信号序列和GM203编码部分的cDNA构建SEQID NO11，下文称为PatA+。在转译终止密码子后紧接着一个NcoI限制位点和一个EcoRI位点。马铃薯栽培品种Russet Burbank从马铃薯栽培品种Russet Burbank的块茎中分离20个cDNA，并定序。推测的氨基酸序列表明这些cDNA编码11种不同的马铃薯贮存蛋白同工酶。这11种蛋白质与PatA+，SEQ ID NO11相比有约82％到100％的同一性，其不同可见于全长cDNA的许多不同位置。在表7中列出了编码11种不同马铃薯贮存蛋白同工酶的11种不同代表性的cDNA序列。通过使用引物SEQ ID NO26和SEQ ID NO27(分别相当于编码信号序列开始几个密码子的5’核苷酸和编码序列的3’末端)的PCR方法生产cDNA，以用于以后的克隆操作，“＋”号表示包含了天然信号编码序列。有些cDNA不含完整的天然信号编码序列，而只从使用引物SEQ ID NO32和SEQ ID NO27的相似PCR方法得到了成熟蛋白质编码序列。这些用下面的“m”表示。
表7同工酶序列鉴别号PatA+SEQ ID NO11PatAmSEQ ID NO14PatB+SEQ ID NO16PatC+SEQ ID NO17PatDmSEQ ID NO18PatE+SEQ ID NO19PatEmSEQ ID NO2OPatFmSEQ ID NO21PatG+SEQ ID NO22PatHmSEQ ID NO15PatImSEQ ID NO23PatL+SEQ ID NO24PatM+SEQ ID NO25Solanum berthaultii反转录块茎mRNA，然后通过使用引物SEQ ID NO26和SEQ ID NO27(上述的)的PCR，分离来自二倍体马铃薯S.berthaultii的马铃薯贮存蛋白cDNA。完成多个独立的PCR反应以避免因扩增过程引起的重复克隆的分离。
将共14种马铃薯贮存蛋白cDNA部分定序，所有14种cDNA(称Patl到Pat14)似乎有一特有的核苷酸序列，说明在S.berthaultii块茎中至少表达14种不同的马铃薯贮存蛋白mRNA。Pat3+的序列是SEQ ID NO28。Pat10+的序列是SEQ ID NO29。推测的氨基酸序列表明14种cDNA编码至少11种不同的蛋白质。总之，来自S.berthaultii块茎的cDNA序列很相似。在共367个残基中，仅12个氨基酸位置有序列可变性。表8中列出了在这些位置的每个位置上出现的氨基酸。这些位置中的5个位置上，只有一个带一特有残基的变异体克隆。这种改变可能反映了mRNA之间的实际差异，或者可能是由PCR过程中产生的错误引起的。在其它7个位置，有更大的可变性；至少两种cDNA有一个可变的氨基酸。这9种不同氨基酸序列组的每一个在这7个位置均有一独特的残基型。在有些情况下，变化是保守的，如在位置164从Thr变为Ser。在另外的情况下，有更大的差异，如在位置148导入Pro。
表8cDNA氨基酸差异的位置89 96 106 113 120 123 148 164 187 200PAT3+ GLN LEU GLN TYR GLU VAL ALA ALA THR ASP ASPPAT4+ GLN SER ASP HIS GLU VAL ALA PRO SER ASP VALPAT5+ GLN SER ASP HIS GLU VAL ALA PRO THR ASP ASPPAT7+ GLN LEU GLN TYR GLU VAL ALA ALA THR ASN ASPPAT8+ LYS SER GLY TYR LYS VAL ALA PRO THR ASP ASPPAT9+ LYS SER ASP TYR LYS VAL ALA PRO THR ASP ASPPAT10+ GLN SER ASP HIS GLU VAL THR PRO THR ASP ASPPAT11+ GLN SER ASP HIS GLU ALA ALA ALA THR ASP ASPPAT12+ GLM SER GLY HIS GLU VAL ALA ALA THR ASP ASPPATA+ HIS --- SER --- TYR GLU VAL ALA ALA THR GLU ASPSolanum cardiophyllum用从上述Solanum cardiophyllum块茎分离的mRNA经PCR得到10个cDNA克隆。根据每个克隆的至少75％的长度得到核苷酸序列。一个称为Pat17+的克隆的全长序列是SEQ ID NO30、SEQ ID NO31是加工后的成熟形式Pat17m。这些S.cardiophyllum克隆几乎是相同的，仅有随机的核苷酸序列改变，可能是实际差异或者PCR错误。但在位置54和519，观察到几个克隆有相同的变化，说明它们不是由扩增过程造成的。这些位置的核苷酸模式说明至少代表了4种不同的mRNA。在这一套cDNA克隆中，来自两组的mRNA被分离了几次，而另两组的mRNA只分离了一次。
S.cardiophyllum克隆被推测的氨基酸序列也极为相似。有8个氨基酸序列组，每一个与其它序列仅有一个残基不同。编码与Patl7+序列相同的氨基酸序列的cDNA克隆被回收了2次，而其它7个cDNA(Patl8+、19+、20+、21+、22+、23+和24+)含一个特有的残基。遗传转化按上文所讨论的，可从各种植物源分离马铃薯贮存蛋白基因。可以用这些基因中的一种或多种转化细菌细胞或植物细胞以便能生产马铃薯贮存蛋白并完成本发明的方法。下面将给出如何用各种马铃薯贮存蛋白的序列完成这一目的的实施。马铃薯贮存蛋白的cDNA的加工为了将马铃薯贮存蛋白基因掺入适用于在异源宿主细胞中表达马铃薯贮存蛋白的载体中，必需在该基因末端附近导入适当的限制位点。这样诱变的目的是为了得到包括蛋白质编码序列和最小非编码侧序列的盒，并掺入有用的限制位点以移动这些盒。设计这些盒以便可以移动包括信号肽或只有成熟编码序列的完整编码序列。对于PatAm，设计两种诱变引物以产生这些盒。SEQ ID NO12的诱变是用两个氨基酸(Met-Ala)取代成熟蛋白质N-末端的Lys，并导入-NcoI位点，SEQ ID NO13加入了第二个终止密码子和一个EcoRI位点。
所得的修饰序列鉴定为PatAm，SEQ ID NO14。对于所有其它cDNA，用PCR和上述的引物SEQ ID NO26和SEQ ID NO27或引物SEQ ID NO32和SEQ ID NO27进行相似的修饰并导入限制位点。在E.coli中表达马铃薯贮存蛋白将编码PatAm(SEQ ID NO14)的DNA序列插入pMON5766，一个得自pBR327(Soberon et al.，1980)的E.coli表达裁体，带有recA启动子和G10前导序列(Olin et al.，1989)。将所得的载体pMON19714转移到E.coli菌株JM101中，随后生产PatAm，由Western印迹分析和使用对-硝基苯C-10酯的酯酶活性加以证实。
将Pat17m及PatAm的DNA编码序列分别插入得自pMON6235的E.coli表达载体中，它带有AraBAD启动子(当细胞在阿拉伯糖中生长时可诱导)、G10前导序列和氨苄青霉素抗性基因。将含有Pat17m的所得载体pMON25213和含PatAm的pMON25216导入E.coli菌株JM101。
由转化的E.co1i表达马铃薯贮存蛋白。但它被分隔在折光体(refractile body RBs)中。用完整的细胞和溶解的RB进行SCRW检测。结果列于表9。
表9样品重复次数 完整细胞 溶解的RBs(pMON)SCRW活性1SCRW活性119714 Am1 2.5 nt2 1.5 1.025216 Am1 1.0 02 01.025213 17m1 3.0 3.022 1.5 0.5
1用幼虫发育障碍表示SCRW活性1＝轻微发育障碍(大小减小30-40％)，2＝中度发育障碍(大小减小50-80％)，3＝严重发育障碍(大小减小＞90％)。
2该样品的死亡率是81％。在植物定殖细菌中表达马铃薯贮存蛋白为了控制昆虫，还需在植物定殖细菌中表达一种或多种马铃薯贮存蛋白，然后将这种细菌用于植物。由于昆虫以植物为食，因此，它会摄取由植物寄生菌生产的毒性剂量的马铃薯贮存蛋白。植物寄生菌可以是在植物表面生活的那些细菌，如假单胞菌属或土壤杆菌属菌种，或生活在植物维管结构中的内寄生菌如Clavibacter种。对于表面寄生菌，可以将马铃薯贮存蛋白基因插入能在这些革兰氏阴性宿主中复制的宽宿主范围载体中。所述载体实例是IncQ不可兼容性类的pKT231(Bagdasarian et al.，1981)或IncP类的pVK100(Knauf，1982)对于内寄生菌，可通过同源重组或将基因掺入能在这些内寄生菌中进行染色体插入的适当转座子上，从而将马铃薯贮存蛋白基因插入染色体。在杆状病毒中表达马铃薯贮存蛋白将马铃薯贮存蛋白基因作为NcoI/EcoRI片段克隆到杆状病毒供体载体pMON14327(参见未决的US.Serial Number 07/941，363，1992.9.4申请，该文献掺入本文作为参考)中。供体载体pMON14327含有一个氨苄青霉素抗性基因、Tn7转座子的左和右臂、在这两臂之间有一庆大霉素抗性基因、强的杆状病毒多角体蛋白启动子和一个多接头。杆状病毒穿梭载体或杆状质粒(bacmid)由重组到AcNPV病毒基因组上的lacZ基因和卡那霉素抗性基因码内的mini-attTn7位点组成。借助四环素抗性辅助质粒pMON7124，通过将马铃薯贮存蛋白或Gus基因和标记基因转座到病毒基因组中可得到重组AcNPV病毒(Luckowet al.，1993)。将下列基因插入pNON14327中表7中所列的基因和Pat3+、Pat10+及Pat17+。
完成US.Serial No.07/941，363和Lockow等人的过程后，从上述基因生产大量的马铃薯贮存蛋白。由Western印迹分析和使用对-硝基苯C-10酯的酯酶活性确定马铃薯贮存蛋白的存在。除PatAm外，为了进行SCRW生物检测，每种同工酶至少按比例扩大两次。PatE+和PatEm发酵物始终几乎没有或没有马铃薯贮存蛋白表达，所有其它同工酶似乎均在生物检测可接受的水平表达了。但是，未确定与马铃薯相比，杆状病毒中马铃薯贮存蛋白蛋白质转译后加工的性质。用Pat17+、PatB+、PatDm、PatIm、PatL+、Pat3+观察到由杆状病毒表达的同工酶抗SCRW的生物活性。
确定了多种同工酶(由杆状病毒生产的)对昆虫生长和发育的影响。将11种Russet同工酶的等份试样与一种样品结合进行抗SCRW、ECB、小地老虎和TBW的生物检测。结合10-15mg每一种Q-Sepharose纯化的同工酶，除仅能得到1.7mg的PatDm外，这种混合物在TBW检测中导致100％的死亡率，对ECB重量减少93％。因此，分开检测每种同工酶对TBW和ECB的作用。与裁体对照幼虫相比，以用同工酶PatC+、PatL+和PatIm处理的食物为食的TBW和ECB表现出明显的发育障碍(≥75％)和/或死亡。PatB+和PatDm对TBW发育的影响分别为69％和78％。植物基因构建以双链DNA形式存在的植物基因的表达涉及由RNA聚合酶从一条DNA链转录为信使RNA(mRNA)随后在核内加工mRNA初级转录物。这种加工涉及一个3’非转译区，将多腺苷酸核苷酸加到RNA的3’末端。DNA转录成mRNA由通常称为“启动子”的一个DNA区域调节。该启动子区含有指示RNA聚合酶与DNA相连的碱基序列，并引发以一条DNA链为模板的mRNA的转录以得到相应RNA链。
在文献中已描述了许多在植物细胞中有活性的启动子。所述启动子可由植物或植物病毒得到，包括但不限于胆脂碱合成酶(NOS)和章鱼碱合成酶(OCS)启动子(由土壤杆菌肿瘤诱导质粒携带)、花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子、来自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚单位(ssRUBISCO，一种丰富的植物多肽)的光可诱导启动子和无花果花叶病毒(FMV)35S启动子。已用所有这些启动子得到了已在植物中表达的各种类型的DNA(参见如PCT公开WO84/02913)。人们也可将表达限制在对昆虫攻击敏感的特定植物部位。例如，可以用根特异性启动子将表达限制在根部或者用根增强的启动子增加活性蛋白在根部的水平。对食根昆虫敏感的植物来说，这是优选的。
特定的植物启动子在单子叶植物中更有效。例如，在WO9/09948中描述的大米肌动蛋白启动子对于在玉米中表达是有效的。在EP0342926中描述的玉米遍在蛋白质(ubiquitin)启动子也可用于单子叶植物。
如果需要可以修饰在本发明DNA构建体(即嵌合植物基因)中所用的启动子以影响其控制特性。例如，可将CaMV35S启动子与在没有光时抑制ssRUBISCO表达的ssRUBICO基因部分连接以得到在叶中有活性而在根中没有活性的启动子。按本文所述，所得的嵌合启动子也可使用。
从这种描述的意义上来说，“CaMV35S”启动子因此包括CaMV35S启动子的变异体，如通过与操纵子区相连，随机或控制诱变等而得到的启动子。此外，可以改变启动子以包含多个可提高基因表达的“增强子序列”。已由kay等人(1987)报告了所述增强子序列的实例。
所选的特定启动子应能引起酶编码序列的充分表达以生产出有效量的马铃薯贮存蛋白。优选的启动子是CaMVE35S启动子(增强的CaMV35S)。
由本发明DNA构建体产生的RNA还包含5’非转译前导序列。可从所选的启动子得到该序列以表达基因，并且可以特异性对其进行修饰以提高mRNA的转译。也可从病毒RNA，从适宜的真核基因或者合成的基因序列得到5’非转译前导区。本发明不限于其中非转译区得自与启动子序列相伴的5’非转译区的构建体。
如上文所述，本发明嵌合植物基因的3’非转译区含有一个在植物中起作用的多腺苷酸信号，以使腺苷酸核苷酸加到RNA的3’末端。优选的3’区的实例是(1)含土壤杆菌肿瘤诱导(Ti)质粒基因，如胆脂碱合成酶(NOS)基因的多腺苷酸信号的3’转录的非转译区和(2)类似大豆7s贮存蛋白质基因和豌豆ssRUBISCO E9基因的植物基因[Fischhoff et al]。位置含上述马铃薯贮存蛋白盒的载体在植物细胞的细胞质或液泡中表达活性蛋白。这就需将大部分或全部马铃薯贮存蛋白引入植物分泌途径。为了达到这一目的，最好使用来自细菌或植物基因的信号序列，但预期的植物基因是优选的。所述信号序列的实例是来自内蛋白酶B基因(Koehler and Ho)和烟草PRlb基因(Cornelissen et al.，)的那些序列。在EP公开0385962中公开的pMON10824是一种经设计用于表达鳞翅目活性B.t.kurstaki蛋白质的植物转化载体。在pMON10824中，B.t.k.编码序列与PR1b信号序列加成熟PR1b编码序列的10个氨基酸融合。为了得到其中PR1b信号与马铃薯贮存蛋白基因融合的载体，用BglII和NcoI切割pMON10824，然后分离含PR1b信号的小BglII-NcoI片段。在连接反应中，将小BglII-NcoI pMON10824片段与来自pMON19714的10kb NcoI-EcoRI片段和BamHI-EcoRI消化的pMON19470(Brown et al.)混合。该反应构建一个质粒，其中马铃薯贮存蛋白编码序列与来自PR1b基因的分泌信号融合，并受CaMV35S启动子和用于单子叶植物表达的内含子的控制。对于双子叶植物的基因表达，可进行相似的反应。可将双子叶植物表达载体的NotI-NotI片段插入下文所述的双子叶植物转化载体中，然后转移到无防御的土壤杆菌宿主中，用于转化双子叶植物。因此，可以得到生产将马铃薯贮存蛋白分泌到细胞外空间的植物。
可将该单子叶植物质粒的NotI-NotI片段插入玉米转化载体(如上述的pMON18181)以生产分泌马铃薯贮存蛋白的玉米植物。
有利的是指导马铃薯贮存蛋白定位到另一细胞区叶绿体中。通过包含在叶绿体传递肽(CTP)的N-末端，可将蛋白质移到叶绿体。已知能使异源蛋白质定位于叶绿体的一种CTP来自拟南芥属的RUBISCO小亚单位基因，称为ats1A。已构建了这种传递肽的变异体，它编码传递肽、成熟RUBISCO序列的23个氨基酸加一个重复的传递肽裂解位点，以成功地进行B.t.k.蛋白质的叶绿体定位。Brown等人描述的pMON19642含有与GOX基因融合的Arabidopsis atslA传递肽，并可用某构建用于马铃薯贮存蛋白叶绿体定位的载体。pMON19643用EcoRI完全和NcoI部分消化，分离大(4.0kb)片段。在连接反应中，来自pMON19714的NcoI-EcoRI片段与pMON19643的大片段混合。该反应构建了一个质粒，其中马铃薯贮存蛋白编码序列与带成熟RUBISCO的23个氨基酸的拟南芥属传递肽融合，而且该质粒由CaMVE35S启动子控制。可构建另一相似质粒，用FMV35S启动子取代上述启动子。将所述质粒转移到无防御能力的土壤杆菌宿主中，用于转化双子叶植物。另外，按上述，将NotI-NotI片段克隆到玉米转化载体中。因此，可以得到生产位于叶绿体中的马铃薯贮存蛋白。植物转化和表达经任何适当的方法均可将含本发明结构编码序列的嵌合植物基因插入植物基因组。适宜的植物转化载体包括得自土壤杆菌Ti质粒的那些载体，以及例如由Herrera-Estrella(1983)、Bevan(1983)，Klee(1985)和EPO公开0120516(Schilperoort et al.)公开的那些，除得自土壤杆菌的Ti或根诱导(Ri)质粒的植物转化载体外，也可以用其它方法将本发明的DNA构建体插入植物细胞。所述方法可包括，例如，使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA吸收的化学物质，经显微发射弹轰击(microprojectile bombardment)的游离DNA释放和使用病毒或花粉的转化。马铃薯贮存蛋白在烟草细胞中的瞬时表达对于转化双子叶植物特别有用的质粒盒载体是pMON11794。表达盒pMON11794由CaMVE35S启动子、牵牛Hsp705’非转译前导序列，包括NOS基因的多腺苷酸信号的3’末端组成。pMON11794包括用于插入编码序列的NcoI和EcoRI位点，位于植物基团表达盒侧翼的NotI-NotI位点。
将PatA(SEQ ID NO11)、PatB+(SEQ ID NO16)、PatC+(SEQ ID NO17)和PatG+(SEQ ID NO22)各插入pMON11794以分别得到pMON19745、pMON19742、pMON19743、pMON19744。将每个载体均经电穿孔转至烟草原生质体中。由Western印迹分析确定转化烟草细胞进行的马铃薯贮存蛋白表达。双子叶植物(dicots)的稳定转化已由Rosahl等人报告了用马铃薯贮存蛋白基因稳定转化双子叶植物。在叶和茎特异性启动子的控制下，用马铃薯贮存蛋白基因转化烟草。马铃薯贮存蛋白得以表达。
将pMON19745的NotI-NotI片段插入pMON17227(由Barry等人在WO92/04449中公开并描述的Ti质粒，该文献掺入本文作为参考)以得到pMON22566。该载体含有由Barry描述的用于选转化植物的甘草膦抗性基因。相似地用SEQ ID NO16、SEQ ID NO17和SEQ IDNO22分别得到载体pMON22563、22564和22565。
将这些载体导入无防御能力的土壤杆菌ABI中，并用于转化组织培养中的番茄外植体。筛选甘草膦抗性并植物再生后，回收表达马铃薯贮存蛋白的所有植株。由Western印迹分析确定马铃薯贮存蛋白基因的表达，初步结果表明表达水平在总蛋白质的0.1到0.5％之间。使用昆虫幼虫进行生物检测。马铃薯贮存蛋白在玉米细胞中的瞬时表达将上述的pMON9729的1kb NcoI-EcoRI片段插入pMON19433(在Wo93/19189和未决美国专利申请系列No.07/855,857(1992，3，19申请)(Brown等人)中描述的，该文献掺入本文作为参考)。用NotI消化所得的质粒pMON19731，将所得片段插入也由Brown等人描述的pMON10081中以得到pMON19740。将该质粒按Sheen，1991所述电穿孔到玉米叶原生质体中。用Western印迹分析确定转化的玉米原生质体对马铃薯贮存蛋白的表达。
为了得到马铃薯贮存蛋白的细胞质表达，将pMON19714的NcoI-EcoRI片段插入pMON19433以得到pMON19730。将pMON19730的NotI片段插入pMON10081，将所得的质粒pMON19739电穿孔到玉米叶原生质体中，由Western印迹分析确定生产的马铃薯贮存蛋白。
在玉米原生质体中还表达带有或不带靶信号的Pat17。将编码蛋白质Pat17+(成熟Pat17蛋白质和其自己关于液泡靶目标的信号序列)的1.1kb NcoI-EcoRI片段(SEQ ID NO30)插入pMON19648中。因此，pMON19761含有CaMVE35S启动子、Hsp70内含子、Pat17+基因和用于玉米细胞中表达的NOS终止子。
为了得到用于细胞质表达的裁体，用编码pMON25213的Pat17m蛋白质(SEQ ID NO31)的NcoI-EcoRI片段代替pMON19761中的Pat17+序列以形成构建体pMON25223。
通过将含有pMON19643(Brown et al.)的拟南芥(Arabidopsisthaliana)SSUla基因(Timko et al.)的叶绿体传递肽(CTP)的0.3kb XbaI-NcoI片段和pMON25213 Pat17m的1Kb NcoI-EcoRI两个片段插入pMON19761(XbaI-EcoRI)而得到pMON25224。因此，pMON25224含有CaMVE35S启动子、Hsp7O内含子、CTP/Pat17m编码序列和NOS终止子。
为了达到在细胞外的目标，将编码分泌蛋白质细胞外信号肽的内蛋白质酶B cDNA(Koehler and Ho)的5’末端与pMON25213的Pat17m基因相连。用拼接重叠延伸技术(Horton et al.)得到含嵌合基因的BglII-EcoRI片段，然后将其插入pMON19761(BamHI-EcoRI)以得到pMON25225 。
将所有这些构建体电穿孔到玉米叶原生质体中用Western印迹分析确定Par17+的表达。用马铃薯贮存蛋白基因稳定转化玉米从pMON19653和pMON19643(Brown et al.)构建玉米转化载体pMON18181。该构建体含CaMVE35S启动子、Hsp70内含子、CP4甘草膦选择标记和NOS终止子组成的盒CaMVE35S启动子、Hsp70内含子、GOX甘草膦选择标记、NOS终止子和一个NotI位点(用于插入含马铃薯贮存蛋白基的基因表达盒)组成的盒。将SEQ ID NO11和SEQ ID NO30各作为NotI-NotI片段插入pMON18181以分别得到pMON19746和pMON19764。
按Brown等人所述，通过使用biolistic颗粒枪的胚发生组织培养轰击法插入这些载体。用甘草膦抗性筛选转化的细胞，并再生完整的植株。用Western印迹分析，酯酶活性检测，和/或昆虫抗性检测证实昆虫抗性植物表达基因的水平为总蛋白质的0.1-0.5％。合成基因用于提高单子叶植物的表达已经证明修饰编码序列可提高其它杀虫蛋白质基因如苏云金芽孢杆菌δ-内毒素序列(Fischhoff and Perlak；WO93/07278，Ciba-Geigy)的表达。因此修饰编码序列以提高马铃薯贮存蛋白在植物，特别是玉米中的表达。在SEQ ID NO33中列出了修饰过的Pat17序列。合成含SEQ ID NO33的DNA片段并将其插入玉米表达盒载体，如pMON19470(Brown et al.)。然后将玉米表达盒插入pMON18181或其它含有玉米转化可选择标记基因的玉米植物转化载体中，就可得到表达Pat17+的完整玉米植株。从上述可以看出，本发明完全可得到上述的所有结果和目的以及本发明显而易见并且其内在的优点。应理解某种特征和辅助结合具实用性，而且不参考其它特征和辅助结合也可使用。这由权利要求实现并在权利要求的范围内。在不超出本发明范围的情况下，可以完成许多可能的实施方案，因此，本文所列的所有物质均是说明性的而没有限制意义。
似乎具体并单独说明了每篇文献或专利掺入本文作为参考，总之本说明书中的所有文献和专利掺入本文作为参考。
参考文献irews，etal.Biochem.J.252199-206，1988.Bagdasarian et al.，Gene，16237-47，1981.Barry et al.WO92/04449.Bevan，M.et al.，Nature.304184，1983.D.Boulter，A.M.R.Gatehouse and V.Hilder，Biotech Adv.7489，1989.Broadway and Duffey，J.Insect PhVSiol.23827，1986.Brown et al.WO93/19189 and co-pending U.S.patent application SerialNumber07/855，857，filed March 19，1992.Cornelissen，B.J.C.，etal.EMBO Journal，537-40，1986.Czapla and Lang，J.Econ.Entomol.832480，1990.Fischhoff，D.A.and Perlak，F.J.European Pat.Appl.No.0 385 962，1990.Fischhoff et al.，Bio/Technol.5807 1987.Gaillaird，T.Biochem.J.121379-390，1971.Ganal et al.，Mol.Gen.Genetics，225501-509，1991.Gatehouse et al.，J.Sci.Agric.37727，1986.Herrera-Estrella，L.et al.，Nature，303209，1983.Heusing et al.，Plant Phvsiol.96993，1991.Hofgen，R.，and Willmitzer，L.Plant Science，66221-230，1990.Horton et al.，Gene，7761-68，1989.Ishimoto aid K.Kitamura，Appl.Ent.Zool.24281，1989.Kay，R.et al.，Science，2361299-1302，1987.Elee，H.J.et al.，Bio/Technology，3637-642，1985.Knauf，V.C.and Nester，E.Plasmid，843-54，1982.Koehler，S.，and Ho.，T.-H.D.，Plant CeH，2769-783，1990.Lnckow，V.A.，et al.，J.Virol.674566-4579.1993.Marrone，P.G.，et al.J.Econ.Entom.，78290-3，1985.Miguery，et al.，Nucleic Acids Research，127987-8000，1984.Mignery，et al.，Gene，62∶27-44，1988.Murdock et al.，Phvtochemistry，2985，1990.Olins，P.，et al.，J.Biol.Chem.，26416973-16976，1989.Park，W.D.，et al.，Plant Physiol.，71156-160，1983.Pernes，J.F.，et al.，J.Chromatography，181254-258，1980-Racusen，D.，Can.J.Bot.，621640-1644，1984.Racusen，D.，Can.J.Bot.，642104-2106，1986.Racusen and Foote，J.Food Biochem，4∶43-52，1980.Rodis，P.and Hoff，J.E.，Plant PhVSiol.，74907-911，1984.ROSahl et al.，The EMBO Journal，6(5)1155-1159.Ryan，Ann.Rev.Phvtopath.，28425-449，1990.Schilperoort，et al.，EPO Publication Number 0 120 516.Sheen，Jen，Plant Cell，3225-245，1991.Shukle and Murdock，Environ.Ent12787，1983.Soberon，X.，et al.，Gene，9287-305，1980.Stiekema et al.，Plant Mol.Biol.，11255-269，1988.Timko et al.The Impact of Chemistrv on Biotechnology，ACS Books，1988，279-295).Vancanneyt et al.，Plant Cell，1533-540，1989.
序列表(1)一般资料(i)申请人(A)名称Monsanto Company(B)街道800 North Lindbergh Boulevard(C)城市St.Louis(D)州Missouri(E)国家美利坚合众国(F)邮编63167(G)电话(314)694-3131(H)电传(314)694-5435(ii)发明题目控制昆虫的方法(iii)序列数33(iv)计算机可读形式(A)介质类型Floppy disk(B)计算机IBM PC兼容的(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(vi)在先申请资料(A)申请号US08/031146(B)申请日12-MAR-1993(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度15个氨基酸
(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Lys Leu Glu Glu Met Val Thr Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Xaa Leu Gly Glu Met Val Thr Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Thr Leu Gly Glu Met Val Thr Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO4Thr Leu Gly Glu Met Val Thr Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5Lys Leu Xaa Glu Met Val Thr Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO6的资料(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO6Xaa Xaa Glu Glu Met Val Thr Val1 5(2)SEQ ID NO7的资料(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO7Ser Leu Asp Tyr Lys Gln Met Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO8的资料(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Lys Leu Asp Tyr Lys Gln Met Leu1 5(2)SEQ ID NO9的资料(i)序列特征(A)长度15个氨基酸
(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Ser Leu Xaa Tyr Lys Gln Met Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO10的资料(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO10Ser Leu Asn Tyr Lys Gln Met Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO11的资料(i)序列特征(A)长度1171个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTTTAATTT TATTTTTTAT GATATTAGCA ACTACTAGTT60CAACATGTGC TAAGTTGGAA GAAATGGTGA CTGTTCTTAG TATTGATGGA GGTGGAATTA 120AGGGAATCAT TCCAGCTATC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG GAAGTGGACA 180ATAATAAAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACA AGTACAGGAG 240GTTTATTGAC TGCTATGATA ACTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCCTTT GCTGCTGCCA 300AAGATATTGT ACCCTTTTAC TTCGAACATG GCCCTCATAT TTTTAATTAT AGTGGTTCAA 360TTATTGGCCC AATGTATGAT GGAAAATATC TTCTGCAAGT TCTTCAAGAA AAACTTGGAG 420AAACTCGTGT GCATCAAGCT TTGACAGAAG TTGCCATCTC AAGCTTTGAC ATCAAAACAA 480ATAAGCCAGT AATATTCACT AAGTCAAATT TAGCAAAGTC TCCAGAATTG GATGCTAAGA 540TGTATGACAT ATGCTATTCC 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TGACATCAAA ACAAATAAGC 420CAGTAATATT CACTAAGTCA AATTTAGCAA AGTCTCCAGA ATTGGATGCT AAGATGTATG 480ACATATGCTA TTCCACAGCA GCAGCTCCAA TATATTTTCC TCCACATCAC TTTGTTACTC 540ATACTAGTAA TGGTGCTAGA TATGAGTTCA ATCTTGTTGA TGGTGCTGTT GCTACTGTTG 600GTGATCCGGC GTTATTATCC CTTAGCGTTG CAACGAGACT TGCACAAGAG GATCCAGCAT 660TTTCTTCAAT TAAGTCATTG GATTACAAGC AAATGTTGTT GCTCTCATTA GGCACTGGCA 720CTAATTCAGA GTTTGATAAA ACATATACAG CAGAAGAGGC AGCTAAATGG GGTCCTCTAC 780GATGGATGTT AGCTATACAG CAAATGACTA ATGCAGCAAG TTCTTACATG ACTGATTATT 840ACATTTCTAC TGTTTTTCAA GCTCGTCATT CACAAAACAA TTACCTCAGG GTTCAAGAAA 900ATGCATTAAA TGGCACAACT ACTGAAATGG ATGATGCGTC TGAGGCTAAT ATGGAATTAT 960TAGTACAAGT TGGTGAAACA TTATTGAAGA AACCAGTCTC CAAAGACAGT CCTGAAACCT 1020ATGAGGAAGC TCTAAAGAGA TTTGCAAAAT TGCTCTCTGA TAGGAAGAAA CTCCGAGCAA 1080ACAAAGCTTC TTATTAATGA GAATTC 1106(2)SEQ ID NO21的资料(i)序列特征(A)长度1109个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO21CCATGGCGTT GGAAGAAATG GTGGCTGTTC TTAGTATTGA TGGAGGTGGA ATTAAGGGAA 60TCATTCCGGG TACCATTCTC 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AATATGGAAT 960TATTAGCACA AGTTGGTGAA AATTTATTGA AGAAACCAGT TTCCAAAGAC AATCCTGAAA 1020CCTATGAGGA AGCTCTAAAG AGGTTTGCAA AATTGCTTTC TGATAGGAAG AAACTTCGAG 1080CAAACAAAGC TTCTTATTAA TGAGAATTC 1109(2)SEQ ID NO22的资料(i)序列特征(A)长度1172个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO22CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTTTAATTT TATTTTTTAT GATATTAGCA ACTACTAGTT 60CAACATGTGC TAAGTTGGAA GAAATGGTTA CTGTTCTAAG TATTGATGGA GGTGGAATTA 120AGGGAATCAT TCCAGCTATC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG GAAGTGGACA 180ATAATAAAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACA AGTACAGGAG 240GTTTATTGAC TGCTATGATA ACTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCCTTT GCTGCTGCCA 300AAGATATTGT ACCCTTTTAC TTCGAACATG GCCCTCATAT TTTTAATTAT AGTGGTTCAA 360TTTTAGGCCC AATGTATGAT GGAAAATATC TTCTGCAAGT TCTTCAAGAA AAACTTGGAG 420AAACTCGTGT GCATCAAGCT TTGACAGAAG TTGCCATCTC AAGCTTTGAC ATCAAAACAA 480ATAAGCCAGT AATATTCACT AAGTCAAATT TAGCAAAGTC TCCAGAATTG GATGCTAAGA 540TGTATGACAT ATGCTATTCC ACAGCAGCAG CTCCAATATA TTTTCCTCCA CATCACTTTG 600TTACTCATAC TAGTAATGGT GCTAGATATG AGTTCAATCT TGTTGATGGT GCTGTTGCTA 660CTGTTGGTGA TCCGGCGTTA TTATCCCTTA GCGTTGCAAC GAGACTTGCA CAAGAGGATC 720CAGCATTTTC TTCAATTAAG TCATTGGATT ACAAGCAAAT GTTGTTGCTC TCATTAGGCA 780CTGGCACTAA TTCAGAGTTT GATAAAACAT ATACAGCAGA AGAGGCAGCT AAATGGGGTC 840CTCTACGATG GATGTTAGCT ATACAGCAAA TGACTAATGC AGCAAGTTCT TACATGACTG 900ATTATTACAT TTCTACTGTT TTTCAAGCTC GTCATTCACA AAACAATTAC CTCAGGGTTC 960AAGAAAATGC ATTAAATGGC ACAACTACTG AAATGGATGA TGCGTCTGAG GCTAATATGG 1020AATTATTAGT ACAAGTTGGT GAAACATTAT TGAAGAAACC AGTTTCCAAA GACAGTCCTG 1080AAACCTATGA GGAAGCTCTA AAGAGATTTG CAAAATTGCT CTCTGATAGG AAGAAACTCC 1140GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TAATGAGAAT TC 1172(2)SEQ ID NO23的资料(i)序列特征(A)长度1104个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO23CCATGGTTGG AAGAAATGGT GACTGTTCTA AGTATTGATG GAGGTGGAAT TAAGGGAATC 60ATTCCAGCTA TCATTCTCGA ATTTCTTGAA GGACAACTTC AGGAAGTGGA CAATAATAAA 120GATGCAAGAC TTGCAGATTA CTTTGATGTA ATTGGAGGAA CAAGTACAGG AGGTTTATTG 180ACTGCTATGA TAACTACTCC AAATGAAAAC AATCGACCCT TTGCTGCTGC CAAAGATATT 240GTACCCTTTT ACTTCGAACA TGGCCCTCAT ATTTTTAATT ATAGTGGTTC AATTTTAGGC 300CCAATGTATG ATGGAAAATA TCTTCTGCAA GTTCTTCAAG AAAAACTTGG AGAAACTCGT 360GTGCATCAAG CTTTGACGGA AGTTGCCATC TCAAGCTTTG ACATCAAAAC AAATAAGCCA 420GTAATATTCA CTAAGTCAAA TTTAGCAAAG TCTCCAGAAT TGGATGCTAA GATGTATGAC 480ATATGCTATT CCACAGCAGC AGCTCCAATA TATTTTCCTC CACATCACTT TGTTACTCAT 540ACTAGTAATG GTGCTAGATA TGAGTTCAAT CTTGTTGATG GTGCTGTTGC TACTGTTGGT 600GATCCGGCGT TATTATCCCT TAGCGTTGCA ACGAGACTTG CACAAGAGGA TCCAGCATTT 660TCTTCAATTA AGTCATTGGA TTACAAGCAA ATGTTGTTGC TCTCATTAGG CACTGGCACT 720AATTCAGAGT TTGATAAAAC ATATACAGCA GAAGAGGCAG CTAAATGGGG TCCTCTACGA 780TGGATGTTAG CTATACAGCA AATGACTAAT GCAGCAAGTT TTTACATGAC TGATTATTAC 840ATTTCTACTG TTTTTCAAGC TCGTCATTCA CAAAACAATT ACCTCAGGGT TCAAGAAAAT 900GCATTAAATG GCACAACTAC TGAAATGGAT GATGCGTCTG AGGCTAATAT GGAATTATTA 960GTACAAGTTG GTGAAACATT ATTGAAGAAA CCAGTTTCCA GAGACAGTCC TGAAACCTAT1020GAGGAAGCTC TAAAGAGATT TGCAAAATTG CTCTCTGATA GGAAGAAACT CCGAGCAAAC1080AAAGCTTCTT ATTAATGAGA ATTC 1104(2)SEQ ID NO24的资料(i)序列特征(A)长度1172个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO24CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTTTAATTT TATTTTTTAT GATATTAGCA ACTACTAGTT60CAACATGTGC TAAGTTGGAA GAAATGGTTA CTGTTCTAAG TATTGATGGA GGTGGAATTA 120AGGGAATCAT TCCAGCTATC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG GAAGTGGACA 180ATAATAAAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACA AGTACAGGAG 240GTTTATTGAC TGCTATGATA ACTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCCTTT GCTGCTGCCA 300AAGATATTGT ACCCTTTTAC TTCGAACATG GCCCTCATAT TTTTAATTAT AGTGGTTCAA 360TTTTAGGCCC AATGTATGAT GGAAAATATC TTCTGCAAGT TCTTCAAGAA AAACTTGGAG 420AAACTCGTGT GCATCAAGCT TTGACAGAAG TTGCCATCTC AAGCTTTGAC ATCAAAACAA 480ATAAGCCAGT AATATTCACT AAGTCAAATT TAGCAAAGTC TCCAGAATTG GATGCTAAGA 540TGTATGACAT ATGCTATTCC ACAGCAGCAG CTCCAATATA TTTTCCTCCA CATCACTTTG 600TTACTCATAC TAGTAATGGT GCTAGATATG AGTTCAATCT TGTTGATGGT GCTGTTGCTA 660CTGTTGGTGA TCCGGCGTTA TTATCCCTTA GCGTTGCAAC GAGACTTGCA CAAGAGGATC 720CAGCATTTTC TTCAATTAAG TCATTGGATT ACAAGCAAAT GTTGTTGCTC TCATTAGGCA 780CTGGCACTAA TTCAGAGTTT GATAAAACAT ATACAGCAGA AGAGGCAGCT AAATGGGGTC 840CTCTACGATG GATGTTAGCT ATACAGCAAA TGACTAATGC AGCAAGTTCT TACATGACTG 900ATTATTACAT TTCTACTGTT TTTCAAGCTC GTCATTCACA AAACAATTAC CTCAGGGTTC 960AAGAAAATGC ATTAAATGGC ACAACTACTG AAATGGATGA TGCGTCTGAG GCTAATATGG 1020AATTATTAGT ACAAGTTGGT GCAACATTAT TGAAGAAACC AGTCTCCAAA GACAGTCCTG 1080AAACCTATGA GGAAGCTCTA AAGAGATTTG CAAAATTGCT CTCTGATAGG AAGAAACTCC 1140GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TAATGAGAAT TC1172(2)SEQ ID NO25的资料(i)序列特征(A)长度1175个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO25CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTACAATTT TAATTTTTAT GATGTTAGCA ACTACTAGTT60CAACATTTGC TACATTGGGA GAAATGGTGA CTGTTCTTAG TATTGATGGA GGTGGAATTA 120AGGGAATCAT TCCGGCTACC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG GAAGTGGACA 180ATAATGCAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACA GGTACAGGAG 240GTTTATTGAC TGCTATGATA ACTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCTTTT GCTGCTGCTA 300AAGATATTAT ACCTTTTTAC TTCGATCATG GCCCTAAGAT TTTTGAACCT AGTGGTTTTC 360ACCTTTTTGA GCCAAAATAT GATGGAAAAT ATCTTATGCA AGTTCTTCAA GAAAAACTTG 420GAGAAACTCG TGTGCATCAA GCTTTGACAG GAGTTGCCAT CTCAAGCTTT GACATCAAAA 480CAAATAAGCC AGTAATATTC ACTAAGTCAA GTTTAGCAAA AACTCCAGAA TTGGATGCTA 540AGATGTATGA CATATGTTAT TCCACAGCAG CAGCTCCAAC ATATTTTCCT CCACATTACT 600TTGCTACTAA TACTAGTAAT GGAGATCAAT ATGACCTCAA TCTTGTTGAT GGCGATGTTG 660CTGCTGGTGA TCCGTCGTTA TTATCCATTA GCGTTGCAAC GAGACTTGCA CAAGAGGATC 720CAGCATTTGC TTCAATTAAG TCATTGAATT ACAAACAAAT GTTGTTGCTC TCATTAGGCA 780CTGGCACTAA TTCAGAGTTT GCTAAAAACT ATACAGCAGA AGAGGCAGCT AAATGGGGTA 840TTCTACAATG GGTATTCTCA CCTTTATGGG AAATGAGAAG TGCAGCAAGT TCTTACATGA 900ATGATTATTA CCTTTCTACT GTTTTTCAAG CTCTTGATTC ACAAAACAAT TACCTCAGGG 960TTCAAGAAAA TGCATTAACA GGCACAGCTA CTACATTTGA TGATGCTTCT CTGGCTAATA 1020TGATATTATT AGTACAAGTT GGTGAAAACT TATTGAAGAA ATCAGTTTCC GAAGACAATC 1080ATGAAACCTA TGAGGTAGCT CTAAAGAGGT TTGCAAAATT GCTCTCTGAT AGGAAGAAAC 1140TCCGAGCAAA CAAAGCTTCT TATTAATGAG AATTC 1175(2)SEQ ID NO26的资料(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(合成的)(xi)序列描述SEQ ID NO26GTTAGATCTC ACCATGGCAA CTACTAAATC TTT(2)SEQ ID NO27的资料(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(合成的)(xi)序列描述SEQ ID NO27CCAGAATTCT CATTAATAAG AAGCTTTGTT TGC(2)SEQ ID NO28的资料(i)序列特征(A)长度1172个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO28CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTACAATTT TAATTTTTAT GATGTTAGCA ACTACTAGTT60CAACATTTGC TACATTGGGA GAAATGGTGA CTGTTCTTAG TATTGATGGA GGTGGAATTA 120AGGGAATCAT TCCGGCTACC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG GAAGTGGACA 180ATAATACAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACA GGTACAGGAG 240GTTTATTGAC TGCTATGATA ACTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCCTTT GCTGCTGCTA 300AAGATATTAT ACCTTTTTAC TTCGATCATG GCCCTCAGAT TTTTGAACCT AGTGGTCTTC 360AAATTTTTGG CCCAAAATAT GATGGAAAAT ATCTTATGCA AGTTCTTCAA GAAAAACTTG 420GAGAAACTCG TGTGCATCAA GCTTTGACAG AAGTTGCCAT CTCAAGCTTT GACATCAAAA 480CAAATAAGCC AGTAATATTC ACTAAGTCAA ATTTAGCAAA AACTCCAGAA TTGGATGCTA 540AGATGTATGA CATATGTTAT TCCACAGCAG CAGCTCCAAC ATATTTTCCT CCACATTACT 600TTGCTACTAA TACTAGTAAT GGAGATCAAT ATGACTTCAA TCTTGTTGAT GGTGATGTTG 660CTGCTGGTGA TCCGTCGTTA TTATCCATTA GCGTTGCAAC GAGACTTGCA CAAGAGGATC 720CAGCATTTGC TTCAATTAGG TCGTTGAATT ACAAACAAAT GTTGTTGCTC TCATTAGGCA 780CTGGCACTAC TTCAGAGTTT TATAAAAACT ATACAGCAGA AGAGGCAGCT AAATGGGGTA 840TTCTACAATG GCTGTTACCT TTACAGGAAA TGAGAAGTGC AGCAAGTTCT TACATGAATG 900ATTATTACCT TTCTACTGTT TTTCAAGCTC TTGATTCACA AAACAATTAC CTCAGGGTTC 960AAGAAAATGC ATTAACAGGC ACAGCTACTA AATTTGATGA TGCTTCTGTG GCTAATATGA 1020TATTATTAGT ACAAGTTGGT GAAAACTTAT TGAAGAAATC AGTTTCTGAA GACAATCATG 1080AAACCTATGA GGTAGCTCTA AAGAGGTTTG CAAAATTGCT CTCCGATAGG AAGAAACTCC 1140GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TAATGAGAAT TC1172(2)SEQ ID NO29的资料(i)序列特征(A)长度1172个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO29CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTACAATTT TAATTTTTAT GATGTTAGCA ACTACTAGTT60CAACATTTGC TACATTGGGA GAAATGGTGA CTGTTCTTAG TATTGATGGA GGTGGAATTA 120AGGGAATCAT TCCGGCTACC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG GAAGTGGACA 180ATAATACAGA TGCAAGACCT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACA GGTACAGGAG 240GTTTATTGAC TGCTATGATA ACTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCCTTT GCTGCTGCTA 300AAGATATTAT ACCTTTTTAC TTCGATCATG GCCCTCAGAT TTTTGAACCT AGTGGTTCAA 360TTTTTGATGG CCCAAAATAT GATGGAAAAC ATCTTATGCA AGTTCTTCAA GAAAAACTAG 420GAGAAACTCG TGTGCATCAA ACTTTGACAG AAGTTGCCAT CTCAAGCTTT GACATCAAAA 480CAAATAAGCC AGTAATATTC ACTAAGTCAA ATTTACCAAA AACTCCAGAA TTGGATGCTA 540AGATGTATGA CATATGTTAT TCCACAGCAG CAGCTCCAAC ATATTTTCCT CCACATTACT 600TTGCTACTAA TACTAGTAAT GGAGATCAAT ATGACTTCAA TCTTGTTGAT GGTGATGTTG 660CTGCTGGTGA TCCGTCGTTA TTATCCATTA GCGTTGCAAC GAGACTTGCA CAAGAGGATC 720CAGCATTTGC TTCAATTAGG TCGTTGAATT ACAAACAAAT GTTGTTGCTC TCATTAGGCA 780CTGGCACTAC TTCAGAGTTT TATAAAAACT ATACAGCAGA AGAGGCAGCT AAATGGGGTA 840TTCTACAATG GCTGTTACCT TTACAGGAAA TGAGAAGTGC AGCAAGTTCT TACATGAATG 900ATTATTACCT TTCTACTGTT TTTCAAGCTC TTGATTCACA AAACAATTAC CTCAGGGTTC 960AAGAAAATGC ATTAACAGGC ACAGCTACTA AATTTGATGA TGCTTCTGTG GCTAATATGA 1020TATTATTAGT ACAAGTTGGT GAAAACTTAT TGAAGAAATC AGTTTCTGAA GACAATCATG 1080AAACCTATGA GGTAGCTCTA AAGAGGTTTG CAAAATTGCT CTCCGATAGG AAGAAACTCC 1140GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TAATGAGAAT TC1172(2)SEQ ID NO30的资料(i)序列特征(A)长度1172个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(Xi)序列描述SEQ ID NO30CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTTTAATTT TAATATTTAT GATATTAGCA ACTACTAGTT60CAACATTTGC TCAGTTGGGA GAAATGGTGA CTGTTCTTAG TATTGATGGA GGTGGAATTA 120GAGGGATCAT TCCGGCTACC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG GAAATGGACA 180ATAATGCAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACA AGTACAGGAG 240GTTTATTGAC TGCTATGATA AGTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCCTTT GCTGCTGCCA 300AAGAAATTGT ACCTTTTTAC TTCGAACATG GCCCTCAGAT TTTTAATCCT AGTGGTCAAA 360TTTTAGGCCC AAAATATGAT GGAAAATATC TTATGCAAGT TCTTCAAGAA AAACTTGGAG 420AAACTCGTGT GCATCAAGCT TTGACAGAAG TTGTCATCTC AAGCTTTGAC ATCAAAACAA 480ATAAGCCAGT AATATTCACT AAGTCAAATT TAGCAAACTC TCCAGAATTG GATGCTAAGA 540TGTATGACAT AAGTTATTCC ACAGCAGCAG CTCCAACATA TTTTCCTCCG CATTACTTTG 600TTACTAATAC TAGTAATGGA GATGAATATG AGTTCAATCT TGTTGATGGT GCTGTTGCTA 660CTGTTGCTGA TCCGGCGTTA TTATCCATTA GCGTTGCAAC GAGACTTGCA CAAAAGGATC 720CAGCATTTGC TTCAATTAGG TCATTGAATT ACAAAAAAAT GCTGTTGCTC TCATTAGGCA 780CTGGCACTAC TTCAGAGTTT GATAAAACAT ATACAGCAAA AGAGGCAGCT ACCTGGACTG 840CTGTACATTG GATGTTAGTT ATACAGAAAA TGACTGATGC AGCAAGTTCT TACATGACTG 900ATTATTACCT TTCTACTGCT TTTCAAGCTC TTGATTCAAA AAACAATTAC CTCAGGGTTC 960AAGAAAATGC ATTAACAGGC ACAACTACTG AAATGGATGA TGCTTCTGAG GCTAATATGG 1020AATTATTAGT ACAAGTTGGT GAAAACTTAT TGAAGAAACC AGTTTCCGAA GACAATCCTG 1080AAACCTATGA GGAAGCTCTA AAGAGGTTTG CAAAATTGCT CTCTGATAGG AAGAAACTCC 1140GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TAATGAGAAT TC1172(2)SEQ ID NO31的资料(i)序列特征(A)长度1106个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO31CCATGGCGTT GGAAGAAATG GTGACTGTTC TTAGTATTGA TGGAGGTGGA ATTAGAGGGA 60TCATTCCGGC TACCATTCTC GAATTTCTTG AAGGACAACT TCAGGAAATG GACAATAATG 120CAGATGCAAG ACTTGCAGAT TACTTTGATG TAATTGGAGG AACAAGTACA GGAGGTTTAT 180TGACTGCTAT GATAAGTACT CCAAATGAAA ACAATCGACC CTTTGCTGCT GCCAAAGAAA 240TTGTACCTTT TTACTTCGAA CATGGCCCTC AGATTTTTAA TCCTAGTGGT CAAATTTTAG 300GCCCAAAATA TGATGGAAAA TATCTTATGC AAGTTCTTCA AGAAAAACTT GGAGAAACTC 360GTGTGCATCA GGCTTTGAGA GAAGTTGTCA TCTCAAGCTT TGACATCAAA ACAAATAAGC 420CAGTAATATT CACTAAGTCA AATTTAGCAA ACTCTCCAGA ATTGGATGCT AAGATGTATG 480ACATAAGTTA TTCCACAGCA GCAGCTCCAA CATATTTTCC TCCCCATTAC TTTGTTACTA 540ATACTAGTAA TGGAGATGAA TATGAGTTCA ATCTTGTTGA TGGTGCTGTT GCTACTGTTG 600CTGATCCGGC GTTATTATCC ATTAGCGTTG CAACGAGACT TGCACAAAAG GATCCAGCAT 660TTGCTTCAAT TAGGTCATTG AATTACAAAA AAATGCTGTT GCTCTCATTA GGCACTGGCA 720CTACTTCAGA GTTTGATAAA ACATATACAG CAAAAGAGGC AGCTACCTGG ACTGCTGTAC 780ATTGGATGTT AGTTATACAG AAAATGACTG ATGCAGCAAG TTCTTACATG ACTGATTATT 840ACCTTTCTAC TGCTTTTCAA GCTCTTGATT CAAAAAACAA TTACCTCAGG GTTCAAGAAA 900ATGCATTAAC AGGCACAACT ACTGAAATGG ATGATGCTTC TGAGGCTAAT ATGGAATTAT 960TAGTACAAGT TGGTGAAAAC TTATTGAAGA AACCAGTTTC CGAAGACAAT CCTGAAACCT 1020ATGAGGAAGC TCTAAAGAGG TTTGCAAAAT TGCTCTCTGA TAGGAAGAAA CTCCGAGCAA 1080ACAAAGCTTC TTATTAATGA GAATTC 1106(2)SEQ ID NO32的资料(i)序列特征
(A)长度45个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(合成的)(xi)序列描述SEQ ID NO32CCATCTAGAA GATCTCCACC ATGGCGTTGG GAGAAATGGT GACTG(2)SEQ ID NO33的资料(i)序列特征(A)长度1164个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO33ATGGCCACCA CCAAGAGCTT CCTCATCCTG ATCTTCATGA TCCTGGCCAC CACCAGCAGC60ACCTTCGCCC AGCTCGGCGA GATGGTGACC GTGCTCTCCA TCGACGGCGG TGGCATCAGG 120GGCATCATCC CGGCCACCAT CCTGGAGTTC CTGGAGGGCC AACTCCAGGA GATGGACAAC 180AACGCCGACG CCCGCCTGGC CGACTACTTC GACGTGATCG GTGGCACCAG CACCGGCGGT 240CTCCTGACCG CCATGATCTC CACTCCGAAC GAGAACAACC GCCCCTTCGC CGCTGCGAAG 300GAGATCGTCC CGTTCTACTT CGAACACGGC CCTCAGATTT TCAACCCCTC GGGTCAAATC 360CTGGGCCCCA AGTACGACGG CAAGTACCTT ATGCAAGTGC TTCAGGAGAA GCTGGGCGAG 420ACTAGGGTGC ACCAGGCGCT GACCGAGGTC GTCATCTCCA GCTTCGACAT CAAGACCAAC 480AAGCCAGTCA TCTTCACCAA GTCCAACCTG GCCAACAGCC CGGAGCTGGA CGCTAAGATG 540TACGACATCT CCTACTCCAC TGCTGCCGCT CCCACGTACT TCCCTCCGCA CTACTTCGTC 600ACCAACACCA GCAACGGCGA CGAGTACGAG TTCAACCTTG TTGACGGTGC GGTGGCTACG 660GTGGCGGACC CGGCGCTCCT GTCCATCAGC GTCGCCACGC GCCTGGCCCA GAAGGATCCA 720GCCTTCGCTA GCATTAGGAG CCTCAACTAC AAGAAGATGC TGCTGCTCAG CCTGGGCACT 780GGCACGACCT CCGAGTTCGA CAAGACCTAC ACTGCCAAGG AGGCCGCTAC CTGGACCGCC 840GTCCATTGGA TGCTGGTCAT CCAGAAGATG ACGGACGCCG CTTCCAGCTA CATGACCGAC 900TACTACCTCT CCACTGCGTT CCAGGCGCTT GACTCCAAGA ACAACTACCT CCGTGTTCAG 960GAGAATGCCC TCACTGGCAC CACGACCGAG ATGGACGATG CCTCCGAGGC CAACATGGAG 1020CTGCTCGTCC AGGTGGGTGA GAACCTCCTG AAGAAGCCCG TCTCCGAAGA CAATCCCGAG 1080ACCTATGAGG AAGCGCTCAA GCGCTTTGCC AAGCTGCTCT CTGATAGGAA GAAACTCCGC 1140GCTAACAAGG CCAGCTACTA ATGA 1164
权利要求书按照条约第19条的修改6.权利要求5的方法，其中所说的结构编码序列包括SEQ IDNO30或SEQ ID NO31。
7.权利要求5的方法，其中所说植物是玉米，而所述结构编码序列是合成的，以提高在单子叶植物中的表达。
8.权利要求7的方法，其中所述结构编码序列包括SEQ ID NO32。
9.一种由权利要求5的方法产生的植物，其中在基因组中包括一种或多种表达B.t.内毒素的基因。
10.一种由权利要求9的植物产生的种子或种子部分。
权利要求
1.一种控制因食植物昆虫引起的植物感染的方法，包括提供有效量的杀虫马铃薯贮存蛋白供所述昆虫摄取。
2.权利要求1的方法，其中所述马铃薯贮存蛋白是由施用于植物后生产所述马铃薯贮存蛋白的植物定殖微生物提供的。
3.权利要求1的方法，其中通过表达掺入在所述植物中的马铃薯贮存蛋白基因而提供所述马铃薯贮存蛋白，所述植物的亲本细胞预先经遗传转化。
4.权利要求3的方法，其中的所述植物是棉花、玉米、番茄或马铃薯。
5.一种生产经遗传工程方法转化的、表达有效杀虫量的马铃薯贮存蛋白之昆虫抗性植物的方法，包括步骤(a)将含下列组分的重组双链DNA分子插入植物细胞的基因组；(i)在植物细胞中引起RNA序列产生的启动子；(ii)编码马铃薯贮存蛋白的结构编码序列；(iii)在所述植物细胞中使多腺苷酸核苷酸加到RNA序列3’末端的3’非转译区，其中所述启动子对于所述结构编码序列来说是异源的，而且其中所述启动子与所述结构编码序列经操作相连，所述结构编码序列与所述非转译区依次相连；(b)得到转化的植物细胞；和(c)从转化的植物细胞再生经遗传工程方法转化的表达有效杀虫量马铃薯贮存蛋白之植物其中所述启动子就所述结构编码序列而言是异源的，而且其中所述植物选自棉花、玉米、番茄和马铃薯。
6.权利要求5的方法，其中所述结构编码序列含有SEQ ID NO30或SEQ ID NO31。
7.权利要求5的方法，其中所述植物是玉米，而所述结构编码序列是合成的，以提高在单子叶植物中的表达。
8.权利要求7的方法，其中所述结构编码序列含有SEQ ID NO32。
9.一种由权利要求5的方法产生的植物。
10.权利要求9的方法，其中在基因组中包括一种或多种表达B.t.内毒素的基因。
11.一种由权利要求9的植物产生的种子或种子部分。
全文摘要
马铃薯贮存蛋白主要通过阻碍幼虫的生长防止其成熟和繁殖来控制昆虫。将编码一种或多种这些蛋白质的基因克隆到载体中以转化植物定殖微生物或植物，由此得到控制昆虫感染的方法。
文档编号A01H5/00GK1119027SQ94191451
公开日1996年3月20日 申请日期1994年3月2日 优先权日1993年3月12日
发明者S·M·布朗, J·T·格林普莱, B·G·埃萨, M·G·詹宁斯, E·B·利怀恩, J·P·佩塞尔 申请人:孟山都公司