站上列出（Crickmoreet al. ;lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/) 〇 目前〃Cry〃蛋白有大约 70 个主 要的族，还有其他的VIP蛋白等等。
[0046] 本文所述蛋白的组合可用于控制鳞翅目害虫。成年鳞翅目昆虫，例如蝴蝶和飞蛾， 主要食用花蜜并且是授粉的重要实施者。几乎所有的鳞翅目幼虫，即毛虫，均以植物为食， 许多是严重的害虫。毛虫在植物叶片上面或内部或者在根或茎上取食，剥夺植物营养并经 常破坏植物的物理支撑结构。此外，毛虫以水果、纤维和储存的粮食和面粉为食，导致这些 产品无法出售，或严重削弱其价值。如本文所使用的，"鳞翅目害虫"是指害虫的各个生命阶 段，包括幼虫阶段。
[0047] 本发明的一些嵌合蛋白包含完整Bt蛋白毒素的完整N端核心毒素区，并且，在核 心毒素部分末端之后的某个位置，这些蛋白具有向异源原毒素序列的过渡。Bt蛋白毒素的 N-末端杀虫活性毒素部分被称作"核心"毒素。位于核心毒素C端一侧的部分被称作"原 毒素"节段或部分。核心毒素节段向异源原毒素节段的过渡可发生于核心毒素/原毒素接 点附近，或者，天然原毒素的一部分可以被保留，而向异源原毒素部分的过渡发生在下游。
[0048] 作为一个实例，本发明的一种嵌合蛋白是CrylEa的完整核心毒素部分（大约是前 600个氨基酸）和/或异源原毒素（直到C端为止的其余氨基酸）。在一个优选实施方案 中，嵌合蛋白的包含原毒素的部分源自CrylAb毒素。除了Vip3Ab之外，所有根据本发明使 用的蛋白质均具有相似的全长和核心毒素大小和结构。
[0049] 本领域的技术人员将意识到，Bt蛋白毒素，即使在一个特定的类别如CrylEa内， 长度也有一定程度的变化，并且从核心毒素到原毒素的精确过渡位置也会改变。典型地，例 如，CrylEa蛋白的长度是大约1150至大约1200个氨基酸。核心毒素部分向原毒素部分的 过渡通常发生在毒素全长的大约50%至大约60%。本发明的嵌合蛋白将包括该N末端核心 毒素区域的全部范围。因此，所述嵌合蛋白将包括CRYlBt毒素蛋白全长的至少大约50%。 这通常会是至少大约590个氨基酸。关于原毒素部分，CrylAb原毒素部分的全部范围从核 心毒素部分的末端延伸到该分子的C末端。
[0050]基因和毒素根据本发明使用的基因和毒素不仅包括所公开的全长序列，还包括 这些序列的片段、变体、突变体和融合蛋白的保留了本文中具体举例的核心毒素的特征性 杀虫活性的片段。如本文所使用的，术语基因的"变体"或"变异"是指编码相同毒素或编 码具有杀虫活性的等同毒素的核苷酸序列。如本文所使用的，术语"等同毒素"是指具有与 要求保护的毒素相同或基本相同的对目标害虫的生物活性的毒素。
[0051]如本文所使用的，边界（boundaries)代表大约 95 % (CrylEa)，78 % (CrylE)， 和 45 % (Cryl)序列同一性，见"RevisionoftheNomenclaturefortheBacillus thuringiensisPesticidalCrystalProteins, "N.Crickmore,D.R.Zeigler,J. Feitelson,E.Schnepf,J.VanRie,D.Lereclus,J.Baum,和D.H.Dean.Microbiologyand MolecularBiologyReviews(1998)Vol62:807-813。这些截止点也可以仅适用于核心毒 素。
[0052] 本发明的技术人员会意识到，编码活性毒素的基因可以通过若干手段鉴定和获 得。本文所列举的具体基因或基因部分可以从保藏在培养物保藏机构的分离物中获得。这 些基因，或这些基因的部分或变体，也可以通过合成手段构建，例如使用基因合成仪。基因 的变异可以使用标准的点突变制造技术容易地构建。另外，这些基因的片段可以使用市售 的核酸外切酶或核酸内切酶根据标准程序加以制备。例如，可以使用酶（如Bal31)或定点 诱变，系统性地从这些基因的末端切下核苷酸。编码活性片段的基因也可以使用多种限制 性内切酶获得。可以用蛋白酶来直接获得这些蛋白毒素的活性片段。
[0053] 保留示例毒素的杀虫活性的片段和等同物在本发明的范围内。此外，由于遗传密 码子的冗余性，有许多不同的DNA序列能够编码本文公开的氨基酸序列。创建这些编码相 同或基本上相同毒素的替代DNA序列完全在本领域的技术人员的能力范围之内。这些变体 DNA序列在本发明的范围内。如本文所使用的，"基本上相同的"序列是指具有不会显著影 响杀虫活性的氨基酸取代、缺失、添加或插入的序列。基因的编码保留杀虫活性的蛋白质的 片段也包含在本定义内。
[0054] 另一种用于鉴定编码可根据本发明使用的毒素的基因或基因部分的方法是通过 使用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。这些序列可以通过合适的标记物 被检测，或者可以根据国际专利No.W093/16094所述制成具有固有荧光。如本领域众所周 知的，如果探针分子和核酸样品通过在两个分子之间形成强键而杂交，则可以合理推定探 针和样品具有相当的同源性。优选地，杂交在严格条件下通过本领域众所周知的技术实 施，这样的技术在例如Keller,G.H.，M.M.Manak(1987)DNAProbes,StocktonPress,New York，N.Y.，169-170页中有描述。盐浓度与温度的组合的一些实例如下（以严格度增大排 序）：室温，2XSSPE或SSC;42°CIXSSPE或SSC;42°C0.1XSSPE或SSC;65°C0.1XSSPE 或SSC。探针的检测提供了一种按照已知的方式确定杂交是否发生的手段。这种探针分析 提供了一种快速的鉴定本发明的毒素编码基因的方法。用作根据本发明的探针的核苷酸片 段可以使用DNA合成仪和标准程序加以合成。这些核苷酸序列还可以用作PCR引物，用于 扩增本发明的基因。
[0055]变体毒素本发明的某些毒素在本文中已经有具体举例。因为这些毒素仅仅是本 发明毒素的举例，因此容易想到的是，本发明包括具有与例示的毒素相同或相似的杀虫活 性的变体或等同毒素（和编码等同毒素的核苷酸序列）。等同毒素会与例示毒素具有氨基 酸同源性。这种氨基酸同源性通常大于75%，优选地大于90%，最优选地大于95%。氨基 酸同源性在毒素中负责生物活性、或参与决定最终负责生物活性的三维构象的关键区域内 是最高的。关于这一点，如果某些氨基酸取代位于对于活性而言非关键的区域内，或者是不 会影响分子三维构象的保守氨基酸取代，则这些取代是可以接受的，并且预期会发生。例 如，氨基酸可以归于如下的类型：非极性、不带电荷的极性、碱性和酸性。保守取代，即一个 类型的氨基酸被相同类型的另一种氨基酸代替，通常在本发明的范围内，只要该取代没有 实质性改变化合物的生物活性。下面列出了属于每个类型的氨基酸的实例。
[0056]
[0057] 在一些情况下，也可以进行非保守的取代。关键因素是这些取代必须不会显著降 低毒素的生物活性。
[0058]重组宿主编码本发明毒素的基因能够被引入到多种多样的不同微生物或植物宿 主中。毒素基因的表达直接或间接地导致杀虫剂在细胞内产生并保持。可利用接合转移或 重组转移来创建表达本发明两种毒素的Bt株。也可以用这些毒素基因中的一种或两种转 化其它宿主生物体，然后用来实现协同效果。使用合适的微生物宿主，例如假单胞菌，可以 将微生物施加到害虫的地域，在那里它们将繁殖并被摄食。结果是害虫得到控制。或者，可 以在能够延长毒素活性或稳定化细胞的条件下处理携带毒素基因的微生物。然后可以将经 过处理的细胞，其保留毒素活性，施加到目标害虫的环境中。
[0059] 当Bt毒素基因通过合适的载体引入到微生物宿主中，并且将所述宿主以存活状 态施加到环境时，使用某些特定的宿主微生物是关键的。选择已知占据一种或多种感兴趣 玉米的"植物圈"（叶面，叶围，根际和/或根面）的微生物宿主。选择这些微生物是为了能 够成功地在特定环境（作物和其它昆虫栖息地）中与野生型微生物竞争，为表达多肽杀虫 剂的基因的稳定保持和表达提供条件，并且理想地，为更好地保护杀虫剂免于环境降解和 失活提供条件。
[0060] 已知有大量微生物栖息在许多种重要农作物的叶面（植物叶的表面）和/或根 际（植物根系周围的土壤）。这些微生物包括细菌、藻类和真菌。特别感兴趣的是微生物， 如细菌，例如假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、 根瘤菌属、红假单胞菌属、嗜甲基菌属（Methylophilius)、土壤杆菌属（Agrobactenum)、 醋酸杆菌属（Acetobacter)、乳杆菌属（Lactobacillus)、节杆菌属（Arthrobacter)、 固氮菌属（Azotobacter)、明串球菌属（Leuconostoc)和产喊菌属（Alcaligenes);真 菌，特别是酵母，例如酵母属（Saccharomyces)、隐球菌属（Cryptococcus)、克鲁维酵 母属（Kluyveromyces)、掷抱酵母属（Sporobolomyces)、红酵母属（Rhodotorula)和 短梗霉属（Aureobasidium)。特别感兴趣的是如下的植物圈细菌物种，如丁香假单胞 菌（PseudomonasSyringae)、突光假单胞菌（PseudomonasFluorescens)、粘质沙雷 氏菌（SerratiaMarcescens)、木醋酸杆菌（AcetobacterXylinum)、根癌土壤杆菌 (AgrobacteriumTumefaciens)、浑球红假单胞菌（RhodopseudomonasSpheroides)、野 油菜黄单胞菌（XanthomonasCampestris)、苜蓿根瘤菌（RhizobiumMelioti)、真养产 喊菌（AlcaligenesEntrophus)和维涅兰德固氮菌（AzotobacterVinlandii);和植物 圈酵母物种，如深红酵母（Rhodotorularubra)、粘红酵母（R.glutinis)、海洋红酵母 (R.marina)、澄红酵母（R.aurantiaca)、浅白隐球菌（Cryptococcusalbidus)、流散隐球 菌（C.diffIuens)、罗伦特隐球菌（C.Iaurentii)、罗斯酵母（Saccharomycesrosei)、有 抱酵母（S.pretoriensis)、酿酒酵母（S.cerevisiae)、玫瑰掷抱酵母（Sporobolomyces roseus)、香味掷抱酵母（S.odorus)、维罗纳克鲁维酵母（Kluyveromycesveronae)和 出芽短梗霉（Aureobasidiumpullulans)。特别感兴趣的是产色的微生物（pigmented microorganisms)〇
[0061] 有多种多样的方法可用于将编码毒素的Bt基因在允许所述基因稳定保持和表达 的条件下引入到微生物宿主中。这些方法是本领域技术人员众所周知的，并且例如在美国 专利No. 5, 135, 867中描述，其通过提述并入本文。
[0062]细朐处理可以对表达Bt毒素的苏云金芽孢杆菌或重组细胞进行处理以延长毒 素活性和稳定化细胞。所形成的杀虫微囊将Bt毒素包含于已被稳定化的细胞结构内，当微 囊被施于目标害虫的环境时，该细胞结构会保护该毒素。合适的宿主细胞可以包括原核生 物或真核生物，通常限于那些不会产生对高等生物如哺乳动物有毒的物质的细胞。然而，当 毒性物质不稳定或者施加水平足够低以至可以避免对哺乳动物宿主的任何可能的毒性时， 也可以使用会产生对高等生物有毒的物质的生物。作为宿主，特别感兴趣的是原核生物和 低等真核生物，如真菌。
[0063] 在处理时，细胞通常是完整的并且基本上处于可增殖的形式，而不是处于孢子形 式，尽管在一些情况下可以采用孢子。
[0064] 微生物细胞（例如含有Bt毒素基因的微生物）的处理可以通过化学或物理手段 进行，或者通过化学和/或物理手段的组合进行，只要该技术不会有害地影响毒素的性质 并且不会减小细胞保护毒素的能力即可。化学试剂的实例是卤化剂，特别是原子序号17-80 的卤素。更特别地，碘可以在温和的条件下使用足够长的时间以获得期望的结果。其它合 适的技术包括醛如戍二醛处理；抗感染剂处理，如氯化苯甲径按（Zephiranchloride)和氯 化十六烧吡啶（CetylpyridiniumChloride);醇如异丙醇和乙醇处理；多种组织固定剂处 理，如鲁哥氏碘液（Lugoliodine)、布安氏固定剂（Bouin'sfixative)、多种酸和海利氏 固定剂（Helly'sfixative)(参见Humason，GretchenL. ,AnimalTissueTechniques,ff. H.FreemanandCompany, 1967);或保留和延长在将细胞施加于宿主环境时细胞内产生的 毒素的活性的物理（加热）和化学剂的组合。物理手段的实例为短波辐射，如Y-辐射和