Cry1Ea在组合中用于管理抗性秋粘虫昆虫的用图
【专利说明】CryIEa在组合中用于管理抗性秋粘虫昆虫的用途
[0001] 交叉引用
[0002] 本申请要求获得于2012年10月5日提交的美国临时专利申请61/710, 154的利 益。本文通过提述并入其全部公开内容。
[0003] 发明背景
[0004] 人类为粮食和能源用途而种植谷物。人类还种植其它作物，包括大豆和棉花。昆 虫摄食并毁坏植物，从而破坏人类的这些努力。人们每年花费数十亿美元用于控制昆虫害 虫，并额外承受由昆虫造成的数十亿美元的损失。合成有机化学杀虫剂已经成为用于控制 昆虫害虫的首要工具，但是在某些领域，生物杀虫剂，例如从苏云金芽孢杆菌（Bt)获得的 杀虫蛋白，发挥着重要的作用。通过用Bt杀虫蛋白进行转化以产生抗虫植物的能力已经引 发了现代农业革命，并凸显了杀虫蛋白及其基因的重要性和价值。
[0005] 迄今为止，有多种Bt蛋白被用于创建抗虫转基因植物，并且被成功地注册并商业 化。这些包括玉米中的CrylAb,CrylAc,CryIF和Cry3Bb，棉花中的CrylAc和Cry2Ab，和马 铃薯中的Cry3A。
[0006] 表达这些蛋白的商业产品一般表达单一的蛋白质，除了下面的情况：期望2种 蛋白的组合杀虫谱（例如在玉米中组合使用CrylAb和Cry3Bb以提供分别对鳞翅目害 虫和根虫（rootworm)的抗性），或者蛋白质的独立作用使它们可以用作延迟在易感昆虫 群体中发生抗性的有用工具（例如在棉花中组合使用CrylAc和Cry2Ab以提供对烟草 夜蛾（tobaccobudworm)的抗性管理）。另见美国专利申请公开No. 2009/0313717,其 涉及Cry2蛋白加Vip3Aa,CrylF,或CrylA，用于控制谷食夜蛾（Helicoverpazea)或棉 铃虫（armigerain)。W02009/132850 涉及CrylF或CrylA和Vip3Aa，用于控制秋粘虫 (Spodopterafrugiperda)。美国专利申请公开No. 2008/0311096部分涉及CrylAb，用于控 制CrylF抗性ECB。
[0007] 也就是说，抗虫转基因植物的一些品质不但导致这一技术快速而广泛地应用，也 造成了问题，即害虫群体会对这些植物所产生的杀虫蛋白产生抗性。已经建议了多种策 略用于保护基于Bt的昆虫抗性特性的功效，包括采用高剂量的蛋白与避难所植物组合 使用，或者可选择地与不同的毒素组合使用或共同使用（McGaugheyetal. (1998)，"B. t.ResistanceManagement,"NatureBiotechnol. 16:144-146) 〇
[0008] 选择用于昆虫抗性管理（IRM)堆叠（stack)的蛋白毒素需要独立地发挥它们的杀 虫效果，从而使对一种蛋白产生的抗性不会导致对第二种蛋白的抗性（即，蛋白没有交叉 抗性）。例如，如果对"蛋白A"耐受的害虫群体对"蛋白B"敏感，则可以得出结论，即蛋白 A和蛋白B没有交叉抗性，并且两者的组合可有效延迟对单独蛋白A的抗性。
[0009] 当不存在抗性昆虫群体时，可以根据其它假定的与作用机制和交叉抗性潜力相关 的特征进行评估。已经有人提议受体介导的结合在鉴定可能不会显示交叉抗性的杀虫蛋白 方面的用处（vanMellaertetal. 1999)。这种方法中蕴含的对缺少交叉抗性的关键预测 因素是杀虫蛋白在敏感昆虫物种中不会竞争受体。
[0010] 在两种Bt毒素竞争同一受体的情形，如果昆虫中的受体突变导致一种毒素不再 结合该受体从而对该昆虫不再具有杀虫作用，则该昆虫可能也会对第二种毒素（其竞争性 结合同一受体）具有抗性。也就是说，昆虫被称作对两种Bt毒素具有交叉抗性。然而，如 果两种毒素结合两个不同的受体，则可以指示，昆虫不会对这两种毒素同时产生抗性。
[0011] 在官方Bt命名委员会的网址上列出了代表性的Cry毒素（Crickmoreetal.;lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。目前，〃Cry〃蛋白有将近 60 个主要 的族（Cryl-Cry59)，还有其他的Cyt蛋白和VIP蛋白等等。每个数字族中有多个大写字母 亚族，大写字母亚族有小写字母子亚族（例如，Cryl有A-L，而CrylA有a-i)。 发明概要
[0012] 本发明部分涉及令人惊讶的发现，即杀虫蛋白CrylEa不会和 CrylAb,CrylBe,CrylCa,CrylDa,或VIP3Ab竞争结合秋粘虫（FAW;Spodoptera frugiperda)肠细胞膜受体制备物。正如本领域的技术人员借助于本公开会认识到的，产生 彼此不会竞争结合的任何主题蛋白对（包括全长蛋白的杀虫部分）的植物可以延迟或防止 对这些杀虫蛋白中的单独一种产生抗性。
[0013] 因此，本发明部分涉及使用CrylEa蛋白与CrylAb,CrylBe,CrylCa,CrylDa,和/ 或VIP3Ab蛋白的组合。产生CrylEa与至少一种本文所述的其它蛋白质的组合的植物（和 种植有这类植物的田地）包含在本发明的范围之内。
[0014] 本发明还部分地涉及三种（或更多种）毒素的三重堆叠或"金字塔（pyramids) "， 该堆叠中的至少一种蛋白是CrylEa。在一些优选的金字塔实施方案中，选定毒素的组合提 供针对FAW的非交叉抗性作用。一些优选的"三作用位点"金字塔组合包括：主题基础蛋白 对（CrylEa加CrylAb、CrylCa、CrylDa、Vip3Ab或CrylBe)之一，和另一种革巴向FAW的Bt蛋 白。根据本发明，这些特殊的三重堆叠可以有利地并且令人惊讶地提供针对FAW的三个作 用位点。这能够有助于减少或消除对避难田地的需要。
[0015] 附图简述
[0016] 图1显示了125ICrylEa(0.5nM)在来自FAW的BBMV中的百分比特异性结合与由 无标记的同源CrylEa和异源CrylAb所致的竞争的关系。
[0017] 图2显示了125ICrylAb与来自FAW幼虫的BBMV的结合，以及随后被递增浓度的 无标记CrylAb的置换。
[0018] 图3显示了125ICrylEa在来自FAW的BBMV中的百分比特异性结合与由无标记的 同源CrylEa和异源CrylCa所致的竞争的关系。
[0019] 图4显示了结合测定的结果，其中125ICrylEa与FAW幼虫的BBMV结合，随后添加 CrylEa,CrylBe,CrylDa,和VIP3Abl配体。
[0020] 序列简述
[0021] SEQIDNO: 1显示了 1148个氨基酸的CrylEa蛋白（具有CrylAb原毒素节段）的 氨基酸序列。
[0022] SEQIDNO:2显示了全长（1155个氨基酸）CryIAb蛋白的氨基酸序列。
[0023] SEQIDNO: 3显示了1186个氨基酸的CrylBe蛋白（具有CrylAb原毒素节段）的 氨基酸序列。
[0024]SEQIDN0:4显示了1164个氨基酸的CrylCa蛋白（具有CrylAb原毒素节段）的 氨基酸序列。
[0025] SEQIDNO: 5显示了1139个氨基酸的CrylDa蛋白（具有CrylAb原毒素节段）的 氨基酸序列。
[0026] SEQIDNO:6显示了全长Vip3Ab蛋白的氨基酸序列。
[0027] SEQIDN0:7显示了蛋白酶加工的CrylEa蛋白的氨基酸序列。
[0028] SEQIDN0:8显示了蛋白酶加工的CrylAb蛋白的氨基酸序列。
[0029] SEQIDN0:9显示了蛋白酶加工的CrylBe蛋白的氨基酸序列。
[0030] SEQIDNO: 10显示了蛋白酶加工的CrylCa蛋白的氨基酸序列。
[0031] SEQIDNO: 11显示了蛋白酶加工的CrylDa蛋白的氨基酸序列。
[0032] 发明详细说明书
[0033] 本发明部分涉及令人惊讶的发现，即CrylEa具有独特且独立的作用模式，且不与 CrylAb、CrylBe、CrylCa、CrylDa或VIP3Abl竞争秋粘虫（FAW;Spodopterafrugiperda) 的肠道中的结合位点。因此，CrylEa蛋白可以与CrylAb、CrylBe、CrylCa、CrylDa和/或 VIP3Abl蛋白在转基因玉米（和其它植物；例如棉花）中组合使用，以延迟或防止FAW对这 些蛋白个别产生抗性。本主题蛋白与本文公开的其它Cry或VIP蛋白一起使用，能够有效 保护植物（例如玉米植物和/或大豆植物）免于被Cry抗性秋粘虫破坏。也就是说，使用 本发明可以保护玉米和其它经济学上重要的植物物种免于遭受可能对单一Cry或VIP蛋白 产生了抗性的秋粘虫群体所造成的破坏和产量损失。
[0034] 因此，本发明教导了一种昆虫抗性管理（IRM)堆叠，其包括CrylEa和CrylAb、 CrylBe、CrylCa、CrylDa和/或VIP3Abl，用于防止或减轻FAW对这些蛋白中的某一种单独 使用时产生的抗性。
[0035] 本发明包括用于控制FAW的组合物，其中该组合物包括CryIEa杀虫蛋白和 〇7认13、(：巧186、(：巧10&、(：巧10 &和/或￥1?34131杀虫蛋白。主题组合物包括植物和植物细 胞。
[0036] 本发明进一步包括被转化而产生CrylEa杀虫蛋白与CrylAb、CrylBe、CrylCa、 CrylDa或VIP3Abl杀虫蛋白的宿主，其中所述宿主是微生物或植物细胞。主题多核苷酸优 选地处于遗传构建体中，在非苏云金芽孢杆菌的启动子的控制之下。术语"分离的"和"异 源的"意味着多核苷酸或DNA分子处于不同于其天然环境的状态一涉及人的操作。主题多 核苷酸可包括用于提高在植物中表达的密码子使用。
[0037] 此外，本发明包括控制FAW的方法，其中该方法包括使所述FAW或所述FAW的环境 与有效量的组合物接触，该组合物含有本发明的包含CrylEa核心毒素的蛋白对。
[0038] 本发明的一个实施方案包括含有编码本发明的CrylEa杀虫蛋白对的植物可表达 基因的植物（可以包括玉米、大豆和棉花），和此类植物的种子。
[0039] 本发明进一步的实施方案包括这样的植物，其中编码本发明CrylEa杀虫蛋白对 的植物可表达基因已被基因渗入到该植物中，和此类植物的种子。
[0040] 如实施例中所述，使用放射性标记的CrylEa蛋白和/或放射性标记的CrylAb 蛋白的竞争性受体结合研宄显示，CrylAb，CrylBe，CrylCa，CrylDa，和VIP3Abl蛋白不与 CrylEa竞争结合CrylEa所结合的FAW中肠刷状缘膜囊泡（midgutbrushbordermembrane vesicle)。这些结果还表明，CrylEa与这些其它蛋白质的组合能够作为一种有效的手段 来减轻FAW群体对这些蛋白产生抗性。因此，部分地根据本文所述的数据，认为CrylEa与CrylAb,CrylCa,CrylBe,CrylDa,和/或VIP3Abl蛋白的共产生（堆叠）能够用于产生高剂 量的IRM堆叠，用于控制/抑制/杀死FAW。
[0041] 其它的蛋白质可以添加到主题对中。例如，本发明还部分涉及三种（或更多种） 毒素的三重堆叠或"金字塔"，其中一个主题对是基础对。在一些优选的金字塔实施方案中， 选定的毒素对FAW具有三种不同的作用模式。一些优选的"三作用模式"金字塔组合包括 主题基础蛋白对加上第三种用于靶向FAW的蛋白。"不同作用位点"的含义是，任一种给定 蛋白均不会与其它产生交叉抗性。根据本主题发明，这些特定的三重堆叠可有利地并且令 人惊讶地提供针对FAW的三种作用位点。这能够帮助减少或消除对避难田地的需要。
[0042] 因此，一个部署选项是将主题蛋白对与第三种毒素/基因组合使用，并使用这种 三重堆叠减轻FAW对这些毒素的任一种产生抗性。因此，本发明还部分涉及三种（或更多 种）毒素的三重堆叠或"金字塔"。在一些优选的金字塔实施方案中，选定的毒素具有针对 FAW的三种不同作用位点。
[0043] 在本发明的各种部署选项中，包括在FAW会产生抗性群体的作物种植区域内使用 主题蛋白中的两种、三种或更多种蛋白。
[0044] 产生任一种主题蛋白组合的植物（和种植有这类植物的田地）包含在本发明的范 围内。也可以添加额外的毒素/基因，但是上面讨论的特殊堆叠可有利地并且令人惊讶地 提供针对FAW的多个作用位点。这可有助于减少或消除对避难田地的需要。因此，超过10 英亩的如此种植的田地包含在本发明的范围内。
[0045]GENBANK也可以用于获得本文公开或提到的任何基因和蛋白的序列。相关序列也 可以在专利中获得。代表性的Cry毒素在官方Bt命名委员会的网