龄灰飞虱若虫共育饲毒、待测玉米定量共育接种传毒的方式使得 待测玉米发病，最后通过调查粗缩病发病情况即可准确鉴定出待测玉米品种的抗病能力。
[0023] 本发明的强化接种鉴定方法既可以去除排趋性对鉴定结果的干扰，又可以克服品 种抗性鉴定所需灰飞虱规模量的难题，并且实现了定量而强化的玉米粗缩病接种鉴定，能 够准确地评价玉米品种对玉米粗缩病的抗性水平；该鉴定方法除了可以应用于玉米品种资 源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育外，亦可以应用于抗病基因定位的表型鉴定和 抗性遗传规律研宄等众多领域，故适宜推广使用。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0025]-种玉米粗缩病抗性的规模化接种鉴定方法，该接种鉴定方法步骤如下：（a)、大 田灰飞虱的获取和分离纯化：在每年五月下旬-六月上旬期小麦田由青转黄期，盘托法调 查灰飞虱5龄虫占多数时，采用盘托法从田间采集灰飞虱(其中含有大量杂质和杂虫)，然后 利用纯化筛选装置进行分离筛选，为主要获取5龄灰飞虱若虫，纯化筛选装置的分样筛采 用孔径为24目和28目的分样筛组合，因为筛取调查发现，24-28目的分样筛组合可有效的 屏蔽掉灰飞虱死虫、杂质和无(弱）趋光性昆虫、大体型趋光性昆虫、小体型趋光性昆虫和灰 飞虱幼龄若虫的干扰，有效分离出5龄若虫和部分灰飞虱成虫，将分离出的灰飞虱置入内 壁光滑的深桶内，拍击桶外壁使得灰飞虱成虫飞离而若虫滞留，最终获得大量整齐一致的5 龄灰飞虱若虫；（b)、2龄灰飞虱若虫的培育和分离筛选：将筛选获得的5龄灰飞虱若虫接 种到作物昆虫共育箱内培育的2-3叶期水稻上共育并繁育下一代灰飞虱若虫，作物昆虫共 育箱的培养温度控制在25°C、光14h/暗8h，共育两周左右可观察到大量灰飞虱若虫出现， 待多数若虫生长到2龄期，用柔软的毛刷将聚集在水稻叶和茎杆上的大量灰飞虱若虫分离 进塑料盒内；为筛选整齐一致的2龄灰飞虱若虫，筛选装置参照成虫筛选装置进行调整，同 样利用若虫的趋光性进行分选，分样筛组合选择32-35目，且由于若虫运动能力较弱，此时 筛选装置翻转90°设置将垂直的趋光方向改变为水平方向，将若虫置于黑暗一端，若虫趋 光水平爬动，采用32-35目的分样筛组合能够分离获得大量整齐一致的2龄灰飞虱若虫； (c)、灰飞虱若虫饲毒：将上一年在-20°C的冰箱中冷藏的水稻黑条矮缩病重灾区取材的分 蘖盛期水稻病株自然解冻，将病株根用浸水脱脂棉包裹并用塑料布包扎结实模拟大田移栽 方式垂直固定于作物昆虫共育箱(仅通风光照，不播种、不通水）内，然后移入2龄灰飞虱若 虫饲毒不低于48h，使得2龄灰飞虱若虫带毒；（d)计量灰飞虱若虫：用柔软的毛刷将饲毒 后的2龄灰飞虱若虫分离进塑料盒，不设分样筛，趋光分离毛刷刷离2龄灰飞虱若虫时夹杂 的杂质和死虫，转移部分2龄灰飞虱若虫进称量瓶，精密电子天平称重，去皮计算瓶内2龄 灰飞虱若虫的总重后根据瓶内灰飞虱若虫的数量，计算得到单头2龄灰飞虱若虫的重量， 以根据待测玉米株数和接种强度确定灰飞虱数目，进而计算接种所需灰飞虱重量并称重定 量；（e)、待测玉米与带毒2龄灰飞虱若虫定量共育传毒：当步骤（b)中的作物昆虫共育箱 内灰飞虱若虫大量出现(多一龄幼虫）时，将待测玉米品种播种在作物昆虫共育箱内培养， 每箱播种一个待测玉米品种(家系)，完成步骤（c)后待测玉米幼苗的生长会处于2-3叶期， 按照30cm2/株的比例淘汰弱苗和不均匀的苗以留取长势健康均匀的玉米幼苗，按照10-25 虫/株的比例将饲毒后的定量2龄灰飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内栽培的待测玉米品 种幼苗上共育传毒，作物昆虫共育箱的培养温度控制在20°C、光14h/暗10h，共育传毒至接 种的灰飞虱自然衰老死亡；（f)、待测玉米大田显症统计：待灰飞虱半数死亡后将待测玉米 移栽至大田隔虫网室，常规栽培管理，玉米扬花期按0至4级分级标准调查粗缩病发病情况 (苗洪芹，田兰芝，路银贵，等.简便易行的玉米粗缩病严重度分级标准[J].植物保护，2005， 31 (6) :87-89.)，根据病情指数划分玉米品种的抗粗缩病级别：抗性为免疫、高抗、抗病、感 病、高感的病指分别为0、0-10、10-30、30-50、>50，并根据粗缩病发病情况能够准确鉴定出 待测玉米品种的抗病能力。
[0026] 实施例一 按照本发明提供的鉴定方法采用重灾区取材的冷冻水稻病株作为毒源，接种大田来源 的灰飞虱繁育后一代若虫，饲毒48h后将2龄灰飞虱若虫移入育有不同玉米品种幼苗(先玉 335、农大108、登海3622、金海5号和郑单958)的作物昆虫共育箱内进行接种，接种强度为 7头/株，饲育15天后分别将玉米幼苗播种于防虫网室；同期采用1-2龄无毒灰飞虱若虫 (来源于江苏省农业科学院周彤实验室）作为对比例，饲毒2天后将虫移入育有不同玉米品 种幼苗(先玉335、农大108、登海3622、金海5号和郑单958)的作物昆虫共育箱内进行接 种，接种强度为10虫/株，饲育15天后分别将玉米幼苗播种于防虫网室。上述实施例和对 比例培育的玉米扬花期时调查粗缩病发病情况所得数据如表1所示。
[0027] 表1无毒灰飞虱传毒发病率和大田来源灰飞虱繁育一代若虫传毒发病率比较表
【主权项】
1. 一种玉米粗缩病抗性的规模化接种鉴定方法，其特征在于：所述的接种鉴定方法步 骤如下： (a) 、采用盘托法从田间采集灰飞虱后通过纯化筛选装置获取大量5龄灰飞虱若虫； (b) 、将筛选获得的5龄灰飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内培育的水稻上共育并繁 育下一代灰飞虱若虫，并进一步利用调整的纯化筛选装置分离获取大量整齐一致的2龄灰 飞虱若虫； (c) 、将筛选获得的2龄灰飞虱若虫移入栽有水稻黑条矮缩病重灾区取材的分蘖盛期 水稻病株上进行饲毒，2龄灰飞虱若虫饲毒后计重获得单头2龄灰飞虱若虫的重量； (d) 、通过精密电子天平称重获得单头2龄灰飞虱若虫的重量，根据确定的虫/株比例 计算所需灰飞虱总重，进而称重定量； (e) 、根据确定的虫/株比例将饲毒后的定量2龄灰飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内 栽培的待测玉米品种幼苗上共育传毒； (f) 、待灰飞虱半数死亡后将待测玉米移栽至大田隔虫网室，常规栽培管理，玉米扬花 期按O至4级分级标准调查粗缩病发病情况，并根据粗缩病发病情况能够准确鉴定出待测 玉米品种的抗病能力。
2. 根据权利要求1所述的玉米粗缩病抗性的规模化接种鉴定方法，其特征在于：所述 步骤（a)中的灰飞虱收集时间为每年五月下旬-六月上旬期小麦田由青转黄期。
3. 根据权利要求1所述的玉米粗缩病抗性的规模化接种鉴定方法，其特征在于：所述 步骤（a)中的纯化筛选装置使用时，采用孔径为24目和28目的分样筛组合以有效分离出5 龄灰飞虱若虫和部分灰飞虱成虫；然后将筛选分离出的灰飞虱倒入内壁光滑的深桶内，拍 击桶外壁使得灰飞虱成虫飞离而若虫滞留，即可获得大量整齐一致的5龄灰飞虱若虫。
4. 根据权利要求1所述的玉米粗缩病抗性的规模化接种鉴定方法，其特征在于：所述 步骤（b)中的5龄灰飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内培育的水稻上时，与5龄灰飞虱若 虫共育的水稻为2-3叶期。
5. 根据权利要求1或4所述的玉米粗缩病抗性的规模化接种鉴定方法，其特征在于： 所述步骤（b)中的作物昆虫共育箱的培养温度控制在25°C、光14h/暗10h。
6. 根据权利要求1所述的玉米粗缩病抗性的规模化接种鉴定方法，其特征在于：所述 步骤（b)中的作物昆虫共育箱内繁育下一代灰飞虱若虫后，此时筛选装置翻转90°将垂直 的趋光方向改变为水平方向，采用孔径为32目和35目的分样筛组合以有效分离获得大量 整齐一致的2龄灰飞虱若虫。
7. 根据权利要求1所述的玉米粗缩病抗性的规模化接种鉴定方法，其特征在于：所述 步骤（c)中的分蘖盛期水稻病株为上一年自水稻黑条矮缩病重灾区取材后于-20°C的冰箱 冷藏的，待病株自然解冻后将根用浸水脱脂棉包裹并用塑料布包扎结实模拟大田移栽方式 垂直固定于作物昆虫共育箱内，然后移入2龄灰飞虱若虫饲毒48h。
8. 根据权利要求1所述的玉米粗缩病抗性的规模化接种鉴定方法，其特征在于：所述 步骤（d)中的2龄灰飞虱若虫饲毒后趋光分离毛刷刷离灰飞虱若虫时夹杂的杂质和死虫， 然后转移部分灰飞虱若虫进称量瓶，通过精密电子天平称重，去皮计算瓶内灰飞虱若虫的 总重后根据瓶内灰飞虱若虫的数量，计算得到单头灰飞虱若虫的重量，以根据待测玉米株 数和接种强度确定饲毒灰飞虱若虫数目，进而计算接种所需饲毒灰飞虱若虫重量并称重定 量。
9. 根据权利要求1或8所述的玉米粗缩病抗性的规模化接种鉴定方法，其特征在于： 所述步骤（e)中的待测玉米生长处于2-3叶期，且待测水稻按照30cm 2/株的比例留取长势 健康均匀的玉米苗。
10. 根据权利要求9所述的玉米粗缩病抗性的规模化接种鉴定方法，其特征在于：所述 步骤（e)中的待测玉米按照10-25虫/株的比例接种饲毒后的2龄灰飞虱若虫，作物昆虫 共育箱的培养温度控制在20°C、光14h/暗IOh共育传毒至接种的灰飞虱自然衰老死亡。
【专利摘要】本发明公开了一种玉米粗缩病抗性的规模化接种鉴定方法，该接种鉴定方法步骤如下：（a）、获取大田灰飞虱并分离纯化出大量整齐一致的5龄灰飞虱若虫；（b）、繁育并分离筛选出大量整齐一致的2龄灰飞虱若虫；（c）、对获取的2龄灰飞虱若虫饲毒；（d）、计量灰飞虱若虫；（e）、将待测玉米品种与带毒2龄灰飞虱若虫定量共育传毒；（f）、待测玉米品种大田显症统计：将待测玉米移栽至大田隔虫网室，玉米扬花期调查粗缩病发病情况，即可准确鉴定出待测玉米品种的抗病能力。本发明的强化接种鉴定方法克服了排趋性的干扰和灰飞虱规模量的难题，实现了定量而强化的水稻黑条矮缩病接种鉴定，能够准确地评价水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性水平。
【IPC分类】A01K67-033, A01G7-00
【公开号】CN104584890
【申请号】CN201510000764
【发明人】乔保建, 夏多才, 贺长刚, 王云, 苏浩
【申请人】甘肃恒基种业有限责任公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月4日