专利名称：防腐液的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于人和动物的器官和组织或其部分的防腐液，它含有葡聚糖、葡萄糖、电解质和缓冲剂。
在冠状动脉外科(每年每一百万居民中约800例手术)和外周血管外科(每年每一百万居民中约100例手术)中，大部分欧洲诊所利用所谓的生理盐水溶液(0.9％NaCl)作为用于从血管移植物中洗出血液并在将血管移植物插入新部位之前将其贮藏的溶液。在冠状动脉外科中，通常利用大隐静脉(vena sapena magna)，即从足内侧内踝之上延伸、沿小腿内侧和股骨直到腹股沟的表面静脉，它在腹股沟处与股静脉连接。在冠状动脉手术中，首先是切除一条腿的大隐静脉，同时打开胸骨并采取初步措施连到人工心肺机上。切除大隐静脉之后用上述类型的盐水溶液冲洗该血管，一方面是为了从该血管内洗出所有血液，另一方面是确保人们没有遗忘将静脉的所有支脉结扎，即为防止渗漏用线将支脉结扎。然后，将切除的静脉置于含有室温(即20-25℃)盐水溶液的盘中。
然后连接人工心肺机，对心脏实施心麻痹。从盘中的静脉切下约15-20cm长的区段，以所谓的主动脉冠状静脉旁路的形式缝到患病的冠状动脉上。在缝好所有血管移植物并且血液重新经这些血管移植物循环之前，可能已经经历了长达2小时。对有一个或两个心脏瓣膜待插入的患者而言，这段时间可以更长。一些外科医师使用患者自己的血液，而不是在缝合之前在盐水溶液中贮藏该血管移植物。接着，从患者抽出血液并置于盘中。然后在把移植物缝到心脏上之前让其在该血液中放置。开始时温度为37℃，但迅速降至室温。据信，由于血液是血管终生接触的介质，它必然是血管移植物的理想贮藏介质。
心外科中，冠状动脉外科占成人手术的70％左右。通过研究动物实验公知的是，在内皮被破坏的情况下使用血管移植物时，发生所谓的内膜增生并且在一段时间后移植物被闭塞(血管腔越来越小，最终完全阻止了血液流动)。在临床随访研究中已发现，在冠状动脉手术5年后大约30-50％的静脉移植物已被闭塞，用组织学方法对其进行研究时会发现显著的内膜增生。这适合于已在上述生理盐水溶液中漂洗和贮藏过的静脉移植物。
本申请人的研究小组已对血管的短期和长期防腐进行过深入研究。对血管的短期防腐(即，最多2小时防腐)而言，已发现生理盐水溶液对血管内皮有毒。如果盐水溶液通过例如大鼠的髂动脉(arteria iliaka)进行冲洗，那么大约一个月后就会在该血管中发现内膜增生。另一方面，如果用血清进行相应的漂洗，就不会发现内膜增生。因此，用生理盐水溶液作防腐液对血管不利。尽管如此，由于没有更好的替代品，全世界大多数胸外科中心还继续临床使用生理盐水溶液。
本申请人的研究小组也已证实，血液也不是令人满意的防腐液。贮藏在盘中、没有充氧的室温血液对血管内皮极其有毒并且在相当程度上抑制内皮功能。这似乎是一种自相矛盾，但由于血液是一种只在流动和肺中连续充氧时才具有其正常功能的器官，所以它不能以正常方式起作用。与所有其它血液一样，脱氧、不流动的血液含有白细胞、细细胞和血小板。众所周知的是，低氧血(低氧浓度)情形中白细胞被激活，随后产生毒性物质。本申请人的研究小组已经证实，Ringer’s乳酸盐、Kreb’s溶液和LPD(“低钾葡聚糖”)溶液在冷藏温度(4℃)和室温(20℃)都能保存血管达2小时。然而，这三种溶液中只有LPD溶液含有胶态渗透活性物质，即葡聚糖40(一种平均分子量约为40000道尔顿的大糖分子)。胶体渗透压就是“吸引压力”，它是由不能通过毛细管膜的蛋白分子和其它更大的分子施加的以便保持毛细管中的流体。因此，将在下文中作详细限定的这种LPD溶液具有稍高于正常血浆的胶体渗透压。在一系列研究中，其它科学家已证实，葡聚糖40有利于通过覆盖内皮而防止血栓形成，这意味着被激活的白细胞不能附着其受体从而侵袭并进而破坏血管。在血管的长期防腐中，即24小时以上，例如36小时，Ringer’s乳酸盐或Kreb’s溶液不能以足够令人满意的方式对血管起作用。不过，LPD溶液能产生更好的效果。
在目前的临床器官移植中，有两种器官防腐液是普遍使用的，即所谓的University of Wisconsin溶液和Euro-Collins溶液。这些溶液是所谓的胞内防腐液，即它们具有高的钾含量和低的钠含量。该组合物的目的在于，细胞应能在胞内环境中“游泳”。本申请人的研究小组在深入研究之后已经证实，就血管而言，这些胞内溶液的高钾含量引起猛烈的血管痉挛。因此，贮藏血管移植物时采用胞内电解质组合物防腐液是不合逻辑的。
在心外科中，所谓同种移植(即从一个个体到同种的另一个个体)的不断增长的应用最近已变得普遍。这意味着，从刚死亡的个体切除血管(大多数情况下是在法医学研究所)，短期贮藏后将这些血管冷冻保存，即它们于低温下贮藏在液氮中。在心脏移植中，在许多情况下还可能利用包括心脏瓣膜装置在内的主动脉根，任何情况下它们都要被切除和丢弃。目前是把这种制品置于盐水溶液中直到次日对其进行冷冻保存处理时为止。
在整形外科中，显微外科操作的程度提高，其中，包括血管在内的器官部分被从身体的一个部位切除移至另一部位，即自身移植。在这部分手术中也需要用于所涉及器官的血管系统的令人满意的防腐液，这样就当器官被插入时，血液流动开始后就能建立完美的血液循环。
最近已经发现的另一个问题是，在移植的器官或血管的再灌注中，移植后几秒钟至几分钟内由于有害的自由氧基可能引起对细胞的伤害。
总之，目前还没有用于人和动物器官和组织或其部分、特别是用于血管的十分令人满意的防腐液，所述器官和组织或其部分要因其它一些目的而移植或贮藏，例如用于医学研究。因此，在这些领域中普遍迫切需要这样一种防腐液，它没有现有防腐液的缺点，它能在更大程度上、在更长时间内保持器官、组织或其部分的初始结构和功能。
本发明的目的是克服用于人和动物的器官和组织或其部分的现有防腐液的上述缺点。
这个目的通过提供上述类型的防腐液而实现，该防腐液还含有钙和硝酸甘油。其它特征在所附权利要求书中描述。
本发明还涉及该防腐液的应用，涉及人和动物器官和组织或其部分在防腐液中的防腐方法。
图1表示含钙和硝酸甘油的组合的防腐液与单独含这些成分的防腐液之间的对比试验。
图2表示钙对血管中肌肉细胞和内皮细胞的影响。
本申请人的研究小组经过深入研究和实验已得到令人惊奇、似乎自相矛盾的结果钙在首先是血管的长期防腐中具有先前未表现出的潜在功能，能保持血管中的平滑肌功能达36小时。
长期以来，认为钙不应存在于用于移植物的防腐液中。其原因在于，在局部缺血(即组织中局部缺氧)情况下，胞内钙浓度上升，所以人们不想进一步添加钙来使细胞获得钙。然而，本申请人的研究小组已进行过对比研究，研究表明，在无钙溶液中长期保存血管对所涉及的血管有破坏。为保持血管内皮的完整性，该溶液中除其它物质外有必要存在钙。血管内皮含有结合到细胞膜中的蛋白质上的烃链，这些物质构成所谓的糖萼层。这是一薄层粘液物质(由糖组成)，据信，它包住细胞膜、对该细胞的免疫力的特性至关重要并使细胞壁成为可渗透的。这些烃链通过钙(除其它物质外)结合在一起。如果血管内皮细胞长期接触无钙溶液，假设就会发生重要的糖萼层的破裂，内皮功能因而不会是完美的。通过对已经在有钙和无钙的防腐液中贮藏的血管中细胞膜的电镜研究，已获得这些发现的证据。
本申请人的研究小组还发现，通过向防腐液中添加硝酸甘油，能够以惊人的方式保持血管中的内皮功能。硝酸甘油也许构成氧化氮(NO)的基质，即内皮产生的、构成所谓内皮细胞依赖性舒血管因子(EDRF)之一的内源性物质。
在一个对比实验中(采用分别含钙和硝酸甘油的LPD溶液，以及含钙和硝酸甘油两者的LDP溶液)已经发现，溶液中存在硝酸甘油的情况下可获得EDRF功能的更好的保持。
如
图1所示，就收缩作用而言，用于贮藏大鼠主动脉的移植溶液中钙和硝酸甘油的组合比溶液中不含钙或硝酸甘油的情况下得到更好的结果。在本发明的防腐液中不存在硝酸甘油的情况下采用钙，本身就产生比采用现有技术防腐液所能获得的更好的效果。与硝酸甘油组合，可获得更为良好的效果。即使钙和硝酸甘油组合的效果并不显著高于无硝酸甘油情况下钙的效果，本领域中效果的每一改进对后继的移植尽可能成功而言都是非常重要的。
图2中表示有关钙的令人满意、意外效果的形态图形。这些图形表示，有钙或无钙时长期贮藏过的血管的平滑肌细胞(一方面)和内皮细胞(另一方面)。无钙防腐情形中(a平滑肌细胞；c内皮细胞)，在两类细胞中都表现出核和胞质的强裂膨胀。有钙防腐情形中(b平滑肌细胞；c内皮细胞)，表现出细胞的正常结构。
同样已经发现，硝酸甘油对植入后血管或器官的再灌注有重要作用。通过形成自由氧基，植入后几秒钟至一或两分钟内实际上可以引起细胞损伤。硝酸甘油对这些氧基具有所谓的消除效果而且必须直接存在于植入手术中以减少这一问题。通过在本发明防腐液中一同包括硝酸甘油和钙可以满足这一要求，该防腐液中这还对内皮施加有利的组合效应。
本专利申请全文中使用的表述“人和动物的器官和组织或其部分”在其最广的含义上包括已从动物和人获得、优选可以通过自身移植、同系移植、同种异体移植和异种移植(例如，猪和猴的器官移植给人)移植给人和动物的任何类型的器官和组织。本发明的防腐液特别适合于血管或其部分和肺。因而术语“血管”是指静脉、动脉和毛细管，包括带有瓣膜装置的主动脉根和带有瓣膜装置的肺根(所谓同种移植)。尚未进行过对血管、肺和肾之外的身体部位防腐的深入研究，但目前还没有资料表明这类器官会受本发明防腐液的有害影响，不过，对心脏防腐来说，该防腐液中特定浓度的电解质是必需的，这从下文来看是显而易见的。
本专利申请全文中使用的术语“移植物”(也称移入物)包括上述定义的器官和组织或其部分，它们要以上述任一方式移植。
本专利申请全文中使用的术语“防腐液”包括上述器官和组织或其部分要在其中贮藏(例如在移植前贮藏)的溶液或液体。如前所述，该防腐液还可用于没有后继移植时的防腐，例如用于不同类型的检查和研究。
在一个优选实施方案中，本发明的防腐液除了钙和硝酸甘油之外还含有约5-15、优选约7-12wt％的平均分子量约1000道尔顿的低分子葡聚糖(例如，葡聚糖1)、约3-8wt％的高分子葡聚糖(例如，葡聚糖40、葡聚糖60、葡聚糖70或更高分子，例如葡聚糖120)、约0.1-2.6％葡萄糖、缓冲剂(例如磷酸盐、THAM或碳酸氢盐)、约4-25mM钾、约1-16mM镁、约50-150mM钠和约50-150mM氯化物。5wt％葡聚糖1理论上产生约50毫渗模的渗透性。将其添加到溶液中时，必须降低电解质(例如钠和氯的浓度以防止溶液变得容积渗克分子浓度过多。
在本发明另一优选实施方案中，该防腐液除了钙和硝酸甘油之外还含可商购的Perfadex溶液。该Perfadex溶液含50g/l的平均分子量为40000道尔顿的葡聚糖40、5mM葡萄糖、使磷酸盐含量达0.8mM的磷酸盐缓冲剂、6mM钾、0.8mM镁、138mM钠、142mM氯和0.8mM硫酸盐以及添加的THAM缓冲剂，这样pH达7.4左右。
上述所有含量是以最终防腐液为基准计的。
就在本发明防腐液中的心脏防腐而言，必须把钾含量提高到约16-25、优选20mM，把镁浓度提高到约12-16mM。那么，必须降低钠浓度以使该溶液的渗透性不超过约340毫渗模/升。贮藏其它器官和组织时，以最终防腐液为基准计，钾浓度通常是约4-6mM，镁浓度通常是约1-4mM。
先前已发现该Perfadex溶液(它是上述LPD溶液的一个类型)能起到用于移植前移植物特别是肾的长期防腐液的作用。Perfadex是一种所谓的胞外溶液，即钠和钾浓度大致相同于在血浆中的浓度。其中的磷酸盐缓冲剂和THAM缓冲剂具有巨大的缓冲能力，使溶液pH为7.4。葡萄糖起到代谢作用中的底物的作用，葡聚糖40使溶液具有相当于正常血浆中的胶体渗透压。
所有更大的葡聚糖分子、例如葡聚糖40及以上的葡聚糖，具有一个缺点，即施用时它们可导致过敏反应。仅少量这些分子就足以引起这些致命的反应。因此，为了抵消这种反应，在这些情况中把低分子葡聚糖，例如葡聚糖1(也称为Promiten)施用给患者。通过含低分子葡聚糖的本发明防腐液消除了这类过敏反应的危险。
不过，就保持血管中平滑肌功能和内皮功能而言，Perfadex溶液本身并没有令人满意的性能。
然而，就长期防腐中保持这些功能而言，向Perfadex中添加钙和硝酸甘油可导致该防腐液的性能的显著改善。
在本发明的防腐液中，以最终防腐液为基准计，钙以0.3-1.5mM、优选约0.7mM的浓度存在。制备防腐液期间，钙能以钙的溶液(例如水溶液)形式分开地添加，或者以固态形式(例如盐，优选CaCl2)添加，要求盐中的负电离子不会有害地影响该防腐液的性能。
在本发明的防腐液中，以最终防腐液为基准计，硝酸甘油以10-4-10-7M、优选约10-5-10-6M的浓度存在。制备防腐液期间，硝酸甘油可以溶液形式或固态形式分开地添加。硝酸甘油的一种有用的替代品为称作Nipride的制剂，其活性成分是硝普盐，例如硝普钠(nitroprusside sodium)的形式。硝酸甘油的另一种替代品是罂粟碱。
根据本发明，还可以任选地向该防腐液中添加肝素，以最终防腐液为基准计，肝素浓度为1-12IE/ml、优选10IE/ml。使用肝素的目的是切除器官时万一不可能洗掉所有血液，肝素可以防止在血管移植物内部形成凝血剂。此外，深入的研究已经表明，肝素对内皮功能无毒性。作为对普通肝素的替代品，可以使用一种所谓的低分子肝素，优选是片段化蛋白(Dalteparin)。
此外，可以任选地向本发明防腐液中添加抗生素。有用的抗生素的一个例子是浓度约为120mg/l的苄青霉素。
本发明防腐液中的所有成分以及任选成分可分开地并以任何顺序添加。在一个优选实施方案中，把钙、硝酸甘油和任选的肝素和/或抗生素添加到含有制备该防腐液用的其余成分的混合好的溶液中，例如Perfadex中。
使用时，该防腐液的pH应保持在约7.4-7.6。可以采用能产生所需pH并且不会有害地影响防腐液功能的任何缓冲剂。
通过包含下列成分、具有下列功能，本发明防腐液对其目的来说是理想的
1)包括钙的胞外电解质组分，即没有引起血管痉挛的电解质，2)能保持pH约7.4-7.6的有效缓冲体系，3)必要时，胶体渗透活性物质(例如高分子葡聚糖)，它们使溶液具有相当于血浆中的胶体渗透压，即25mmHg或更高，4)低分子但细胞膜不透性物质(例如5-15％的葡聚糖1)，它使溶液具有50-150毫渗模范围内的渗透性，5)有效舒张血管的物质，例如硝酸甘油、硝普盐或罂粟碱，6)抑制聚凝胶的添加剂(coagel-inhibiting additive)，例如肝素或片段化蛋白(Dalteparin)，7)用于防腐期间代谢作用的葡萄糖，8)任选含有的抗生素，它在长期防腐中没有组织毒性，以及9)贮藏心脏用的增加的钾和镁含量。
与用于器官和/或组织(例如，它们要被移植)的现有技术防腐液相比，本发明防腐液含有两种新的活性成分，这两种成分各自分别地、特别是组合地以惊人的方式在防腐过程中有利地影响器官和/或组织。在本领域中，这两种成分即钙和硝酸甘油的效果以前并不为人所知，使本发明防腐液从全球范围看是一种非常有前景的制品。
本发明防腐液可以盛在适于本领域的任何常规容器中。
本发明还涉及人和动物器官和组织或其部分在本发明防腐液中的防腐方法，其中所述器官和组织或其部分用该防腐液冲洗并浸入其中，并且对短期防腐来说把防腐液温度调节在4-24℃范围内至多约2小时，对长期防腐来说把温度调节在0.5-8℃范围内至多36小时。
已从所涉及的供体切除的人和动物器官、组织或其部分应该，可能的话，被原地冲洗和/或在置于防腐液中后尽快冲洗，以使有害影响(如果有的话)降低到最小程度。
本发明防腐液的最佳贮藏温度完全取决于计划的贮藏时间。在例如血管的短期防腐情况下(即至多2小时)，最佳温度为室温。太低的温度对内皮来说不是最佳的，但一直到4℃都可很好地适用。移植物已固定后，经过大约2小时的体内再灌注，内皮功能已完全恢复。降低到1℃时，内皮功能将被降低并且2小时后不能恢复，但24小时后可恢复。对长期防腐来说，绝对需要低温。已发现0.5-8℃、优选4℃是最有利的。贮藏达36小时时，不同器官具有特定的最佳贮藏温度。
仅在有4亿多居民的欧洲，每年就要进行例如约300000例以上分流手术；在瑞典，每年约7000例。在美国，在所有类型中这类手术是最常见的手术。例如，对法医学研究所中保存同种移植物来说，也应能得到本发明的防腐液。如上所述，同样也有迫切的需要，即在令人满意的防腐液中贮藏血管直到下一个工作日把它们冷冻保存。在外周血管外科中和整形和修复外科中，同样需要这样一种防腐液。
权利要求
1.一种用于人和动物的器官和组织或其部分的防腐液，其特征在于，它含有硝酸甘油和钙。
2.如权利要求1所述的防腐液，其特征在于，它含有以最终防腐液为基准计的约10-4-10-7M硝酸甘油和约0.3-1.5mM钙。
3.如权利要求2所述的防腐液，其特征在于，它含有以最终防腐液为基准计的约0.7mM钙和约10-5-10-6M硝酸甘油。
4.如前述任一项权利要求所述的防腐液，其特征在于，它还任选地含有以最终防腐液为基准计的约1-12IE/ml的肝素和/或约120mg/l的抗生素，优选苄青霉素。
5.如前述任一项权利要求所述的防腐液，其特征在于，钙和硝酸甘油，以及任选的肝素和/或抗生素存在于一种溶液中，该溶液含有以最终防腐液为基准计的约5-15wt％的平均分子量约1000道尔顿的低分子葡聚糖、约3-8wt％的平均分子量为40000-120000道尔顿的高分子葡聚糖、约0.1-2.6％葡萄糖、缓冲剂、约4-25mM钾、约1-16mM镁、约50-150mM钠和约50-150mM氯化物。
6.如权利要求1-5中任一项所述的防腐液，其特征在于，钙和硝酸甘油，以及任选的肝素和/或抗生素存在于一种溶液中，该溶液含有以最终防腐液为基准计的50g/l的分子量为40000道尔顿的葡聚糖40、5mM葡萄糖、0.8mM磷酸盐缓冲剂、6mM钾、0.8mM镁、138mM钠、142mM氯和0.8mM硫酸盐，还添加有0.24ml THAM缓冲剂。
7.如前述任一项权利要求所述的防腐液，其特征在于，要把心脏贮藏在该防腐液中时，以最终防腐液为基准计，钾的浓度为约16-25mM，镁的浓度为约12-16mM。
8.如前述任一项权利要求所述的防腐液，其特征在于，其pH为约7.4-7.6。
9.如前述任一项权利要求所述的防腐液，其特征在于，肝素被低分子肝素、优选片断化蛋白所代替。
10.如前述任一项权利要求所述的防腐液的应用，其特征在于，要移植给人和动物的人和动物器官和组织或其部分用该防腐液冲洗并浸入其中。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，血管或其部分用该防腐液冲洗并浸入其中。
12.如权利要求10所述的应用，其特征在于，大隐静脉或其部分用该防腐液冲洗并浸入其中。
13.如权利要求10所述的应用，其特征在于，肺用该防腐液冲洗并浸入其中。
14.人和动物的器官和组织或其部分的防腐方法，其特征在于，所述器官和组织用权利要求1-9中任一项所述的防腐液冲洗并浸入其中，并且对长期防腐来说在0.5-8℃的温度下贮藏至多36小时，或对短期防腐来说在约4-24℃的温度下贮藏至多2小时。
全文摘要
公开了一种用于人和动物的器官和组织或其部分、含有钙和硝酸甘油的防腐液。另外描述了这种防腐液的应用以及这种防腐液中人和动物器官和组织或其部分的防腐方法。
文档编号A01N1/02GK1207647SQ9619968
公开日1999年2月10日 申请日期1996年12月16日 优先权日1995年12月15日
发明者S·斯特恩 申请人:斯蒂夫特尔森法克特公司