一种玉米粗缩病抗性的规模化接种鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种玉米粗缩病抗性的规模化接种鉴定方法，属于农业科学技术领 域。
【背景技术】
[0002] 玉米是粮食、饲料和工业原料兼用的农作物，我国是世界玉米生产第二大国，常年 种植面积约2000万公顷，年产达750亿吨，栽培面积居全国第一位，产量约占粮食总产量 的1/3,在粮食安全生产中具有重要地位。
[0003] 玉米粗缩病是一种世界性玉米病害，是由玉米粗缩病毒（maizeroughdwarf virus，MRDV)所引起的一种病毒病。玉米粗缩病于1949年首次在意大利种植的美国玉米 材料中发现之后，同年在以色列亦有发现，上世纪60年代玉米粗缩病在欧洲和中东地区发 生大流行，之后传播到南美洲的阿根廷、巴西和乌拉圭，进而传播到北美以及亚洲的日本、 韩国和中国。
[0004] 玉米粗缩病在我国于1954年首次在新疆发现，20世纪70年代在河北省大暴发。 90年代，该病再度大面积发生，除河北省的沧州、衡水、保定、唐山、承德、廊坊再次发生流行 夕卜，山东、北京、天津、陕西以及山西的晋南和辽宁的锦西等地也严重发生，致使玉米生产受 到严重的损失。据不完全统计，1996年全国玉米粗缩病发病面积为233万hm，毁种绝收约4 万hm，仅山东和河北两个省发生面积就达100万hm以上，损失玉米50亿kg，一般病田病株 率达40%，平均减产10%-30%。近几年随着气候环境变化和种植结构的调整，玉米粗缩病发 生面积呈现出明显的上升趋势，北京、天津、河北、辽宁、山西、山东、陕西、江苏、浙江、湖北、 云南等省（市）发病面积逐年扩大。2004年玉米粗缩病再次在江苏暴发，盱眙、盐城、淮安、 连云港等市(县）因该病的发生而造成玉米大幅度减产，经济损失极大，许多农户因此而毁 田改种其他作物。2004-2005年，河北省又出现了重病地和毁种地，重病地病株率达80%以 上。2007-2008年山东省玉米粗缩病又严重发生。玉米粗缩病已成为制约我国玉米生产的 严重病害，给我国的粮食安全带来极大的挑战。
[0005] 玉米粗缩病毒不能通过种子、土壤和接触传染，也不能经嫁接、汁液摩擦等方式进 行机械传毒，只能通过灰飞虱和白背飞虱为介体传毒，但白背飞虱传毒率很低，灰飞虱传毒 率高。在自然界，带毒灰飞虱成虫或若虫在冬小麦、田头地边杂草等场所越冬，翌年2-3月 若虫羽化为成虫迀入麦田传毒或吸毒，5-6月陆续迀至附近的春、夏播玉米田传毒为害，造 成玉米粗缩病发生。灰飞虱侵染农作物和杂草形成了周年侵染循环。5月中旬-6月初平均 气温2 0-2 5°C，适于灰飞虱活动，田间灰飞虱种群数量达到高峰，此期间播种的玉米发病 率也最高。8月以后，灰飞虱为害秋播小麦或田边杂草，玉米粗缩病毒在灰飞虱体内可增殖 和越冬，但不能经卵传给下一代。被带毒灰飞虱为害的秋播小麦或田边杂草以及带毒越冬 的灰飞虱成虫和若虫是该病毒翌年有效的毒源。
[0006]目前，对玉米粗缩病的防治主要是使用农药防治传毒介体灰飞虱，但由于介体昆 虫种群数量大导致防治效果不佳，且存在环境污染。培育抗病品种是防治各类病害最为经 济、有效的手段。筛选、发掘和创新抗病种质是开展抗病育种的前提和基础，而抗性基因定 位和克隆，则为利用标记辅助选择等分子育种手段、加快和高效培育抗病品种提供了全新 和有利工具。但迄今玉米粗缩病抗性QTL检测和遗传效应分析还处于起步阶段，在生产上 也没有发现对玉米粗缩病免疫的品种，所以对玉米粗缩病抗性种质进行大规模筛选和展开 玉米粗缩病抗性遗传特性研宄显得尤为迫切。
[0007] 筛选抗病资源应用于抗病育种生产是最为直接有效的方法，目前玉米育种上筛选 抗病品种、抗病基因定位鉴定抗性家系均采用田间自然发病鉴定，即将各鉴定品种或品系 以小区形式种植于大田，每个小区几十株左右，大田常规栽培管理，传毒介体灰飞虱自然传 毒，待玉米显现病症后调查各鉴定品种(家系）小区的株发病率，以此为标准鉴别玉米品种 (家系)抗感能力的差异。然而，由于植物对天敌的抗性分为耐害性、抗生性和排趋性三种类 另IJ，各种抗性类别具由不同的抗性机理。不同玉米品种(家系）对灰飞虱排趋性的差异使得 不同玉米品种(家系）的某些形态和生理等特性，表现出对灰飞虱的取食偏向的差异。而玉 米粗缩病的传毒介体正为灰飞虱，因此，通过自然鉴定方法鉴定得到的抗病玉米，可能实际 上是抗虫(排趋性强）玉米而并非抗病玉米。然而，假若以该抗虫不抗病玉米育成品种进行 病害区规模种植后，规模种植导致传毒介体被迫选择而使得玉米对灰飞虱排趋产生的假抗 病表现消失，将可能给玉米生产带来较大的损失。
[0008] 为排除排趋性对抗病鉴定的影响，对玉米进行人工定量接种带毒介体成为一种必 然。然而，进行玉米品种资源的抗性鉴定需要大量的传毒介体灰飞虱，灰飞虱人工饲养规模 量小，饲养成本很高，难以满足品种抗性鉴定的规模量的需求，限制了人工定量接种鉴定的 推广应用。
[0009] 灰飞虱重灾区大田生态系统内每年的灰飞虱数量均非常巨大，人工获取也比较容 易，而实验室饲养灰飞虱用于品种资源抗性鉴定难以满足规模量的要求，若能够设计一种 方法利用大田生态系统规模量的灰飞虱进行定量强化玉米接种鉴定从而实现对玉米品种 资源的准确评价将是一种可行的选择。
[0010] 在大田，昆虫与寄生作物在很长的历史时期就生活在一起，双方相互作用、彼此影 响，相互调节制约，玉米粗缩病等昆虫传毒介体病的大发生，正体现了作物和昆虫之间长期 互作关系，而昆虫与作物间的相互影响又受自然环境、生态环境的多变性制约，为实现对玉 米品种资源的准确评价，需要实验室提供作物昆虫互作研宄的稳定而适宜的生态环境。通 过模拟大田生态系统内灰飞虱与玉米的互作关系、利用大田生态系统解决规模灰飞虱的 获取难题、定量并强化玉米粗缩病接种鉴定从而实现对玉米品种资源的准确评价正是解 决上述技术问题的根本思路。现有技术公开的一种作物昆虫共育箱（ZL2012100557849) 建立了作物昆虫互作研宄的稳定的生态环境、一种大田来源灰飞虱成虫的纯化筛选装置 (201310290925.X)实现了特定体径灰飞虱成虫的捕获和纯化筛选，即作物昆虫共育箱和纯 化筛选装置的研制为实现玉米粗缩病的接种鉴定提供了可能。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是针对玉米粗缩病田间自然鉴定中存在的排趋性干扰难题和室内 人工接种鉴定的灰飞虱规模量获取难题，提供一种玉米粗缩病抗性的规模化接种鉴定方 法，该鉴定方法既可以去除排趋性对鉴定结果的干扰，又解决了品种抗性鉴定所需灰飞虱 规模量的难题，实现了定量而强化的玉米粗缩病接种鉴定，最终实现了对玉米粗缩病抗性 的准确评价。
[0012] 本发明的目的是通过以下技术方案解决的： 一种玉米粗缩病抗性的规模化接种鉴定方法，其特征在于：所述的接种鉴定方法步骤 如下： (a) 、采用盘托法从田间采集灰飞虱后通过纯化筛选装置获取大量5龄灰飞虱若虫； (b) 、将筛选获得的5龄灰飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内培育的水稻上共育并繁 育下一代灰飞虱若虫，并进一步利用调整的纯化筛选装置分离获取大量整齐一致的2龄灰 飞虱若虫； (c) 、将筛选获得的2龄灰飞虱若虫移入栽有水稻黑条矮缩病重灾区取材的分蘖盛期 水稻病株上进行饲毒，2龄灰飞虱若虫饲毒后计重获得单头2龄灰飞虱若虫的重量； (d) 、通过精密电子天平称重获得单头2龄灰飞虱若虫的重量，根据确定的虫/株比例 计算所需灰飞虱总重，进而称重定量； (e) 、根据确定的虫/株比例将饲毒后的定量2龄灰飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内 栽培的待测玉米品种幼苗上共育传毒； (f) 、待灰飞虱半数死亡后将待测玉米移栽至大田隔虫网室，常规栽培管理，玉米扬花 期按0至4级分级标准调查粗缩病发病情况，并根据粗缩病发病情况能够准确鉴定出待测 玉米品种的抗病能力。
[0013] 所述步骤（a)中的灰飞虱收集时间为每年五月下旬-六月上旬期小麦田由青转黄 期。
[0014] 所述步骤（a)中的纯化筛选装置使用时，采用孔径为24目和28目的分样筛组合 以有效分离出5龄灰飞虱若虫和部分灰飞虱成虫；然后将筛选分离出的灰飞虱倒入内壁光 滑的深桶内，拍击桶外壁使得灰飞虱成虫飞离而若虫滞留，即可获得大量整齐一致的5龄 灰飞虱若虫。
[0015] 所述步骤（b)中的5龄灰飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内培育的水稻上时，与5 龄灰飞虱若虫共育的水稻为2-3叶期。
[0016] 所述步骤（b)中的作物昆虫共育箱的培养温度控制在25°C、光14h/暗10h。
[0017] 所述步骤（b)中的作物昆虫共育箱内繁育下一代灰飞虱若虫后，此时筛选装置翻 转90°将垂直的趋光方向改变为水平方向，采用孔径为32目和35目的分样筛组合以有效 分离获得大量整齐一致的2龄灰飞虱若虫。
[0018] 所述步骤（c)中的分蘖盛期水稻病株为上一年自水稻黑条矮缩病重灾区取材后 于-20°C的冰箱冷藏的，待病株自然解冻后将根用浸水脱脂棉包裹并用塑料布包扎结实模 拟大田移栽方式垂直固定于作物昆虫共育箱内，然后移入2龄灰飞虱若虫饲毒不低于48h。
[0019] 所述步骤（c)中的2龄灰飞虱若虫饲毒后趋光分离毛刷刷离灰飞虱若虫时夹杂的 杂质和死虫，然后转移部分灰飞虱若虫进称量瓶，通过精密电子天平称重，去皮计算瓶内灰 飞虱若虫的总重后根据瓶内灰飞虱若虫的数量，计算得到单头灰飞虱若虫的重量，以根据 待测玉米株数和接种强度确定饲毒灰飞虱若虫数目，进而计算接种所需饲毒灰飞虱若虫重 量并称重定量。
[0020] 所述步骤（d)中的待测玉米生长处于2-3叶期，且待测水稻按照30cm2/株的比例 留取长势健康均匀的玉米苗。
[0021] 所述步骤（d)中的待测玉米按照10-25虫/株的比例接种饲毒后的2龄灰飞虱若 虫，作物昆虫共育箱的培养温度控制在20°C、光14h/暗IOh共育传毒至接种的灰飞虱自然 衰老死亡。
[0022] 本发明相比现有技术有如下优点： 本发明通过纯化筛选装置获得大量的大田来源的5龄灰飞虱若虫，进而通过作物昆虫 共育箱共育出大量的2龄灰飞虱若虫，并再次通过纯化筛选装置获得大量整齐一致的2龄 灰飞虱若虫，然后通过2