例说明了用于实践本发明的操作过程。这些实施例不应当认为是限制 性的。除非另外指出，否则所有百分比是依照重量，并且所有溶剂混合比是依照体积。所有 温度为摄氏度。 实施例
[0105] 实施例I-mIfe：记CrylEa和CrylAb蛋白
[0106]Cry毒素的碘化用胰蛋白酶切割全长CrylEa和CrylAb蛋白（SEQIDNO: 1和2) 产生激活的杀虫性形式（用SEQIDNO: 7和8表示）。纯化的截短Cry毒素用Iodo-Bead或 Iodo-gen(Pierce)碘化。简而言之，将两个Iodo-Bead用500y1磷酸盐缓冲盐水PBS(20mM 磷酸钠，0.15MNaCl，pH7. 5)清洗2次，并置于铅屏后的1.5ml离心管中。向其中添加 100yIPBS。在层流罩（hood)中，使用适当的放射性操作技术，向含有Iodo-Bead的PBS溶 液中添加〇.5mCiNa125I(17. 4Ci/mg，Lot0114,Amersham)。使组分在室温下反应5分钟，然 后向溶液中添加2-25yg高纯的截短Cry蛋白，并使之再反应3-5分钟。通过从Iodo-Bead 除去溶液而终止反应，并将其施加到0. 5ml用PBS平衡的脱盐Zeba旋转柱（InVitrogen) 中。洗涤Iodo-Bead两次，每次用IOylPBS并将清洗液施加到脱盐柱中。通过在1,000X g将脱盐柱离心2min使放射性溶液洗脱通过脱盐柱。
[0107] 碘化Cry蛋白的放射性纯度通过SDS-PAGE、磷屏成像（phosphorimaging)和y 计数加以确定。简而言之，通过SDS-PAGE分离2yl放射性蛋白。分离后，用BioRad凝胶 干燥设备按照制造商的使用说明干燥凝胶。通过将干燥的凝胶包裹在Mylar底片（12ym 厚）中，并在MolecularDynamics存储磷光屏（storagephosphorscreen) (35cmX43cm) 下曝光I小时进行成像。平板用MolecularDynamicsStorm820磷屏成像仪显色，用 ImageQuant?软件进行图像分析。使用剃须刀片从凝胶上切下放射性条带和条带上下紧邻 的区域，并在Y计数器中计数。仅在Cry蛋白条带和这些条带的下方区域内检测到了放射 活性。在条带上方没有检测到放射性，表明所有放射性污染物均由小于截短的Cry蛋白的 蛋白组分组成。这些组分最有可能代表了降解产物。
[0108] 实施例2-BBMV制各方案
[0109] 可溶性BBMV的制备和分级末龄秋粘虫幼虫禁食过夜后，在晨间于冰上冷却15分 钟后解剖。从体腔移除中肠组织，留下附着在外皮上的后肠（hindgut)。将中肠置于9X体 积的冰冷匀浆缓冲液中（300mM甘露糖醇，5mMEGTA，17mMTris碱，pH7. 5)，匀浆缓冲液 补充有按照供应商推荐稀释的蛋白酶抑制剂鸡尾酒YSigmaP-2714)。将组织用玻璃组织 勾楽器勾楽_ 15个冲程（stroke)。通过Wolfersberger(1993)的1\%012沉淀法制备BBMV。 简而言之，将溶于300mM甘露醇中的24mM1%(：12溶液与中肠匀浆物等体积混合，搅拌5分 钟，并在冰上放置15分钟。将溶液以2500Xg在4°C离心15分钟。保留上清液，并将沉淀 悬浮在原始体积的〇. 5X稀释的匀浆缓冲液中，并再次离心。将两个上清液合并，在4°C下 27, 000Xg离心30分钟，以形成BBMV级分。将沉淀悬浮到IOml匀浆缓冲液中，补充蛋白酶 抑制物，并在4°C再次以27,OOOxg离心30分钟，以清洗BBMV。将所得沉淀悬浮在BBMV保 存缓冲液中（IOmMffiPES，130mMKC1，10%甘油，pH7. 4)，浓度为大约3mg/ml蛋白。蛋白 浓度用Bradford法（1976)确定，以牛血清白蛋白（BSA)作为标准。在冷冻样品之前，使用 Sigma测定系统按照制造商的使用说明进行碱性磷酸酶测定。BBMV级分中该标志物酶的比 活性通常比中肠匀浆级分中的比活性增加7倍。将BBMV等分成250y1的样品，在液氮中 快速冷冻，并储存在-80 °C。
[0110] 实施例3-测量1Crv蛋白与BBMV蛋白结合的方法
[0111] 125ICry蛋白与BBMV的结合为了确定在结合测定中使用的BBMV蛋白的最佳量， 生成了饱和曲线。125I放射性标记的Cry蛋白（0. 5nM)与不同量的BBMV蛋白在28°C温育1 小时，BBMV蛋白量的范围是在结合缓冲液（8mMNaHPO4, 2mMKH2PO4, 150mMNaCl, 0. 1%牛血 清白蛋白，pH7. 4)中0-500yg/ml。总体积是0. 5ml。通过从I. 5ml离心管中一式三份取 样150y1反应混合物到500y1离心管中，并在室温下将样品14,OOOxg离心6分钟，将结 合的125ICry蛋白与未结合者分离。轻柔除去上清液，沉淀用冰冷的结合缓冲液轻柔冲洗 3次。将含有沉淀的离心管的底部切下，并置于13X75-mm玻璃培养管中。将各样品在Y 计数器中分别计数5分钟。将样品中含有的计数减去背景计数（没有任何蛋白的计数），并 对BBMV蛋白浓度作图。待使用的最佳蛋白量被确定为0.15mg/mlBBMV蛋白。 1 鸡尾酒组分的终浓度(以IiM计)是AEBSF(500)，EDTA(250mM)，抑氨肽酶B(Bestatin) (32),E-64 (0.35), 亮肽酶素(Leupeptin) (0.25)，和抑肽酶(Aprotinin) (0.075).
[0112] 为了确定结合动力学，生成了饱和曲线。简而言之，将BBMV(150yg/ml)与递增浓 度（范围是0.Ol-IOnM)的125ICry毒素在28°C温育1小时。通过如上所述地从每个浓度 一式三份取样150yl，对样品进行离心并计数，确定总结合。用相同的方式确定非特异性 结合，只是向反应混合物中添加1，OOOnM同源的胰蛋白酶处理过的非放射性Cry毒素（以 SEQIDN0:7-ll和未经胰蛋白酶处理的SEQIDN0:6为代表）以饱和所有的非特异性受体 结合位点。特异性结合作为总结和非特异性结合之间的差值计算。
[0113] 同源和异源竞争结合测定使用150μg/mlBBMV蛋白和0.5nM125I放射性标记的 Cry蛋白来进行。添加到反应混合物中的竞争性非放射性标记的Cry毒素的浓度范围是 0. 045-1，OOOnM，并且与放射性配体同时添加，以确保真实的结合竞争。温育在28°C进行1 小时，如上文所述地测量与其受体毒素结合的125ICry蛋白的量，并减去非特异性结合。在 不存在任何竞争配体的条件下确定100%总结合。将结果在半对数图上以百分比总特异性 结合与所添加的竞争性配体的浓度的关系作图。
[0114] 实施例4-结果总结
[0115] 图1显示：125I CrylEa (0. 5nM)在来自FAW的BBMV中的百分比特异性结合与由无 标记的同源CrylEa(鲁）和异源CrylAb所致的竞争（)的关系。CrylEa所致的同源竞 争的置换曲线产生这样的曲线，其显示当非标记的CrylEa为大约InM时，50%的放射性配 体发生置换。在测试的任何浓度下（最高达l，〇〇〇nM，或者在测定所用125I CrylEa浓度的 2000倍），CrylAb均不置换125I CrylEa的特异性结合。
[0116] 图2显示了125I CrylAb与来自FAW幼虫的BBMV的结合，以及随后被递增浓度的无 标记CrylAb的替换。在大约0. 3NM的浓度，未标记的CrylAb置换了50%的放射性CrylAb 的结合。I CrylAb与FAW BBMV的结合没有被CrylEa置换。因此，这两种Cry毒素结合于 FAW昆虫肠道中的不同位点。
[0117] 图3显示了125I CrylEa在来自FAW的BBMV中的百分比特异性结合与由无标记的 同源CrylEa(鲁）和异源CrylCa所致的竞争（▲)的关系。CrylEa所致的同源竞争的置换 曲线产生这样的曲线，其显示在大约InM的非标记CrylEa的存在下，放射性配体发生50% 置换。CrylCa不能置换125I CrylEa的结合。
[0118] 图4显示了结合测试的结果，其中令125ICrylEa与来自FAW幼虫的BBMV结合，随 后添加CrylEa、CrylBe、CrylDa和VIP3Abl配体。CrylBe、CrylDa和VIP3Abl不能置换125I CrylEa的结合，但是CrylDa在1，OOOnM的浓度下，或者在测定所用125ICrylEa浓度的2000 倍的浓度下，导致大约40%的置换。
[0119] 参考文献列表
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